혈액은 동의한 건강한 지원자로부터 채취하여 현지 규칙에 따라 처리해야 합니다. 이 프로토콜은 광 투과 응집법(LTA)에 의해 혈소판 풍부 혈장(PRP)에서 작용제 유도 혈소판 응집을 측정합니다. ISTH는 PRP 준비를 위한 2013년 방법 및 LTA9를 포함하여 표준화된 프로토콜을 제공합니다.  지역 윤리 위원회 규칙에 따라 ISTH 권장 사항에 따라 전혈을 4% 구연산나트륨으로 수집합니다. 지난 2주 이내에 비스테로이드성 항염증제(NSAID)를 복용한 기증자는 제외합니다.
1. 분석 절차
<ol><li>스톡 CRP-XL의 분취액을 분석(Tyrodes10) 완충액(표 1)에서 최대 응집을 유발하는 시작 농도로 희석합니다(1.3단계 아래 참고 참조). 참고: 문헌에서 1μg/mL의 농도는 최대 응집을 유도하지만 일부 실험실에서는 동일한 효과에 도달하기 위해 더 높은 농도가 필요합니다</li>
	<li>농도가 테스트 시약과 동일하도록 표준물질(1.3단계 및 그림 1 아래의 참고 참조)과 해당 희석 시리즈를 만듭니다.</li>
	<li>분석 버퍼에서 테스트 및 표준물질에 대한 6-8점 희석 시리즈를 생성하여 응집 반응을 100%에서 0% 응집으로 가져옵니다. 8점 희석 계열 농도 곡선을 보여주는 예가 표 2에 나와 있습니다. 참고: 일부 실험실은 총 10% 분석 부피(예: 50μL의 작용제와 450μL의 혈소판)로 작용제를 추가하여 분석에서 10배 농도를 최종 1배 농도로 희석하는 반면, 다른 실험실에서는 더 작은(더 농축된) 부피의 작용제(예: 5μL의 작용제와 495μL의 혈소판)를 추가합니다. 혈소판 농도에 영향을 미칩니다 - 다시 말하지만, 일관성을 유지하십시오. 이 예에서는 30μL의 10x 작용제를 270μL의 혈소판 풍부 혈장(PRP)에 첨가합니다.</li>
	<li>혈소판이 휴식을 취하고 사용할 준비가 되면 LTA 큐벳에 분주하고 교반 막대를 추가한 다음 홀딩 웰에서 37°C에 도달하도록 합니다.</li>
	<li>온도에 도달하면 큐벳을 응집계에 놓고 트레이스 기록을 시작합니다. 작용제(교반 포함)를 추가하고 데이터를 기록합니다.</li>
	<li>곡선을 그리는 데 필요한 데이터가 수집될 때까지 테스트 및 표준물질의 각 농도에 대해 1.4단계를 반복합니다(예: 그림 2에 표시된 곡선).</li>
	<li>표준물질과 비교하여 테스트 시약의 효능을 계산합니다. 다시 말하지만, 일관성이 있고 분석 모델이 데이터에 적절하게 맞는 한 메트릭(최대 집계 또는 곡선 아래 영역)을 사용합니다.</li>
</ol>2. 농도 곡선 확인
<ol><li>먼저 농도 반응 곡선이 평행한지 확인합니다. 이 작업을 수행하는 많은 소프트웨어 패키지가 있지만 여기서는 Graphpad Prism에 대한 프로세스를 설명합니다( 그림 3 참조).<ol><li>log(concentration)가 X축에 있고 반응(% maximum aggregation/AUC)이 Y축에 오도록 데이터를 입력합니다(그림 3A).</li>
		<li>CRP-XL 농도 변환(그림 3B)</li>
		<li>분석 함수에서 비선형 회귀 분석을 선택하고 용량-반응 자극/억제에 대한 방정식을 사용합니다.</li>
		<li>로그(작용제) 대 반응(가변 기울기) 선택 - 데이터에 가장 적합한 것에 따라 3-차 또는 4-차 적합치를 사용합니다.</li>
		<li>비교 탭(그림 3C 참조)을 사용하여 곡선이 평행한지 여부를 확인하고 버튼을 클릭하여 데이터 세트를 비교하여 경사(언덕 경사)와 점근선(곡선의 위쪽 및 아래쪽)이 동일한지 확인합니다. 이 예에서 검정의 언덕 기울기는 2.279이고 표준의 언덕 기울기는 2.025로 비율은 1.125입니다.</li>
		<li>기울기가 평행하고(예: 경사 비율의 허용 기준이 0.8-1.25 사이) 점근선이 동일한 경우 2.1.3 및 2.1.4단계를 사용하여 잠재력(EC50) 계산을 진행합니다. 여기에 표시된 예에서는 2.1.5단계의 평가에서 점근선이 동일하다는 것이 확인됨에 따라 점근선이 제한되었습니다.</li>
		<li>표준물질의 EC50 값을 테스트의 값으로 나누어 상대적 효능을 결정합니다. 여기에 표시된 예에서 test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846, 즉 'test'는 표준의 절반만큼 강력합니다.</li>
		<li>효능의 차이를 설명하기 위해 질량/부피 농도를 조정합니다(예: 표준물질이 이전에 1μg/mL에서 사용된 경우 새로운 물질은 1/0.4846 = 2.063μg/mL)에서 사용되어 비슷한 양의 활성 물질이 실험에 사용되도록 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드에 대한 반응 표준화

