패치 클램프 실험에 사용하기 위한 심방 근세포 를 분리하는 것은 세포 및 분자 수준 모두에서 심방 전기 생리학을 크게 발전시켰습니다. 우리가 사용하는 접근 법은 효과적으로 실험 모형 및 조건의 넓은 범위에서 세포 심방 전기 생리학 및 부정맥을 조사하기 위하여 이용될 수 있는 고립된 심방 근구의 큰 수를 산출합니다. 심방 근세포 를 분리하기 위한 트렁크 소화 접근법을 채택했습니다.
이 접근법의 장점은 연구원이 조사하고자하는 특정 영역을 선택할 수 있다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 장비 및 솔루션의 준비로 이 절차를 시작합니다. 해부판, 해부 도구, 파스퇴르 파이펫, 그리고 불을 연마한 파이펫을 배치합니다.
이 프로토콜은 수컷 또는 여성 야생형 마우스, 유전돌연변이를 운반하는 마우스, 및 질병의 마우스 모델에서 수행될 수 있다. 텍스트 프로토콜에 설명된 마우스 안락사에 따라 마우스를 종이 타월이나 코르크 보드에 놓고 발을 테이프로 테이프로 붙이면 마우스를 제자리에 고정시하십시오. 70%에탄올로 마우스 가슴을 적시다.
구부러진 가위를 사용하여 가슴을 덮는 모피와 피부를 제거합니다. 다음으로 쥐 치아 집게를 사용하여 흉골을 들어 올린 다음 갈비뼈 가장자리를 따라 다이어프램을 자른다. 구부러진 가위를 사용하여 전체 흉곽을 제거하여 심장을 노출시합니다.
심방 부속기를 제거하려면 미세 해부 포셉을 사용하여 부속기를 부드럽게 들어 올리고 스프링 가위로 잘라냅니다. 심방 부속기를 따뜻하게 변형된 Tyrode의 pH 7.4 용액 20밀리리터가 들어 있는 실리콘 코팅 해부 접시로 즉시 전송합니다. 해부핀 1개를 맨 위에 놓고 심방 부속서의 개구부에 핀 1개를 놓습니다.
파스퇴르 파이펫을 사용하여, 혈액을 제거하기 위해 따뜻하게 수정 된 Tyrode의 pH 7.4 용액으로 아리아를 플러시합니다. 상하 가장자리를 따라 절단하여 심방 부속서를 엽니다. 다음으로 심방 부속물의 모서리를 고정하여 평평한 직사각형 조직을 만듭니다.
스프링 가위와 미세 한 집게를 사용하여 약 8 ~ 10 동등한 크기의 스트립으로 심방 부속기를 잘라. 스트립은 조직의 주요 부분에서 무료로 절단되면 계약합니다. 작은 보어 화재 연마 파이펫을 사용하여, 온워 수정 된 Tyrode의 pH 6.9 용액을 포함하는 첫 번째 튜브로 조직 스트립을 전송합니다.
5분 간 기다립니다. 지금, 배지 보어 화재 연마 파이펫을 사용하여 티로드의 pH 6.9 용액을 포함하는 2라운드 바닥 튜브로 티슈 스트립을 전송한다. 티슈 스트립을 세척하려면 5 밀리리터 둥근 바닥 튜브를 캡하고 튜브를 세 번 부드럽게 반전시면 됩니다.
조직 스트립이 중간 보어 화재 연마 파이펫을 사용하여 제 3 튜브로 조직 스트립을 전송하기 전에 튜브의 바닥에 정착하게하십시오. 반전으로 스트립을 다시 씻으십시오. 그런 다음, 중간 보어 화재 연마 파이펫을 사용하여 효소 용액으로 조직 스트립을 전송하고 30 분 동안 배양한다.
3~5분마다 튜브를 소용돌이어 조직 스트립이 함께 고수하는 것을 방지합니다. 효소 소화의 시작 부분에서, 조직 스트립은 소용돌이 다음 신속하게 정착. 약 20분간의 소화에서, 조직 스트립은 소용돌이에 따라 효소 용액에 떠 다니기 시작합니다.
