이 프로토콜의 전반적인 목표는 밀도 구배 원심분리 없이 부분 간절제술 후 마우스에서 간세포 분리를 위한 최적화된 방법을 제시하는 것입니다. 우리는 일반적으로 초기 재생 동안 많은 비율의 지질이 함유된 간세포를 봅니다. 저밀도로 인해 밀도 구배 원심분리 시 일반적으로 손실되는 지방성 간세포는 이 프로토콜로 유지됩니다.
관류 장비를 준비하려면 Luer 잠금 커넥터를 사용하여 26게이지 IUI 캐뉼라를 튜브의 출구 끝에 연결합니다. 그런 다음 튜브를 세척하고 튜브의 입구 끝을 수조의 예열된 관류 버퍼 튜브에 삽입합니다. 분당 3밀리리터의 펌프 속도로 따뜻한 관류 완충액으로 프라이밍합니다.
수술을 진행하기 전에 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 그런 다음 수술 용 스크럽 용액과 70 % 에탄올로 복부를 청소하십시오. 그런 다음 봉합사를 절단하여 이전에 부분 간 절제술을 위해 만든 정중선 절개를 다시 열고 상처 가장자리를 부드럽게 잡아당깁니다.
간 절제술이 24 시간에서 48 시간 이상 된 경우 봉합사를 제거하고 가위 또는 메스로 피부를 자릅니다. 견인기 또는 간단한 클립을 사용하여 복부를 열어 두십시오. 복강은 접근과 시각화를 최적화하기 위해 가능한 한 많이 노출되어야 합니다.
5-0 폴리 프로필렌 봉합사를 흉골에 고정시킵니다. 두개골로 당겨서이 위치에 고정하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 장을 오른쪽으로 움직여 문맥과 대정맥을 드러냅니다.
젖은 천을 사용하여 내장을 유지하십시오. 금속 추 링과 같이 높이가 약 2cm인 무거운 물체를 마우스의 뒷다리 옆에 놓습니다. 그런 다음 연결된 26게이지 IUI 캐뉼라가 있는 튜브를 물체에 놓고 바늘을 대정맥 위에 조심스럽게 놓습니다.
필요에 따라 튜브의 길이를 조정하십시오. 콜라게나제 원액을 예열된 소화 완충액 튜브에 옮깁니다. 동물 당 10-20 밀리리터의 소화 완충액을 준비하십시오.
펌프 속도를 분당 3 밀리리터로 조정 한 후 펌프를 켭니다. 완충액이 바늘에 도달하면 미리 예열된 관류 완충액의 처음 2-3밀리리터를 버립니다. 하대정맥의 캐뉼라 삽입을 수행하려면 멸균 면봉을 사용하여 대정맥을 펑크 아래로 꼬리 방향으로 부드럽게 당겨 제공된 장력이 캐뉼라가 정맥에 쉽게 삽입되도록 합니다.
완충액이 바늘을 통과하는 동안 26게이지 IUI 캐뉼라를 신장 아래의 하대정맥에 얕은 각도로 삽입합니다. 바늘 경사가 위쪽을 향하도록 하십시오. 바늘이 내강에 들어갈 때 카테터의 플래시 챔버에서 혈액을 찾으십시오.
카테터의 끝이 정맥에 들어가도록 바늘을 2-3mm 더 전진시킵니다. 플라스틱 카테터를 바늘 위로 밀어 넣고 대정맥으로 5mm 더 밀어 넣습니다. 바늘을 천천히 그리고 아주 조심스럽게 제거하십시오.
2-3 초 후, 간에서 흰 반점이 형성되거나 문맥이 부어 오르는 것을 발견하는데, 이는 관류 완충액이 간을 통해 흐르고 중심 정맥에서 간 소엽으로 들어가고 있음을 나타냅니다. 간 표면에 흰 반점이 생긴 후 1-2초 이내에 문맥이 눈에 띄게 부풀어 오를 때까지 기다리십시오. 간문에서 가능한 한 멀리 가위로 문맥을 자릅니다.
동물의 체중, 간 크기 및 초기 간 절제술의 정도에 따라 분당 4-7 밀리리터의 유속을 증가시킵니다. 핀셋이나 혈관 클램프로 문맥을 7-10 초 동안 고정하십시오. 액체가 통과하지 않는지 확인하십시오.