<ol>
	<li>Faya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potency+assignment+of+biotherapeutic+reference+standards.">Potency assignment of biotherapeutic reference standards.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577 (2020).</li><li>Morton, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1-independent+activation+of+platelets+by+simple+collagen-like+peptides:+collagen+tertiary+(triple-helical)+and+quaternary+(polymeric)+structures+are+sufficient+alone+for+alpha+2+beta+1-independent+platelet+reactivity.">Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity.</a> The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).</li><li>Pugh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+platelet+collagen+receptors+defined+using+receptor-specific+collagen-mimetic+peptide+substrata+in+flowing+blood.">Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood.</a> Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).</li><li>Farndale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-collagen+interactions:+the+use+of+peptide+Toolkits+to+investigate+collagen-receptor+interactions.">Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).</li><li>Dunster, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+phenotyping+of+platelet+reactivity+for+stratification+of+human+cohorts.">Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts.</a> Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).</li><li>Hubbard, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+WHO+2nd+International+Standard+Factor+V,+plasma+(16/374):+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).</li><li>Sergaki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+whole+cell+standards+for+the+microbiome+field.">Developing whole cell standards for the microbiome field.</a> Microbiome. 10 (1), 123 (2022).</li><li>Alessi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-center+evaluation+of+light+transmission+platelet+aggregation+reagents:+Communication+from+the+ISTH+SSC+Subcommittee+on+Platelet+Physiology.">Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).</li><li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+standardization+of+light+transmission+aggregometry:+A+consensus+of+the+working+party+from+the+platelet+physiology+subcommittee+of+SSC/ISTH.">Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).</li><li>Taylor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+GPVI+receptor+antagonists+by+structure-based+repurposing.">Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing.</a> PLoS One. 9 (6), e101209 (2014).</li><li>Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+the+science+of+measurement+to+biology:+Why+bother.">Applying the science of measurement to biology: Why bother.</a> PLoS Biology. 17 (6), e3000338 (2019).</li></ol>