이 시간 동안, 심방 조직 스트립은 또한 소화로 창백한 분홍색에서 흰색으로 외관에 변경됩니다. 효소 소화 후, 준비된 5밀리리터 라운드 바닥 튜브에서 KB 용액2.5 밀리리터를 사용하여 세 개의 세 가지 세가지 세가지 를 수행합니다. 각 세척에 대해, 튜브를 세 번 부드럽게 반전한 후 중간 체어 불 연마 파이펫을 사용하여 조직을 다음 튜브로 이동합니다.
마지막 세척후, 스트립을 KB 용액 2.5밀리리터가 들어있는 14밀리리터 라운드 바닥 튜브로 옮겨 넣습니다. 5분 간 기다립니다. 넓은 보어 파이어 폴리싱 파이펫을 사용하여 7.5 분 동안 조직을 부드럽게 세리세이트합니다.
이것은 조직 스트립을 기계적으로 해리시키고 개별 심방 근세포로 채워진 흐린 용액을 산출합니다. 트리튜션의 첫 번째는 세포에 손상없이 많은 수의 세포를 산출하기 위해 조정되어야합니다. 마우스의 나이 및 질병 상태와 같은 요인을 고려하십시오.
넓은 보어 화재 광택 파이펫에서 조직 스트립을 추방의 주파수와 속도를 모두 변경하여 개별 격리에 트리튜트의 힘을 조정합니다. 부드러운 트리튜레이션은 낮은 세포 수율을 초래하며, 가혹한 트리튜레이션은 많은 죽은 세포를 낳습니다. 실험용 세포의 원하는 밀도에 따라 7~10밀리리터의 최종 부피에 KB 용액을 함유한 14밀리리터 원형 바닥 튜브를 채우십시오.
이 튜브를 실온에 1시간 동안 놓습니다. 이 잠복기 에 이어, 세포는 최대 7 시간 동안 다양한 실험에 사용할 수 있습니다. 여기에 일반 마우스에서 격리 된 심방 근세포의 예가 표시됩니다.
격리된 심방 심근세포는 전형적으로 길이 100미크론의 순서와 10미크론의 폭에 명확한 줄무늬가 있습니다. 격리된 심방 근세포의 정전 용량은 일반적으로 40~70개의 피코파라드입니다. 현재 클램프 모드에서 천포화 패치 클램프 기술을 사용하여 기록된 심방 근세포 작용 잠재력의 예가 도시된다.
나트륨 전류의 대표적인 제품군은 패치 클램프 기술의 전체 세포 구성에 기록되었다. 이러한 전류는 음수 100과 음수 120 밀리볼트의 보유 잠재력에서 음수 100과 양수 10 밀리볼트 사이의 50밀리초 전압 클램프 단계를 사용하여 기록되었습니다. 요약 나트륨 전류 전압 관계는 여기에 제시됩니다.
칼슘 전류의 대표적인 제품군은 음수 70 밀리볼트의 보유 잠재력에서 음수 60과 양수 80 밀리볼트 사이의 250 밀리초 전압 클램프 단계를 사용하여 기록되었습니다. 요약 칼슘 전류 전압 관계는 여기에 표시됩니다. 칼륨 전류의 대표적인 제품군은 음수 120 밀리볼트와 양수 80 밀리볼트 사이의 500 밀리초 전압 클램프 단계를 사용하여 음수 80 밀리볼트의 보유 잠재력에서 기록되었습니다.
여기서 요약 전류 전압 관계는 총 칼륨 전류에 대해 표시됩니다. 성공적인 심방 심근 세포 절연은 적절한 효소 소화뿐만 아니라 삼각 중에 세포의 기계적 해리에 달려 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 일단 고립되면, 심방 심근세포는 나트륨 전류, 칼슘 전류 및 칼륨 전류와 같은 작용 잠재적인 형태및 이온 전류의 측정을 위한 패치 클램프 실험에 사용될 수 있습니다.
심방 근세포 전기 생리학의 변화를 조사하는 것은 심방 부정맥을 위협하는 삶의 세포 및 분자 기초를 결정하고 심방 부정맥에 대한 반 부정맥 화합물의 개발 및 테스트를 위해 필수적이었습니다.
