우리는 Xiaolan Ye에게 감사하고 싶은데, 이 프로토콜은 그녀가 원래 한 관찰의 결과로 개발되었기 때문입니다. 이 프로토콜의 개발 및 최적화에 도움을 주신 Petrascheck Lab의 모든 과거 및 현재 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 R21 AG080376(MP에게)의 자금 지원을 받았습니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)의 자금 지원을 받는 CGC에 의해 제공되었습니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig01.jpg"> 그림 1: 박테리아 제거 분석의 개략도. 프로토콜의 주요 섹션에 대한 그래픽 개요(위에서 아래로): 박테리아 준비, 웜 개체군 동기화, 96웰 플레이트에 파종, 웜 살균, 약물 추가, 1일 및 4일째 OD600 측정. 이러한 특정 단계에 대한 자세한 설명은 각 그림의 왼쪽에 표시되어 있습니다. 약어: OD = 광학 밀도; FUdR = 플루오로데옥시우리딘. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 박테리아 준비
참고: 이 섹션에서는 이 분석에 사용된 섭식 박테리아의 준비에 대해 자세히 설명합니다. 분석에 사용된 특정 대장균 균주를 OP50이라고 합니다. OP50은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 먹이로 가장 널리 사용되는 균주입니다. 사용된 OP50 균주는 카르베니실린/암피실린 내성이 있어 웜 배양액이 다른 박테리아와 교차 오염되는 것을 방지합니다9.
<ol><li>OP50은 4-5일 전에 준비하고 사용 하루 전에 X-ray를 조사하십시오. OP50을 만나는 모든 재료가 멸균29,30인지 확인하십시오.</li>
	<li>-8일차: 수요일(1주차):<ol><li>5mL의 LB에 100μg/mL 암피실린 및 0.1μg/mL 암포테리신 B를 접종하고 단일 OP50 콜로니를 접종하여 프레이노큘럼을 준비하고 박테리아 셰이커에서 37°C에서 약 6시간 동안 배양합니다. 배양액이 흐려질 수 있을 만큼 충분히 자랄 수 있도록 조기에 접종하십시오.</li>
		<li>배양액이 탁해지면 100μg/mL 암피실린이 함유된 TB 250mL에 OP50의 preinoculum 배양을 1:2,000으로 희석합니다. 박테리아 셰이커에서 37°C에서 17-19시간 동안 배양액을 밤새 배양합니다. 알림: 배양액은 19시간 이상 자라게 해서는 안 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>-7일차: 목요일(1주차)<ol><li>17-19시간 배양 후 OP50 액체 배양액을 멸균 원심분리 튜브에 옮기고 4°C의 탁상용 원심분리기에서 3,100× g 으로 15분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상층액을 버리고 OP50 펠릿을 멸균수로 재현탁시킨 다음 다시 원심분리합니다. 이 세탁을 2번 반복합니다.</li>
		<li>두 번째 세척 후 상층액을 버리고 OP50 펠릿을 멸균수에 50mL 부피로 재현탁시킨 다음 사전 계량된 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. OP50을 3,100× g 에서 20분 동안 원심분리하여 4°C의 탁상용 원심분리기에서 펠렛합니다.</li>
		<li>세 번째 세척 후 튜브에 물이 남아 있지 않도록 남아 있는 모든 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿이 있는 원심분리 튜브의 무게에서 빈 원심분리 튜브의 무게를 빼서 펠릿의 무게를 계산합니다. 참고: 펠릿 무게는 일반적으로 3-3.5g 범위입니다.</li>
		<li>OP50 펠릿을 S-complete 완충액의 농도로 100mg/mL 농도로 완전히 재현탁하여 응집이 없는지 확인합니다.</li>
		<li>100mg/mL에서 OP50의 농도가 2 × 1010 박테리아/mL에 해당하는지 확인하십시오. 광학 밀도와 mL당 박테리아 수 사이의 관계가 알려진 경우 분광광도계로 mL당 박테리아 농도를 측정하십시오. 필요한 경우 S-complete 버퍼를 사용하여 OP50 공급 용액의 농도를 2 × 1010 박테리아/mL로 조정합니다.</li>
		<li>한천 플레이트에서 OP50을 테스트하여 오염되었는지 확인합니다.</li>
		<li>OP50을 4°C의 S-complete 버퍼에 보관합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="4"><li>-3일차: 월요일(2주차)<ol><li>분석 중 박테리아 성장을 방지하기 위해 X선 조사를 통해 박테리아를 죽입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 동기식 웜 배양 준비
참고: 이 섹션에서는 동기 웜 모집단의 준비에 대해 설명합니다. 웜 개체군과 접촉하는 모든 물질은 멸균 상태입니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 플레이트는 20°C로 유지됩니다.