약 30 초 후에 두 번째 클램프를 수행하고 간이 부풀어 오르고 이완되도록하십시오. 3-4 분 동안 동물을 계속 씻어 내고 문맥에서 흘러 나오는 맑은 완충액을 관찰하십시오. 소화 완충액이 간에 도달하기 전에 3-4초 동안 문맥을 조입니다.
cl을 놓을 때 간이 이완되는지 확인하십시오.amp 관류액이 깨끗하게 유지되는지 확인하십시오. 소화 완충액이 간에 도달하면 문맥을 다시 한 번 고정합니다. 간은 클램핑이 풀린 후에 이완되어서는 안됩니다.
분당 5 밀리리터의 유속으로 약 4 분 동안 소화합니다. 소화가 진행됨에 따라 간이 부풀어 오르기 시작하는 징후와 간 표면의 작은 투명 부분을 찾으십시오. 간이 젖은 천 조각의 질감을 띠고 거의 눅눅해 보이는 것을 관찰하십시오.
젖은 멸균 면봉으로 조심스럽게 만져 일관성을 조사하십시오. 간 표면 질감의 현저한 차이가 관찰 될 때까지 관류를 계속하십시오. 간은 매우 밝은 색과 거품이 많은 모양을 취하여 실질에서 분리되는 Glisson 캡슐을 나타냅니다.
간이 이러한 특성을 획득하자마자 소화를 중단하십시오. 공기가 간으로 들어가기 전에 바늘을 제거하십시오. 집게를 사용하여 엽 사이의 중앙 결합 조직을 잡고 앵커 포인트로 사용하여 약간 위로 들어 올립니다.
간과 다른 장기의 모든 연결을 자르고 담낭을 제거하십시오. 복강에서 간을 부드럽게 제거하십시오. 이 단계에서는 헐렁하고 깨지기 쉬우므로 주의하십시오.
간을 얼음 냉장 완충액에 넣습니다. 간을 10cm 페트리 접시에 옮기고 간 표면을 따라 몇 군데에 미세한 팁 핀셋으로 Glisson의 캡슐을 얼음처럼 차가운 Williams'Medium E.Rupture 10ml를 추가합니다. 두 쌍의 핀셋으로 중앙 부분을 잡습니다.
간세포를 손상시키지 않고 캡슐이 찢어지도록 천천히 떼어내고 캡슐을 부드럽게 흔들어 세포를 방출합니다. 5 밀리리터의 간 펄프를 100 마이크로 미터 셀 스트레이너를 통해 50 밀리리터 튜브로 여과합니다. 10 밀리리터의 신선한 얼음 차가운 매체로 필터를 헹구고 나머지 5 밀리리터의 펄프를 셀 스트레이너를 통해 걸러냅니다.
추출물을 섭씨 4도에서 5분 동안 50G으로 돌립니다. 대부분의 상층액을 흡인하고 튜브를 부드럽게 소용돌이 치면서 세포를 재현 탁시키기 위해 1 밀리리터를 남겨 둡니다. 차가운 Williams'E Medium 40 밀리리터를 넣고 단계를 세 번 반복하십시오.
텍스트 원고에 설명 된대로 간세포의 분리를 진행하십시오. 마우스에서 70 % 간 절제술 후, 최종 간세포 수율은 약 10-15 x 10-6 %였으며 최종 생존율은 78 %였습니다. 연장 된 86 % 간 절제술 후, 간세포 수율은 65 %의 평균 생존율로 4-9 x 10에서 6 번째였다.
부분 간 절제술 후, 간세포는 증가된 지질 함량에 상응하는 정상 간에 비해 증가된 세포 크기를 나타낸다. 부분 간절제술 후 24시간 후에 쥐 간세포에서 증가된 지질 함량이 관찰되었는데, 이는 세분성의 증가로 보이거나 확대된 간세포 내부의 지질 소포의 존재에 의해 직접 관찰되었습니다. 고전적인 밀도 구배 정제 방법을 사용하는 동안 큰 지방 간세포는 상청액에서 손실되고 더 작은 희박한 간세포만 세포 펠릿에 수집됩니다.
개선된 프로토콜로 지질로 채워진 간세포는 손실되지 않았고 모든 간세포는 펠릿화되었습니다. 반복적인 클램핑은 세척 과정을 용이하게 합니다. 이를 통해 간은 소화 효소를 억제할 수 있는 남아 있는 혈액 성분으로부터 최적으로 제거됩니다.
