현재 우리는 간의 플라스모듐 감염의 생물학에 대한 이해가 제한적입니다. 이 프로토콜은 유기체의 생물학에 대한 몇 가지 중요한 질문에 답하는 데 도움이 되는 많은 형질전환 라인을 생성하는 데 도움이 되었습니다. 말라리아 감염을 퇴치하기 위한 새로운 도구와 접근법을 개발하기 위해서는 기생충과 그 생물학에 대한 근본적인 이해가 필요합니다.
우리가 여기서 설명하고 있는 형질전환 방법은 숙주뿐만 아니라 유기체의 핵심적이고 복잡한 생물학을 해독하는 데 도움이 되었습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 실험실 관리자인 Carson Bowers입니다. P.Bergehei에 감염된 쥐를 생성하여 안락사시킨 후, 감염된 쥐 2마리의 혈액 2mL를 무균 환경에서 5mL의 엘스비어 용액에 모았습니다.
실온에서 8분 동안 450G의 혈액을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 10밀리리터의 완전한 RPMI 배지에 다시 현탁시킵니다. 셀 현탁액을 다시 원심분리하고 펠릿을 25ml의 완전한 RPMI 매체에 다시 현탁시킵니다.
세포 현탁액을 필터 캡이 있는 T75 배양 플라스크로 옮기고 세포를 현탁액 상태로 유지하기 위해 부드럽게 흔들어 배양합니다. 배양이 끝나면 500 마이크로 리터의 샘플을 수집합니다. 펠릿을 원심분리하고 10마이크로리터의 완전한 RPMI 매체에 다시 부유시킵니다.
다음으로 묽은 혈액 도말기를 준비합니다. Giemsa 염색으로 혈액 번짐을 염색하고 분열 빈도를 결정합니다. 최적의 형질주입 효율을 위해서는 기생충의 60-70%가 분열기 단계에 있어야 합니다.
50 밀리리터 원심분리 튜브에서 13 밀리리터의 밀도 그래디언트 스톡 배지를 재구성하여 그래디언트 원심분리 완충액을 준비합니다. 25mL의 혈액 배양액을 50mL의 새 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 좁은 유리 피펫을 사용하여 20mL의 그래디언트 원심분리 버퍼를 원심분리 튜브 바닥에 조심스럽게 레이어링하여 그래디언트 컬럼을 만들고 버퍼와 매체 사이의 명확한 구분을 확인합니다.
준비된 완충액과 배지를 실온에서 중단 없이 450G에서 20분 동안 원심분리합니다. 목초지 피펫을 사용하여 배양 배지와 그래디언트 원심분리 완충액의 계면에서 분열층을 조심스럽게 제거합니다. 새 50밀리리터 원심분리 튜브에 넣습니다.
분리된 주혈기를 완전한 RPMI 매체에 다시 현탁시키고 총 부피를 40밀리리터로 늘립니다. 상층액을 원심분리하고 폐기한 후 10밀리리터의 완전한 RPMI 매체에 분열제를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 이 용액 1밀리리터를 각 transfection에 대해 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 16, 000G에서 원심분리하여 감염된 세포를 5초 동안 펠릿화합니다.
다음으로, 실온에서 100 마이크로리터의 전기천공법 완충액을 1.5 밀리리터의 마이크로 원심분리 튜브에 5 마이크로그램의 타겟 플라스미드 DNA와 결합합니다. 감염된 세포를 원심분리한 후 상층액을 제거하고 준비된 뉴클레오펙터 용액과 플라스미드 DNA에 세포를 조심스럽게 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 현탁액을 전기천공법, 큐벳 및 적절한 뉴클레오펙터 프로그램을 사용하여 transfection으로 옮깁니다.
그런 다음 큐벳에 100마이크로리터의 전체 RPMI 미디어를 추가합니다. 전체 용액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 접종 후 2일부터 매일 형질주입된 schizont를 접종한 마우스의 기생충혈증 수치를 확인합니다.