<ol><li>-6일차: 금요일(1주차), 오후 4:00<ol><li>동물을 새 접시에 옮깁니다.<ol><li>대부분의 벌레 개체군이 굶주린 L1 유충으로 구성된 NGM 플레이트를 예로 들어 보겠습니다. 참고: 혼합 모집단도 결과를 생성합니다. 오랫동안 굶주린 L1 벌레를 사용하면 굶주림이 최소 3세대 동안 후성유전학적 흔적을 남길 수 있기 때문에 현재 또는 미래 세대의 섭식 행동에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
			<li>1mL 이하의 멸균수로 벌레를 씻어냅니다. 세척된 웜 개체군의 ~300μL를 농축된 OP50(~300mg/mL)으로 파종된 NGM 플레이트에 분양합니다. 플레이트 건조기 또는 Bunsen 버너 아래에서 플레이트를 건조시키십시오. 인구의 대부분이 gravid 성인을 포함 할 때까지 20 ° C에서 플레이트를 배양합니다 (월요일). 참고: 이 시간 프레임은 야생형 N2 웜 개체군에 최적화되어 있으며 균주에 따라 다를 수 있습니다. 발달이 지연된 웜은 고려되어야 하며 테스트된 모든 균주가 동시에 성충에 도달할 수 있도록 더 일찍 청크 및/또는 더 일찍 파종해야 합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>-3일차: 월요일(2주차) 오전 10:00<ol><li>동기 채우기 설정 주의! 표백제는 피부와 눈을 부식시킵니다. 이를 다루려면 장갑과 보안경이 필요합니다.<ol><li>최대 10mL의 멸균수로 플레이트에서 기생충을 씻어내어 수집합니다. 이 웜/물 용액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.</li>
			<li>벤치 상단의 중력 싱크로 약 4분 동안 웜을 세척합니다(반대로 310× g의 탁상용 원심분리기에서 2분 동안 원심분리로 세척합니다.</li>
			<li>작은 팁을 사용하여 흡인을 통해 상층액을 버리고 최대 15mL의 멸균수를 추가합니다. 3번 반복합니다.</li>
			<li>상층액을 제거하고 갓 준비한 표백제/NaOH 용액 5mL(가정용 표백제 1.8mL, 10N NaOH 0.5mL, dH2O7.7mL)를 추가합니다.</li>
			<li>실온에서 5분 동안 또는 벌레가 열릴 때까지 배양합니다. 최소 10초 동안 매분마다 부드럽게 소용돌이칩니다. 해부 현미경으로 진행 상황을 모니터링합니다. 알림: 웜을 분리하는 데 필요한 시간은 변형에 따라 다를 수 있습니다. 표백제 용액에 벌레를 너무 오래 방치하면 생존할 수 없는 알이 생길 수 있습니다.</li>
			<li>모든 성체가 분리되어 열리거나 용해되면(최종 부피는 15mL) 반응을 중화하기 위해 M9 완충액을 추가하고 1,300×g에서 2분 동안 원심분리합니다.</li>
			<li>M3 완충액 13mL로 계란을 9번 씻습니다.</li>
			<li>1,300 × g에서 2분 동안 원심분리하여 10mL의 S-complete buffer로 계란을 한 번 세척합니다.</li>
			<li>상층액을 흡입하고 10mL의 S-complete를 첨가한 다음 현탁액을 새 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 너트 테이터 또는 이와 유사한 장치에서 실온에서 밤새 튜브를 부드럽게 회전시킵니다.</li>
			<li>선택 사항: S-complete 완충액에서 최종 원심분리 후 성체 사체가 있는 경우 40μm 세포 여과기를 통해 웜 용액을 여과합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>-2일차: 화요일(2주차), 오후 1:00<ol><li>동물에게 씨앗을 뿌려 접시에 담기<ol><li>해부 스코프를 사용하여 벌레가 부화했는지 확인하십시오. 절개 스코프를 사용하여 10μL 방울의 웜 개체수를 계산하여 S-complete 버퍼의 웜 농도를 결정합니다. 각 샘플에 대해 5-10방울을 셉니다. 각 10μL 방울의 웜 농도가 한 방울당 30개의 웜을 초과하는 경우 S-complete로 총 스톡을 한 방울당 더 낮은 웜 밀도로 희석하여 계수를 용이하게 합니다.</li>
			<li>액체 웜 혼합물을 다음과 같이 120 μL의 부피로 96-웰 플레이트의 각 웰에 파종합니다(최종 농도): S-complete에서 60 worms/mL, 50 μg/mL Carbenicillin, 0.1 μg/mL Amphotericin, 섹션 1에서 준비한 OP50 6mg/mL. 참고: 준비할 총 부피는 플레이트 수에 따라 다릅니다(96웰 플레이트당 ~12mL). 각 우물에는 6-12마리의 벌레가 있어야 합니다. 또는 Union Biometrica의 COPAS FP와 같은 대형 입자 유세포 분석을 사용하여 각 웰에 10개의 웜을 정밀하게 분류할 수 있습니다(군집 효과 섹션 참조).</li>
			<li>또한 섹션 1에서 준비한 카르베니실린 50μg/mL, 암포테리신 0.1μg/mL 및 OP50 6mg/mL의 벌레 가 없는 액체 혼합물을 포함합니다.</li>
			<li>120μL의 무웜 혼합물을 96웰 플레이트의 H행에 넣고 앞서 언급한 대로 자기 분해 값을 결정하는 데 사용합니다. 웜이 있는 혼합물의 웰당 120μL를 A-G열에 넣습니다. 알림: 피펫팅하는 동안 웜이 현탁액으로 유지되도록 하십시오( 그림 2A, B 참조). 우리는 바닥이 평평한 투명한 96웰 플레이트를 사용합니다. 당사의 플레이트 레이아웃은 플레이트를 분할하여 각 컬럼 쌍이 서로 다른 약물 처리 또는 웜 균주가 되는 4개 또는 6개의 조건을 생성하고, 맨 아래 행은 "웜 없음" 제어 역할을 합니다(그림 2A, B).</li>