저자는 선언 할 것이 없습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 재료를 표준화하는 과정은 매우 간단합니다. 새로운 재료 배치를 평가하거나 현재 배치가 안정적이고 시간이 지남에 따라 활성을 잃지 않는지 확인하는 데 약간의 시간이 필요하지만, 시약 배치의 수명뿐만 아니라 실험을 몇 번이고 재현할 수 있고 수년에 걸쳐 비교할 수 있다는 보상이 있습니다. 이는 또한 다른 연구자들이 분석 조건을 정확하게 재현할 수 있고 커뮤니티가 글로벌 수준에서 조화를 이룰 수 있음을 의미합니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 전혈 수집 및 PRP 준비9와 희석 시리즈를 만들 때의 정밀도가 포함됩니다. EC50 비교를 진행하기 전에 테스트 곡선과 표준 곡선이 평행한지 확인하는 것도 중요합니다. 선이 평행하지 않거나 점근선이 동일하지 않으면 테스트 및 표준 재료가 어느 정도 다르다는 것을 나타낼 수 있습니다.
생물학 분야에서 일하는 모든 사람은 생물학적 분석이 항상 일관되게 수행되는 것은 아니라는 것을 알고 있으므로 데이터를 평가할 때 이를 염두에 두어야 합니다. 여기에 표시된 예에서 동일한 공여체를 사용하여 동일하지는 않더라도 매우 유사한 두 물질의 효능을 측정하더라도 언덕 경사면과 점근선은 동일하지 않습니다. 그러나 우리는 어느 정도의 변동성을 인정하고 이 경우 곡선이 평행하므로 효능을 비교하고 조정하는 데 적합하다는 결론을 내립니다. 생물학적 분자는 크고 복잡하며, 제조 중 번역 후 변형은 생물학적 분석에서 분자의 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 생체 분자 및 생물 분석의 표준화는 질량 또는 부피만으로는 수행할 수 없으며 생물 검정11에서 생물학적 활성을 정량화하고 비교하여 수행해야 합니다. 자신의 교육과 경험을 사용하여 분석의 맥락에서 데이터를 평가해야 합니다.
이 기술의 한계는 데이터가 시약에 문제가 있음을 나타낼 수 있지만 문제가 무엇인지 알려줄 수 없다는 것입니다. 재료가 비교할 수 없는 이유를 결정하기 위해 추가 작업이 필요합니다. 이상적인 세계에서는 실험 및 후속 과학적 결론에 중요한 모든 물질이 질량 분광법으로 검증되지만 이것이 항상 선택 사항은 아닙니다. 그러나 데이터를 비교할 수 없는 경우 추가 조사가 어느 정도 필요합니다. 이 접근 방식의 또 다른 한계는 이를 수행하는 데 필요한 시간과 리소스입니다. 이상적으로는 3-6명의 기증자를 대상으로 테스트와 표준물질을 비교하여 물질에 생물학적 활성을 부여하는 데 어느 정도 확신을 주어야 하지만, 재현성과 신뢰성을 뒷받침함으로써 이것이 정당화될 수 있다고 생각합니다. 실험을 실행할 때마다 생물학적 물질의 표준화가 필요한 것은 아니지만, 최소한 안정성과 용도에 따라 새로운 작용제 배치마다 더 자주 표준화해야 합니다. 실제로, 표준이 제공된다면, 이는 국제 표준화 기구가 명확하게 제공할 수 있는 것입니다.
여기에 표시된 예는 혈소판 응집 측정의 맥락에서 CRP-XL에 대한 것이지만, 생물학적 분석에서 생체 분자의 생물학적 활성을 비교하는 프로토콜은 해당 분야 전반에 걸쳐 널리 적용됩니다.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65410">Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide</a>. The Authors section was updated from:
Carmen H. Coxon1 
Peter Rigsby1 
1National Institute for Biological Standards and Control
to:
Carmen H. Coxon1 
Peter Rigsby1 
1Medicines and Healthcare products Regulatory Agency

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65410">Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