감염이 확인되면 약물을 경구 투여하고 임시로 제공되는 물을 마시는 것으로 약물 선택을 시작합니다. 피로메티민 치료 시작 후 6일부터 혈액 도말을 사용하여 기생충혈증을 모니터링합니다. 기생충혈증이 1% 이상에 도달하면 기생충을 순진한 B6 마우스로 옮겨 혈액 단계 기생충 스톡을 만듭니다.
기생충혈증이 2%에서 5%에 도달하면 주식을 생성하고 냉동 보존합니다. 모기에 감염되기 하루 전, 수컷과 암컷 모기가 모두 들어 있는 케이지 위에 섭씨 37도까지 가열된 물을 채운 장갑을 끼워 암컷 모기를 분리합니다. 곤충 흡인기(insect aspirator)를 사용하여 열원에 유인된 암컷 모기를 제거하고 감염을 위해 더 작은 케이지로 옮깁니다.
모기 먹이 및 감염 당일, 감염된 B6 마우스의 기생충혈증을 확인합니다. 2%에서 5% 사이의 기생충혈증은 모기 감염에 최적입니다. 기생충을 확인한 후 흉골 누운 상태에서 우리에 갇힌 암컷 모기에 마취된 쥐를 놓아 암컷 모기에 감염을 옮깁니다.
앞다리와 뒷다리를 수동으로 벌려 모기 먹이를 위한 가장 큰 표면적을 제공합니다. 감염된 쥐를 각 케이지에 15분 동안 그대로 두고 5분마다 쥐가 깨어 있지 않은지 확인합니다. 먹이 주기가 완료되고 쥐가 안락사되면 기관의 지침에 따라 안전하게 폐기하십시오.
모기 내에서 성공적인 감염을 확인하려면 감염 후 10일 후에 겸자로 말단 복부를 제거하여 모기 중내자를 분리합니다. 그런 다음 편광된 빛 아래에서 midguts를 관찰하여 난포낭의 존재를 감지합니다. 감염 후 18일이 되면 5-10마리의 모기를 해부하여 존재하는 포자동물의 수를 평가합니다.
sporozoites를 분리하고 계산하려면 집게나 미세한 해부 바늘로 흉부에 압력을 가하면서 모기의 머리를 조심스럽게 제거합니다. 침샘은 제거된 머리에 부착된 상태로 유지됩니다. 다음으로, 침샘에서 추가 모기 부스러기를 제거하고 400마이크로리터의 모기 해부 배지가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
그런 다음 분리된 타액선을 30게이지 바늘 주사기에 15-20회 통과시켜 파괴한 후 파괴된 타액선 10마이크로리터를 모기 해부 배지에 넣고 혈구계에 넣고 계산합니다. 마지막으로, 마우스에 주입하거나 장기 냉동 보존하기 위해 원하는 농도의 모기 해부 배지 또는 PBS에 타액선을 다시 부유시킵니다. 기생 쥐 혈액 배양에서 성숙한 P.berghei schizont를 묘사하는 현미경 이미지와 마찬가지로 제공됩니다.
해부 중에 침샘이 손상되지 않은 모기 머리의 현미경 이미지와 더 낮은 배율과 높은 배율에서 절개된 침샘이 표시됩니다. PB, GFP 11에 감염된 HEPA GFP 1 내지 10 숙주 세포에서 녹색 형광 신호의 생성은 기생 액포의 용해를 나타냈다. 그래디언트 인터페이스를 방해하지 않고 체이슨 레이어를 조심스럽게 제거하는 것이 중요합니다.
또한 포자 빛 격리 중에 머리와 함께 침샘을 안정적으로 제거하려면 약간의 연습이 필요합니다. 분리 후, 형질전환 스포로조이트는 동결 보존되거나 in vivo 또는 in vitro 감염 연구를 위해 신선하게 사용될 수 있습니다.