			<li>오염 및 증발을 방지하려면 테이프 밀봉기로 플레이트를 밀봉하십시오. 동물이 L4 웜이 될 때까지 20 ° C에서 약 65 시간 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>0일차: 목요일(2주차) 정오 전.<ol><li>Fluorodeoxyuridine(FUdR)의 첨가를 통한 웜 개체군의 살균.<ol><li>30μL의 0.6mM FUdR 원액을 추가하여 각 웰의 동물을 멸균합니다. 테이프 실러를 사용하여 플레이트를 다시 밀봉하고 800rpm의 마이크로타이터 플레이트 셰이커에서 20분 동안 플레이트를 흔듭니다. 플레이트를 20°C 인큐베이터로 되돌립니다. 참고: 이 단계에서 최종 OP50 농도는 6mg/mL에서 5mg/mL(1 × 109 박테리아/mL)로 감소하고 각 웰의 최종 부피는 150μL입니다. 동물이 성체가 되기 전에 L4 단계에 FUdR을 추가하는 것이 중요합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>1일차: 금요일(2주차)<ol><li>배양액에 약물을 첨가하십시오.<ol><li>오전 9:00까지 대부분의 동물이 임신하고 각 우물에 여러 개의 알이 들어 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 원하는 농도의 약물을 추가하십시오(토론 참조).</li>
			<li>약물을 첨가한 후 테이프 실러로 플레이트를 밀봉하고 플레이트 셰이커에서 800rpm으로 20분 동안 플레이트를 흔듭니다. 알림: 흔들면 모든 박테리아 덩어리가 밀봉기를 건드리지 않고 용해됩니다. 씰러에 있는 박테리아 덩어리 또는 액체는 모두 OD600 판독값을 왜곡합니다. 밀봉기에 액체 방울이 있는 경우 310× g에서 10-20초 동안 잠시 회전시킵니다. 셰이커에 다시 5분 동안 흔들어 주고 측정합니다.</li>
			<li>마이크로타이터 플레이트 셰이커를 20분 동안 흔든 후 뚜껑과 씰을 제거하고 플레이트 리더에서 OD600 을 측정합니다. 이것은 Day 1 OD600 측정입니다. 플레이트를 밀봉하고 20°C 인큐베이터로 되돌립니다. 알림: 박테리아는 빨리 가라앉기 때문에 플레이트를 흔든 후 10분 이내에 판독해야 합니다.</li>
			<li>도립 현미경을 사용하여 약물이 추가된 경우 오염 또는 독성의 징후가 있는지 벌레 개체군을 확인합니다. 플레이트를 20°C 인큐베이터로 되돌립니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>4일차: 월요일(3주차)<ol><li>Day 4 OD600 읽기를 가져 가십시오.<ol><li>1일차(2.5.1.3단계)부터 읽기 절차를 반복하여 4일차 OD600 값을 얻습니다. OD600 측정 전에 마이크로타이터 플레이트 셰이커에서 800rpm으로 플레이트를 20분 동안 흔듭니다.</li>
			<li>이상적으로는 2x 대물렌즈가 있는 도립 현미경에서 각 웰의 지렁이 개체수를 계산하고 스프레드시트에 기록합니다. 카운팅 후 플레이트를 20°C 인큐베이터로 되돌립니다. 참고: 보충 자료에 제공된 채점표의 샘플을 참조하십시오.</li>
			<li>4일차 판독 후 음식 섭취량 측정이 완료됩니다. 필요한 경우 수명 분석을 위해 이 플레이트를 보관하십시오. 참고: 이 프로토콜은 Solis 및 Petrascheck31과 호환됩니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>
3. 음식 섭취 데이터 분석
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig2_v1.jpg"> 그림 2: 설계 및 해석. (A, B) H열에 "웜 없음" 제어 웰이 있는 4개 및 6개 조건에 대한 가능한 플레이트 설계. 이러한 우물은 자기 분해 속도를 결정하는 데 필요합니다. 각 플레이트에는 항상 N2 미처리 대조군 모집단을 참조로 포함하십시오. (C) 웜 수(녹색 상자), 1일과 4일에 대한 두 개의 OD600 측정(주황색 상자), 자가 분해 값(파란색 상자) 및 공식 (2)((OD600 -자가 분해)/X0)을 사용한 평가와 함께 제공된 스프레드시트에 수집된 샘플 데이터입니다. 여기에 표시된 특정 예는 (B)에 표시된 플레이트 디자인을 사용합니다. 약어: OD = 광학 밀도; X0 = 웰당 웜 수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig2large_v1.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
참고: 이 섹션에서는 이 프로토콜의 섹션 2에 있는 음식 섭취 데이터를 분석하는 방법에 대해 설명합니다. 계산할 첫 번째 값은 자기 분해 제어 값입니다. 박테리아는 벌레가 없는 경우에도 액체에서 시간이 지남에 따라 용해됩니다. 이 자기 분해 값은 또한 많은 화학 물질의 영향을 받을 수 있으며 벌레의 음식 섭취량에 비해 상대적으로 크기 때문에 제어해야 합니다. 2.3.1.4 단계에서 설명하고 그림 2A, B의 플레이트 레이아웃에 표시된 것처럼 H행에는 웜을 제외한 동일한 용액이 포함되어 있습니다. 그림 2B에 표시된 플레이트 설정에는 조건당 14개의 웰이 있으며 2개의 각각의 자기 분해 제어 웰이 있습니다(행 H, "웜 없음").