우리 중 많은 사람들이 실험에서 생물학적 작용제와 길항제를 사용하며, 특정 조건에서 세포 기능에 미치는 영향을 정량화하는 생물학적 분석에서 가장 자주 사용합니다. 여기에 설명된 방법은 혈소판을 활성화하고 다양한 분석(광 투과 응집법, 현미경, 유세포 분석, Ca2+ 방출 등)에서 활성을 측정할 수 있는 당단백질 VI 작용제인 혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드(CRP-XL)에 대한 것이지만, 작용제 표준화 프로토콜은 모든 생물학적 작용제/길항제 및/또는 생물학적 검정에 적용할 수 있습니다. 물리학은 일상 업무 관행에서 표준물질의 사용에 정통하며, 상업 부문에서 바이오치료제를 개발하는 회사들은 참조 표준물질1 사용의 가치를 이해하고 있지만, 많은 생물학 과학자들, 특히 학술 연구 커뮤니티에서 표준물질의 활용도가 낮으며, 표준물질의 사용 부족은 과학적 결과물의 질에 부정적인 영향을 미친다.
CRP-XL은 1995년2 이후 혈소판 분야에서 수십 년 동안 사용되어 온 특정 GPVI 특이적 작용제로, 3,4 이후 커뮤니티에서 GPVI의 역할을 다른 콜라겐 결합 혈소판 단백질의 역할과 구분하는 데 도움이 됩니다. 이 작용제는 다양한 상업적 출처에서 조달하거나 사내에서 생산할 수 있습니다. 펩타이드 단량체는 공급업체로부터 구매한 후 사내에서 가교하거나 공급업체가 추가 비용을 지불하고 가교할 수 있습니다. 배송 시 필요한 순도를 줄임으로써 비용을 추가로 절감할 수 있습니다(예: 70% 대 95%). 또한 CRP-XL을 보관하는 방법에 대한 합의가 이루어지지 않았으며, 일부는 냉동 보관을 선택하고 일부는 사용할 때까지 재료를 동결 건조하여 보관하고 다른 일부는 용액(선호도에 따라 물 또는 완충액)에 보관합니다. 따라서 실험실 스톡의 품질과 구성은 표준화되지 않았거나 조화를 이루지 못했습니다. 이 작용제는 활성 단위가 아닌 정의된 농도(질량/부피)로 사용되기 때문에 한 실험실에서 CRP-XL의 효능(예: 1μg/mL)은 다른 실험실과 동일하지 않습니다. 현장에서 사용되는 다른 혈소판 작용제는 이미 표준화되어 있으므로(예: 트롬빈은 질량/부피가 아닌 활동 단위로 공급 및 사용됨) 질량/부피에서 생물학적 단위로의 이동이 커뮤니티에 너무 어렵지 않아야 합니다. 또한 CRP-XL을 포함한 혈소판 작용제에 대한 환자의 반응은 작용제에 대한 민감도와 반응 능력(반응 정도) 측면에서 다양하므로5 분석에서 일관된 양의 작용제 활성을 사용하는 것이 훨씬 더 중요합니다.
혈소판 작용제를 중량/부피가 아닌 정의된 활성으로 사용하여 조화시킬 수 있다면 한 실험실의 실험을 다른 실험실의 실험과 직접 비교할 수 있고 자신 있게 정확하게 재현할 수 있습니다. 현장에서 CRP-XL 활동을 저장하고 표준화하는 방법에 대한 합의에 도달할 때까지 재료가 사용되는 수개월/년 동안 일관성을 보장하기 위해 재료를 정기적으로 점검하는 것이 중요합니다.
생물학적 표준물질에 대한 활성값 할당은 협력적인 다기관 연구(예: 6,7)를 통해 수행되어야 하며 전문 지식이 필요합니다. 혈소판 작용제에 대한 확립된 생물학적 표준의 필요성은 최근 국제 혈전증 및 지혈 학회(International Society for Thrombosis and Haemostasis, ISTH)가 지원하는 다기관 협력 연구8에 의해 강조되었다. 국제 CRP-XL 표준이 제공될 때까지 연구자들은 시간이 지남에 따라 일관성을 보장하기 위해 현지에서 자체 재료를 표준화할 수 있으며, 상업적 또는 사내에서 조달된 새로운 재료는 이전 준비 및 나머지 커뮤니티의 준비와 유사한 활동을 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Anticoagulant dissolved in water9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRP-XL</td>
			<td>Peptide Protein Research Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes and stir bars</td>
			<td>Stago</td>
			<td>86921</td>
			<td>Consumables for aggregometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet rich plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reproducibility and harmonization in research using biological standards: the example of platelet agonist collagen-related peptide