<ol><li>방정식 ( 1)을 사용하여 각 조건에서 웜이 없는 제어 웰에 대한 자기 분해 제어 값을 계산합니다. 웰의 각 반복 그룹에 대해 2.3.1.4단계에서 언급한 것처럼 웜이 없는 제어 웰이 두 개 이상 있는지 확인합니다. 웜이 없는 모든 대조군의 평균을 반복실험군의 자기 분해 값으로 사용합니다. Selfysis = mean(OD600 1일차 - OD600 4일차) (1) 참고: 그림 2B에 표시된 플레이트 설정의 경우 행 H에 있는 두 개의 자기 분해 제어 웰의 평균을 계산하여 6개 그룹 각각에 대해 하나씩 6개의 자체 분해 값을 계산합니다.</li>
	<li>방정식을 사용하여 지렁이 당 음식 섭취량을 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66422/66422equation2v2.jpg">     (2). 참고: 스프레드시트(빨간색 상자, 그림 2C)에 사용된 공식이며 X0는 우물당 웜의 수입니다.</li>
	<li>각 웰에 대해 웜당 먹이 섭취량을 결정한 후 전체 상태에 대한 평균과 표준 편차를 계산합니다. 참고: 그림 2B에 표시된 플레이트 설정의 경우 조건당 14개의 반복 웰이 통계적 비교에 충분합니다.</li>
	<li>각 조건을 치료되지 않은 각각의 N2 대조군 모집단으로 정규화합니다. 수유의 변화를 접힘 변화 또는 N2 수유의 백분율로 표시합니다. 참고: 방정식 (6)에서 OD600/X0의 OD2 절대값이 다른 날에 수행된 실험마다 다를 수 있기 때문에 정규화가 수행됩니다.</li>
</ol>

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 식품 섭취량과 수명을 측정하기 위한 고처리량 분석

<ol>
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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

제시된 프로토콜은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 예쁜꼬마선충(C. elegans) 식품 섭취에 대한 판독값으로 박테리아 제거율을 측정합니다. 대표 결과 섹션의 용량-반응 곡선은 분석이 식품 섭취량을 정량적으로 측정한다는 것을 보여주며, 이는 동위원소 표지 박테리아11을 사용하여 독립적으로 확인된 개념입니다. 이 분석을 사용하여 알려진 인간 대사 부작용이 있는 항정신병 약물과 같은 FDA 승인 약물을 성공적으로 테스트했으며 이러한 약물이 예쁜꼬마선충10,26에서 섭식을 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 분석은 섭식의 유전학 또는 약리학을 연구하는 데 유용하며 신진대사를 연구하기 위한 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구를 위한 새로운 도구를 추가합니다. 이 분석법은 대부분의 다른 유기체에서는 불가능한 확장 가능하고 시간 친화적인 방식으로 섭식을 연구할 수 있는 저비용 방법을 제공합니다. FDA 승인 약물에 대한 우리의 연구는 인간 환자에서 볼 수 있는 많은 부작용이 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서도 관찰됨을 보여주며, 이는 진화론적 보존(evolutionary conservation)을 보여준다 24,26,32.
이 분석은 OD600 측정의 선형 범위 내에서 측정할 수 있는 박테리아의 농도에 의해 제한됩니다. 결과적으로 웜의 수와 분석할 수 있는 박테리아 농도 범위가 제한됩니다. 웜이 너무 많으면 박테리아를 너무 빨리 섭취하여 OD600 에 영향을 미치므로 선형 OD600에서 박테리아 농도를 "먹어치게" 됩니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 박테리아 준비의 가변성은 실험마다 결과가 달라지는 중요한 매개 변수입니다. 우리는 많은 양의 박테리아를 얼리거나 동결 건조된 박테리아를 사용하려고 시도했지만 실패했습니다. 이러한 경우, 자가 분해 속도가 너무 높았거나 박테리아가 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 발달을 늦출 수 있는 품질이었습니다. 그러나 우리의 테스트는 철저하지 않았으므로 이 문제는 해결할 수 있을 수 있습니다.
일반적으로 박테리아의 자가 분해 속도는 제어하기가 가장 까다로우며 상당한 변동성을 유발할 수 있습니다. 우리는 일부 약물이 분석이 식품 섭취량을 확실하게 결정할 수 없는 수준까지 자가 분해율을 증가시킬 수 있음을 발견했습니다. 분석에서 자가 분해 율은 시간이 지남에 따라 증가하기 때문에 성인이 된 지 5일 이후에는 음식 섭취량을 측정하지 않았습니다. 그 나이가 되면 박테리아는 배양 상태에서 ~10일 동안 지속됩니다. 성충 5일 이후의 음식 섭취량을 측정하려면 오래된 박테리아를 씻어내고 새로운 박테리아로 교체해야 합니다.
제시된 분석은 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 수명 분석(31)의 확장입니다. 이 조합을 통해 동일한 개체군의 수명과 음식 섭취량을 측정할 수 있습니다. 여기에 제시된 세균 제거 분석은 세균 자가 분해로 인해 예쁜꼬마선충의 전체 생애에 걸친 음식 섭취량을 결정할 수 없지만, 가장 많은 음식 섭취량을 가진 시기인 성체의 첫 4일에 대한 확실한 데이터를 제공합니다. 특히 저분자 신약 개발의 경우 식품 섭취를 통제하는 것이 필수적입니다. 요약하면, 우리는 제시된 분석이 예쁜꼬마선충 커뮤니티에 유용할 것으로 예상하고 노화 및 수명 연구의 맥락에서 대사를 연구하거나 제어하기 위한 도구 세트를 확장할 것으로 기대합니다.
계획: 
음식 섭취량을 측정하기 전에 몇 가지 사항을 고려해야 합니다.
박테리아 죽이기:
50mL 원뿔형 튜브(160.0kV 및 25.0mA에서 설정된 4시간 동안 900 회색)에 X선을 조사하여 박테리아를 죽입니다. 우리는 방사선 조사를 위해 Rad Source의 RS2000을 사용합니다. 장비에 따라 구체적인 시간과 방사선량은 시설마다 다를 수 있습니다. 박테리아의 완전한 사멸은 성장에 의한 생존자를 감지하기 위해 방사선 조사 후 박테리아를 도금하여 결정해야 합니다. 분석 중 성장을 방지하기 위해 모든 박테리아를 죽이는 것이 필수적이며, 이는 먹이를 과소 평가하거나 심지어 부정적인 먹이 값을 유발할 수 있습니다. 중요한 것은 예쁜꼬마선충(C. elegans)이 여전히 박테리아를 먹을 수 있도록 박테리아를 죽여야 한다는 것입니다. 우리의 경험에 따르면 많은 양의 박테리아를 안정적으로 죽이는 세 가지 방법이 있습니다 : (i) X 선에 의한 조사, (ii) γ선에 의한 조사, (iii) 포름 알데히드29,30의 첨가. 이 세 가지 방법 간의 자기 분해 비율은 비슷하며, 그림 3B에 표시된 실험에 대한 자기 분해 속도 간의 변동 계수는 8%입니다. 우리 손에서 확실하게 작동하지 않는 방법은 UV 조사, 항생제 칵테일, 열 비활성화 및 아지드 나트륨이었습니다. 이러한 방법은 박테리아를 완전히 죽이지 못하거나(UV 및 항생제), 예쁜꼬마선충이 먹지 않는 박테리아를 생성하거나(열), 음식 섭취량을 변화시킵니다(아지드화나트륨).
반복실험 횟수: 
우리의 경험에 비추어 볼 때, 수유의 접힘 변화는 일반적으로 관찰된 변동에 비해 작습니다. 따라서 음식 섭취량의 변화를 측정하려면 여러 번의 반복 우물이 필요합니다. 그림 2A, B는 21개 또는 14개의 복제 웰과 웜이 없는 2개의 자가 분해 제어 웰이 있는 4개 또는 6개의 서로 다른 조건에 맞게 설계된 96웰 플레이트를 보여줍니다. 큰 변동성과 예상되는 상대적으로 작은 변화를 감안할 때 섭식의 0.5-2.5 배 변화가 하한과 상한이 되는 경향이 있습니다. 각 조건에 대해 14-21개의 반복 웰과 다음에 설명된 최소 2개의 자기 분해 제어 웰을 권장합니다. 이러한 반복실험은 섭식을 변경하는 약물에 대한 정량적 용량-반응 곡선을 생성하기에 충분합니다11,26.
자가 분해 제어: 
OD600 은 대부분 입자 크기와 무관하게 용액 내 입자의 수를 측정합니다. 그러나 죽은 박테리아는 용해되어 입자 특성을 잃게 됩니다. 우리는 이것을 자기 분해라고 부르며, 이는 웜이 있는 곳에서 독립적으로 발생하며 웜이 먹지 않고 OD600 측정값을 낮춥니다. 자가 분해는 분석 중에 발생하며 조건당 최소 2개의 웰에서 독립적으로 측정해야 합니다. 이 우물은 벌레가 없다는 점을 제외하고는 동일한 조건 내의 다른 우물과 동일한 처리를받습니다. 우리는 많은 약물이 자가 분해 속도도 변화시킬 수 있다는 것을 발견했습니다. 따라서 각 조건에는 각각의 농도를 가진 독립적인 자기 분해 제어 웰이 필요합니다. 그림 2 는 4개 또는 6개의 조건에 대한 플레이트 설정을 보여주며, 모든 자가 분해 제어 웰이 행 H의 플레이트 하단에 있습니다.