측정의 과학인 도량형은 생물학자들이 훈련을 받을 때 배워지는 과목이 거의 없습니다. 간단한 표준화 프로세스를 일상적인 작업 관행에 적용하면 데이터에 대한 신뢰와 거리와 시간에 대한 재현성을 얻을 수 있습니다.
이 방법은 지혈 연구 및 임상 실습에서 널리 사용되는 핵심 실험실 실험, 특히 광 투과 응집법(LTA)에 의한 혈소판 콜라겐 수용체(당단백질[GP]VI) 작용제 콜라겐 관련 펩타이드, 가교(CRP-XL)에 대한 반응을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 접근법을 사용하면 작용제 재고 또는 공급업체에 관계없이 실험실 내 재현성과 실험실 간 조화를 보장할 수 있습니다. 중요한 것은 이 방법이 다른 혈소판 작용제와 실제로 다른 많은 생물학적 분자 및 생물학적 검정에 적용할 수 있다는 것입니다.
아래에 설명된 프로세스에는 '표준' 및 '테스트'(확인 중인 물질)의 6-8포인트 희석 시리즈를 만들고 선택한 분석(이 경우 LTA)에서 나란히 실행하는 것이 포함됩니다. CRP-XL은 질량/부피 농도에서 사용되지만 모든 물질이 주어진 농도에서 동일한 생물학적 활성을 제공하는 것은 아니므로 희석 시리즈를 통해 표준 물질과 테스트 물질을 비교하고 동등한 활성을 제공하는 데 필요한 농도를 결정합니다. 희석 계열은 0-100% 집계에 걸쳐 있어야 합니다. 데이터는 비선형 회귀를 사용하여 표시되며 각 표본(표준 및 검정)의 EC50 값이 결정됩니다. 활성을 할당하려면 표준물질의 EC50 값을 테스트의 값으로 나누어 얼마나 더 강력하거나 덜 강력한지 결정하고 그에 따라 농도를 조정하십시오. 이 접근법은 동일한 생물학적 '활성'이 분석에 몇 번이고 추가되도록 합니다.

Many of us use biological agonists and antagonists in our experiments, most often in a biological assay that quantifies their effect on cell function under specific conditions. The method described here is for the platelet agonist collagen-related peptide, cross-linked (CRP-XL), a glycoprotein VI agonist that activates platelets and whose activity can be measured in a variety of assays (light transmission aggregometry, microscopy, flow cytometry, Ca2+ release, etc.), but the agonist standardization protocol is applicable to any biological agonist/antagonist and/or bioassay. The physical sciences are well versed in the use of standards in their day-to-day working practices, and companies developing biotherapeutic medicines in the commercial sector understand the value of using reference standards1, yet they remain underutilized by many biological scientists, especially in the academic research community, and their lack of use negatively impacts the quality of scientific output.
CRP-XL is a specific GPVI-specific agonist that the platelet field has used for decades since its description in 19952, helping the community to delineate the role of GPVI from that of other collagen-binding platelet proteins ever since3,4. This agonist can be procured from a variety of commercial sources or produced in-house. The peptide monomer can be purchased from a supplier and then cross-linked in-house or this can be&#160;done by the supplier for an extra fee. Further cost-saving can be made by reducing the required purity upon delivery (70% versus 95%, for example). There is also no consensus on how CRP-XL should be stored, with some opting for cryostorage and others refrigeration, some keeping the material lyophilized until use, and others storing it in solution (water or buffer, depending on preference). Therefore, the quality and composition of laboratory stocks are non-standardized or harmonized. Because this agonist is used at a defined concentration (mass/volume) rather than units of activity, the potency of CRP-XL in one lab, e.g., at 1 &#956;g/mL, will not be the same as another. It is worth noting that other platelet agonists used in the field are already standardized (e.g., thrombin, which is supplied and used in units of activity rather than mass/volume), so the movement away from mass/volume to units of biological should not be too challenging for the community. It should also be noted that patient responses to platelet agonists, including CRP-XL, are variable in terms of their sensitivity to agonists as well as their capacity to respond (extent of response)5, so it is even more important to use consistent amounts of agonist activity in the assays.
If platelet agonists can be harmonized by using them at a defined activity rather than weight/volume, it can be ensured that an experiment in one lab is directly comparable to that in other labs and can be accurately reproduced with confidence. Until such time as the field reaches an agreement on how to store and standardize CRP-XL activity, it is essential to perform regular checks on the material to ensure its consistency over the months/years in which it is being used.
Activity value assignment for biological standards must be done through collaborative, multi-center studies (for example6,7) and require specialist expertise. The need for established biological standards for platelet agonists has been recently highlighted by a collaborative multi-center study8 supported by the International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH); until an international CRP-XL standard is available, researchers can standardize their own material locally to ensure consistency over time, and that new material sourced commercially or in-house is of comparable activity to previous preparations, as well as that of the rest of the community.