N2 참조 모집단: 
우리는 또한 소비된 박테리아의 절대적인 양이 실험 간에 변동될 수 있으며, 이는 박테리아의 품질과 관련이 있을 가능성이 높다는 점에 주목했습니다. 매번 정확히 같은 방식으로 준비하기 위한 최선의 노력에도 불구하고 변동이 있습니다. 예를 들어, 박테리아는 로그 성장 단계에서 분열 상태에서 수확할 수 있으므로 고정 단계에서 수확된 박테리아보다 크기가 훨씬 큽니다. 따라서 박테리아 크기의 이러한 단순한 차이는 OD600 측정이 크기를 구분하지 않기 때문에 소비되는 박테리아 수와 다른 OD600 값의 변화로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, 실험 그룹이 N2 대조군보다 더 많이 또는 더 적게 먹는지 확인하기 위해 1 또는 100%로 설정된 참조 값으로 사용되는 처리되지 않은 N2 대조군 동물 한 마리를 항상 포함합니다. 이 방법을 사용하면 OD600 값이 달라지더라도 실험 간의 비교가 가능합니다.
시간 간격: 
OD600 값을 사용하여 음식 섭취량을 측정하려면 박테리아 농도가 눈에 띄게 감소해야 합니다. 배양량이 벌레보다 훨씬 크기 때문에 감지 가능한 차이를 만들기 위해 상당한 양의 박테리아를 먹어야 합니다. OD600 값에 대한 선형 범위를 유지하려면 박테리아 농도가 ~1mg/mL에서 10mg/mL 사이로 유지되어야 하므로 이를 검출하기 위해 상당한 양의 박테리아가 사라져야 합니다. 지렁이는 알을 낳기 때문에 L4 후반부터 성충 4일까지 가장 많이 먹습니다. 따라서 이 간격이 이상적입니다. 24 h와 같은 더 짧은 간격은11 번 측정 할 수 있지만 이는 훨씬 더 어렵고 조건 당 ~ 40 웰이 필요합니다. 유충의 먹이 섭취량을 측정하는 또 다른 옵션은 우물당 동물의 수를 두 배로 늘리는 것입니다. 그러나 이 접근 방식의 문제점은 너무 많은 웜이 자랄 때 OD600 판독값에 영향을 미치기 시작한다는 것입니다.
테스트할 약물에 대한 스톡 솔루션: 
세로토닌과 같은 약물이 섭식 조절 능력을 테스트하는 경우 스톡 용액을 준비할 때 다음 사항을 고려하십시오. 일반적으로 수용성 약물을 위해 50x 스톡을 준비하고 각 웰(1:50)에 3μL를 추가하지만 다른 스톡 농도(100x, 300x)도 사용할 수 있습니다. 그러나 약물을 물 이외의 용매(예: DMSO)에 희석하는 경우 최종 농도는 0.5%를 초과해서는 안 됩니다. 용제는 C. elegans에 빠르게 해로워집니다. 따라서 DMSO와 같은 유기용매에 용해된 약물의 원액은 300배 이상이어야 합니다.
살아있는 웜과 죽은 웜 점수 매기기: 
살아있는 동물과 죽은 동물의 결정은 벌레의 움직임을 기반으로 합니다. 강한 빛, 특히 청색광은 동물을 움직이게 하기 때문에 사용됩니다. 또한 우물당 동물 수를 점수화하면 초과 사망이 있는지 알 수 있습니다. 독성 물질 또는 DMSO를 포함한 여러 용매의 고농도(>0.5%)로 인해 초과 사망이 발생할 수 있습니다. 일반적으로 죽은 동물은 1:100(1%) 미만이어야 합니다. 음식이 가라앉고 개체수를 계산하기 어려워지면 마이크로타이터 플레이트 셰이커에서 800rpm으로 30초 동안 플레이트를 흔들 수 있습니다. 수컷 또는 16 마리 이상의 벌레가있는 우물은 무시하십시오 (문제 참조).
발생할 수 있는 문제:
부적절한 쉐이킹: 
액체 매체에서 박테리아는 쉽게 뭉쳐 우물 바닥에 침전할 수 있습니다. 경험에 비추어 볼 때 20분 미만으로 흔들면 박테리아 덩어리가 분해되지 않고 부유하지 않아 부정확한 OD600 측정이 발생할 수 있습니다. 박테리아 덩어리가 있는 상태에서 OD600 측정은 박테리아 농도를 과소 평가합니다. 과도한 쉐이커 설정으로 인해 액체가 실러에 달라붙을 수 있습니다. OD600 판독을 위해 실러를 제거하면 실러에 붙은 액체로 인해 OD600 판독값이 낮아집니다. 씰러에 액체가 있으면 플레이트를 저속(500-1,000rpm)으로 빠르게 돌리고 다시 5분 동안 흔듭니다. 또한 1일 차와 4일 차의 판독값에 대해 명시된 대로 박테리아가 침전되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 흔든 후 10분 이내에 판독해야 합니다.
실험 간 다양한 절대 음식 섭취량: 
박테리아 제제를 표준화하기 위한 최선의 노력에도 불구하고 지렁이의 먹이 섭취에 영향을 미치는 방식으로 차이가 있는 경우가 많습니다. 예를 들어, 분열 상태로 인해 박테리아는 로그 성장 단계에서 수확되었는지 고정 단계에서 수확되었는지 여부에 따라 크기가 다르며 로그 박테리아가 더 큽니다. OD600 측정은 크기를 구분하지 않기 때문에 박테리아를 수확한 단계로 인한 박테리아 크기의 차이로 인해 박테리아 제제 간의 기초 식품 섭취에서 관찰된 명백한 차이가 발생할 수 있습니다. 실험 간에 비교하는 가장 좋은 방법은 항상 처리되지 않은 N2 대조군 모집단을 포함하고 결과를 이 N2 모집단으로 정규화하는 것입니다.
군집 효과: 
이 프로토콜의 박테리아 농도는 OD600을 ~ 72 시간 동안 웰 당 2-16 개의 웜에 대한 선형 범위로 유지하기에 충분합니다. 관심 약물에 따라 16마리 이상의 벌레가 있는 우물은 두 번째 측정 전에 박테리아 농도를 고갈시킬 수 있습니다. 우리는 또한 한 마리의 동물이 있는 우물은 신뢰할 수 없는 경향이 있다는 것을 발견했습니다. 용해 인자는 지렁이 한 마리가 먹는 것보다 더 큽니다. 따라서 lysis factor를 결정하는 데 있어 사소한 오류는 웜이 더 적은 우물에 불균형적으로 영향을 미칩니다.
아래 조건 중 하나가 충족되는 경우 통계 분석에서 웰을 제외하는 것이 좋습니다. 우물 안에는 수컷이 있습니다(수컷과 자웅동체 사이의 음식 섭취량을 비교하는 데이터는 없습니다). 우물에 벌레가 2마리 미만이거나 우물에 16마리 이상의 벌레가 있습니다. 벌레는 두 번째 판독에서 죽습니다. 또는 FUdR이 실패했기 때문에 우물에 자손이 있는 경우. FUdR은 열에 민감하며 37°C의 낮은 온도에서도 비활성화됩니다. FUdR은 항상 실온의 물에서 해동하십시오.
음의 음식 섭취량:
음식 섭취량 값은 때때로 음수이며, 이는 1일차보다 4일차에 더 많은 음식을 암시합니다. 음의 음식 섭취 값은 다음 요인 중 하나를 나타낼 수 있습니다 : 박테리아에 작용하는 약물이 첨가되어 발생할 수있는 높은 자기 분해 율 또는 우물이 오염되어 벌레가 아닌 다른 것이 자라고 있음을 암시 할 수있는 음의 음식 섭취 값. 자가 분해 율은 박테리아가 나이가 들면서 증가합니다. 따라서 일주일 이상 된 박테리아는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 시간이 지남에 따라 침전되는 약물이 추가되어 OD600 값에 영향을 미칩니다. 1일차에 흔들림이 충분하지 않으면 박테리아 덩어리로 인해 OD600 판독값이 낮아질 수 있습니다. 지렁이는 저산소 스트레스를 받았습니다. 이것은 표면 대 공기 비율이 산소 교환을 허용하기에 충분하지 않을 때 발생합니다. 재료에 특정 96웰 플레이트를 사용하고 웰당 150μL(120μL + FUdR 30μL)를 초과 하지 마십시오 . 우물 표면과 지렁이가 사는 바닥 사이의 거리에 따라 산소 농도가 결정됩니다.
제한:
이 분석은 액체 배양으로 제한됩니다. 단단한 접시에서 관찰된 먹이 거동(예: 식품 잔디밭 안팎으로 움직이는 것)은 분석으로 평가할 수 없습니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 노화 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다.  이는 식이 제한, 미토콘드리아 활동 감소 또는 인슐린 신호 감소에 의해 유도되는 대사 매개 장수의 기저에 있는 유전학을 연구하는 강력한 모델이었습니다. 1,2,3,4,5,6,7입니다. 그러나 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 3,8,9,10,11,12,13,14,15라는 작은 크기로 인해 수명의 맥락에서 먹이를 측정하는 것이 어렵다는 것이 입증되었습니다.
섭식은 생존에 필요한 기본적인 생물학적 행동이며, 엄격한 조절은 신진대사 건강, 생식 및 노화 유지의 핵심입니다. 섭식 행동은 신경계와 말초의 여러 신호 전달 경로에 의해 제어되므로 생체 내 16,17,18,19 만 연구 할 수 있습니다. 섭식은 유기체의 에너지 항상성을 관장하는 (i) 에너지 섭취, (ii) 에너지 저장, (iii) 에너지 소비의 세 가지 기둥 중 첫 번째를 나타냅니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 섭식은 주로 인두의 수축 속도에 의해 정의되는 인두 펌핑을 측정하여 조사되었습니다. 이 접근법은 예쁜꼬마선충의 섭식 행동에 대한 중요한 통찰력을 제공했다 3,4,8,12,13,20,21; 그러나 특히 짧은 분 간격으로 측정된 인두 펌핑이 반드시 음식 섭취와 관련이 있는 것은 아닙니다.