저자 스포트라이트: 연구에서 재현성과 조화를 보장하기 위한 생물학적 표준화 

생물학적 표준을 사용한 연구의 재현성 및 조화: 혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드의 예

Researchers at the MHRA South Mimms Laboratories have been developing manufacturing biological standards for over 60 years, and these reference reagents are used to ensure the quality, consistency, and safety of biological medicines and diagnostics. NIB standards from the MHRA support translation of cutting edge therapeutic products, as well as the control of established medicines. At the MHRA South Mimms Laboratories, we use state-of-the-art technologies to produce materials that support the development and regulation of novel therapeutic innovations.Biological standards remain underutilized by academics in the biological sciences due to a lack of knowledge exchange. This negatively impacts the quality of research and contributes to the reproducibility crisis. Biological standardization ensures experiments are reproducible regardless of where or when they are performed.A lack of proper knowledge in basic metrological principles and training compromises scientific rigor and negatively impacts reproducibility. Although our protocol focuses on standardizing platelet function measurement, the practice can be applied to any biological system. Applying biological standardization to research practices will not only standardize biological experiments, but also help to address inconsistencies and the lack of harmonization that undermines research.

그림 1은 희석 시리즈를 도식적으로 표현한 것으로, 표준물질과 테스트 모두에 희석 시리즈가 필요하다는 것을 강조하기 위한 것입니다. 그림 2A는 표준물질에 대한 집계 트레이스를 보여주며, 테스트 데이터는 그림 2B에 나와 있습니다. 0.075μg/mL에서는 표준물질에 대한 명확한 반응이 있는 반면, 테스트의 경우 해당 농도(0.075μg/mL)는 평평합니다. 이 데이터는 EC50을 제공하기 위해 후속 그래프를 그리는 데 사용됩니다. 여기에 표시된 예에서는 그림 3과 같이 100% 최대 응집을 사용하여 농도-반응 곡선을 표시하고 EC50을 결정했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65410/65410fig01.jpg"> 그림 1: 테스트의 두 희석 시리즈(왼쪽)와 표준물질(오른쪽)에 대한 그래픽 설명. 최고 농도(권장 농도: 10μg/mL CRP-XL)부터 시작하여 순차적 1/2 희석이 8개 지점(>3 log 단위)에 걸쳐 병렬로 이루어집니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65410/65410fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65410/65410fig02.jpg"> 그림 2: 표준물질(왼쪽) 및 테스트 희석 시리즈(오른쪽)에 대한 응집 트레이스. 혈소판 응집이 진행되면(x축) 샘플을 통과하여 센서에 도달하는 빛의 양이 증가합니다(y축). (A) 표준. (B) 테스트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65410/65410fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65410/65410fig03.jpg"> 그림 3: 데이터 입력 및 분석. (A) 데이터를 입력하고, (B) 변환하고, (C,D) 평행도를 분석합니다(언덕 경사와 점근선이 비교 가능한지 알려달라고 소프트웨어에 요청). (E) 곡선이 평행한 경우 비선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 효능(EC50)을 결정합니다. (F) 표시된 변환 데이터. 자세한 내용은 방법을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65410/65410fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">티로드 버퍼9</td>
		</tr><tr><td>성분</td>
			<td>농도</td>
			<td>코멘트</td>
		</tr><tr><td>염화나트륨</td>
			<td>134 밀리미터</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Na2HPO4 개</td>
			<td>0.34 밀리미터</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>케이클</td>
			<td>2.9 밀리미터</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>NaHCO3 재질 보기</td>
			<td>12 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)</td>
			<td>20 밀리미터</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>포도당</td>
			<td>5 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>마그네슘화합물 2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>산도 7.3</td>
		</tr></tbody></table>표 1: Tyrodes 완충액의 구성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">8 포인트 희석 시리즈</td>
		</tr><tr><td>희석 1</td>
			<td>10μg/mL</td>
		</tr><tr><td>희석 2</td>
			<td>5μg/mL</td>
		</tr><tr><td>희석 3</td>
			<td>2.5μg/mL</td>
		</tr><tr><td>희석 4</td>
			<td>1.25μg/mL</td>
		</tr><tr><td>희석 5</td>
			<td>0.625μg/mL</td>
		</tr><tr><td>희석 6</td>
			<td>0.3125μg/mL</td>
		</tr><tr><td>희석 7</td>
			<td>0.15625 μg/mL</td>
		</tr><tr><td>희석 8</td>
			<td>0.073125 μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 8점 희석 시리즈를 보여주는 예.

Watch this Scientific Journal Video about Biological Standardization to Ensure Reproducibility and Harmonization in Research at JoVE.com

여기에서는 광투과 응집법을 이용하여 혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드 가교(CRP-XL)를 표준화하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 혈소판 기능을 목표로 하지만, 실험 과정은 과학적 엄격성과 재현성을 보장하기 위해 대부분의 생물학적 분자 및 생물학적 분석에 적용될 수 있습니다.

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...

MHRA South Mimms Laboratories의 연구원들은 60년 이상 제조 생물학적 표준을 개발해 왔으며 이러한 참조 시약은 생물학적 의약품 및 진단의 품질, 일관성 및 안전성을 보장하는 데 사용됩니다. MHRA의 NIB 표준은 최첨단 치료제의 번역과 기존 의약품의 관리를 지원합니다. MHRA South Mimms Laboratories에서는 최첨단 기술을 사용하여 새로운 치료 혁신의 개발 및 조절을 지원하는 재료를 생산합니다.생물학적 표준은 지식 교환의 부족으로 인해 생물 과학 분야의 학자들에 의해 충분히 활용되지 않고 있습니다. 이는 연구의 질에 부정적인 영향을 미치고 재현성 위기에 기여합니다. 생물학적 표준화는 실험이 수행되는 장소나 시간에 관계없이 재현 가능하도록 보장합니다.기본 도량형 원리 및 교육에 대한 적절한 지식이 부족하면 과학적 엄격성이 손상되고 재현성에 부정적인 영향을 미칩니다. 당사의 프로토콜은 혈소판 기능 측정을 표준화하는 데 중점을 두고 있지만, 이 관행은 모든 생물학적 시스템에 적용될 수 있습니다. 연구 관행에 생물학적 표준화를 적용하면 생물학적 실험을 표준화할 뿐만 아니라 연구를 저해하는 불일치와 조화 부족을 해결하는 데 도움이 됩니다.

reproducibility-harmonization-research-using-biological-standards

Research

JoVE Journal

Medicine

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

639 조회수.  Medicines and Healthcare products Regulatory Agency. MHRA South Mimms Laboratories의 연구원들은 60년 이상 제조 생물학적 표준을 개발해 왔으며 이러한 참조 시약은 생물학적 의약품 및 진단의 품질, 일관성 및 안전성을 보장하는 데 사용됩니다. MHRA의 NIB 표준은 최첨단 치료제의 번역과 기존 의약품의 관리를 지원합니다. MHRA South Mimms Laboratories에서는 최첨단 기술을 사용하여 새로운 치료 혁신의 개발 및 조절을 지원하는 재료를 생산?...

비디오: 저자 스포트라이트: 연구에서 재현성과 조화를 보장하기 위한 생물학적 표준화 

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of simple standardization processes to everyday working practices provides confidence in data and reproducibility over distance and time.
This method demonstrates how to standardize a core laboratory experiment used widely in hemostasis research and clinical practice, specifically, measuring responses to the platelet collagen receptor (glycoprotein [GP]VI) agonist collagen-related peptide, cross-linked (CRP-XL) by light transmission aggregometry (LTA). Using this approach will ensure intra-lab reproducibility and inter-lab harmonization, regardless of agonist stock or supplier. Importantly, this method is applicable to other platelet agonists and, indeed, many other biological molecules and bioassays.
The process outlined below involves making a 6-8 point dilution series of the &#39;standard&#39; and the &#39;test&#39; (the material you are checking) and running them side by side in a chosen assay (in this case, LTA). CRP-XL is used at mass/volume concentrations, but not every material gives the same biological activity at a given concentration, so a dilution series is made to compare the standard and test material and determine what concentration is needed to give equivalent activity. The dilution series must span 0-100% aggregation. Data is plotted using non-linear regression, and the EC50 value of each sample (standard and test) is determined. To assign activity, divide the EC50 value of the standard by that of the test to determine how much more or less potent it is and adjust the concentration accordingly. This approach will ensure that the same biological &#39;activity&#39; is added to the assay time and time again.

Here we present a method to standardize the platelet agonist collagen-related peptide cross-linked (CRP-XL) using light transmission aggregometry. While the protocol is targeted at platelet function, the experimental process can be applied to most biological molecules and bioassays to ensure scientific rigor and reproducibility.

연구

의학

Light Transmission Aggregometry for Standardizing Platelet Collagen Receptor Agonist

To begin the assay using the platelet receptor agonist, Collagen-Related Peptide Cross-Linked, or CRPXL, dilute an appropriate amount of the CRPXL stock in the assay buffer to a concentration suitable to induce maximum platelet aggregation. The resultant solution will be henceforth referred to as the standard. Next, starting from the same highest prepared concentrations, sequentially perform two-fold serial dilutions for both the standard and the test reagent.Prepare a six-to-eight point dilution series for both the test and the standard in the assay buffer that generates aggregation responses from 100%down to 0%When the platelet-rich plasma, or PRP, is ready to use, add an aliquot of PRP into the light transmission aggregometry cuvette. Allow the samples to warm to 37 degrees Celsius in the holding wells for a couple of minutes. Once appropriately warmed, place the cuvettes in the aggregometer to start recording the traces.With constant stirring, add the agonist, and record the data. Perform data collection for each prepared dilution of the standard and the test reagent. Use Graphpad Prism, or any suitable software package, to check that the concentration curves for the standard and test are parallel.Enter the data such that the x-axis contains the concentrations, and the y-axis contains the responses indicated by either the percentage of maximum aggregation or the area under the curve. Next, transform the concentration values to the corresponding logarithms, or log concentration. Select non-linear regression from the analysis functions, and use the equation for dose response stimulation.Select log agonist versus response variable slope, and use a three or four-way fit, depending on which is best for the data. Determine if the curves generated are parallel by clicking the compare tab and comparing the datasets. Ensure that the slope and asymptotes of the test, and the standard curves, are equivalent.If these conditions are met, proceed to calculate the potency, or EC50, using non-linear regression curve fitting. Calculate the relative potency by dividing the EC50 value of the standard by that of the test. Adjust the mass per volume concentration of the test reagent to account for the difference in potency with respect to the standard.The platelet aggregation traces for the standard and the test reagent revealed the difference between the two aggregation responses. At 0.075 micrograms per milliliter, there was a clear response to the standard, while, for the test, the corresponding concentration showed no response. The EC50 values of the standard and test reagent were calculated by plotting the concentration response curve.