음식 섭취는 인두 펌핑 속도뿐만 아니라 먹이 시합 지속 시간과 빈도, 음식 박테리아의 밀도와 같은 매개 변수에 의해서도 결정됩니다. 동물은 매우 높은 인두 펌핑을 가질 수 있지만 먹이를 먹는 시간이 더 짧아서 증가된 속도를 상쇄할 수 있습니다. 또 다른 혼란스러운 요인은 펌핑이 박테리아를 섭취하고 분쇄하지 않을 수 있는 효율성입니다. 인두 펌핑에서 음식 섭취를 분리하는 극단적인 예는 음식물(박테리아)이 없는 상태에서 세로토닌을 추가하는 것입니다. 외인성 세로토닌이 있는 상태에서 동물은 높은 속도로 펌프질을 하지만 박테리아가 없으면 높은 펌핑 속도가 음식 섭취로 이어지지 않습니다 2,6,13,22,23.
여기에 제시된 박테리아 제거 방법은 시간이 지남에 따라 박테리아 농도가 감소함에 따라 개별 우물에서 지렁이 개체군의 먹이 섭취량을 측정합니다(그림 1). 이 접근법은 먹이의 소멸이 음식 섭취량의 척도를 나타내는 다른 종에서 사용되는 것과 유사합니다 10,11,24,25,26,27,28. 원래 간행물에서 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans)에게 15N동위원소 표지 박테리아를 먹이어 음식 섭취량을 측정하는 이 방법을 검증했습니다11. 질량 분석법에 의한 후속 측정은 박테리아의 소멸을 측정하는 것이 동위원소 표지의 발생과 강한 상관 관계가 있음을 보여주었으며, 박테리아가 동물에 실제로 흡수되었음을 드러냈다11. 따라서 우리는 박테리아 제거 분석이 대부분의 상황에서 식품 섭취를 나타낸다고 확신합니다. 이 분석의 목적은 인두 펌핑 분석을 대체하는 것이 아니라 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 섭식 및 신진대사와 노화 및 수명과의 관계를 연구하기 위해 분석 도구 상자에 추가하는 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>RPI</td>
			<td>A40030-0.1</td>
			<td>solvent: EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP176025</td>
			<td>solvent: water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>use to make NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>46-100-RG</td>
			<td>solvent: water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40 &#181;m to remove adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>02101380-CF</td>
			<td>5 mg/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco, Agar, Bacteriological</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214510</td>
			<td>use to make NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>to sterilize worms on L4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24045-1000.0</td>
			<td>open capsule, mix with 1 L of water, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer&#160;</td>
			<td>Laboratory Prepared</td>
			<td></td>
			<td>Store in sterile conditions at room temperature 
			To prepare 1 L: 
			&#160;15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 
			3 g KH2PO4 (FW: 136) 
			&#160;5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) 
			&#160;autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Sealer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>236707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50</td>
			<td colspan="2">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate 96-well&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016056</td>
			<td>use 600 nm filter lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Citrate, 1 M , pH 6</td>
			<td>Laboratory Prepared</td>
			<td></td>
			<td>Store in sterile conditions at room temperature 
			To prepare 1 L: 
			268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 
			26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 
			900 mL of dH2O 
			pH to 6 using 5 M KOH 
			autoclave&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, 1 M , pH 6&#160;</td>
			<td>Laboratory Prepared</td>
			<td></td>
			<td>Store in sterile conditions at room temperature 
			To prepare 1 L: 
			136 g KH2PO4 (FW: 136) 
			900 mL dH2O 
			&#160;pH to 6 using 5 M KOH 
			autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-Basal</td>
			<td>Laboratory Prepared</td>
			<td></td>
			<td>Store in sterile conditions at room temperature 
			To prepare 1 L: 
			5.9 g NaCl (FW: 58) 
			&#160;50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) 
			add 900 mL dH2O 
			autoclave, cool to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-Complete</td>
			<td>Laboratory Prepared</td>
			<td></td>
			<td>Store in sterile conditions at room temperature 
			To prepare 1 L: 
			Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 &#176;C or RT) 
			&#160;10 mL of 1 M potassium citrate 
			&#160;pH 6, 10 mL of trace metal solutions 
			&#160;3 mL of 1 M CaCl2 
			3 mL of 1 M MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serotonin hydrochloride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAB2126309</td>
			<td>used at 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653-5KG</td>
			<td>to make buffers and NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J75856-A1</td>
			<td>12.5 g in 250 mL of water, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer plate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>shaken at 800 rpm, depends on shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Solution&#160;</td>
			<td>Laboratory Prepared</td>
			<td></td>
			<td>Store in sterile conditions at room temperature 
			To prepare 1 L: 
			1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 
			0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 
			&#160;0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 
			0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 
			&#160;0.016 g CuSO4 (FW: 158) 
			autoclave 
			wrap in aluminum foil to keep in the dark</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying food intake in caenorhabditis elegans by measuring bacterial clearance

섭식은 유기체의 성장, 번식 및 생존에 필수적인 생물학적 과정입니다. 이 분석은 노화 또는 신진대사의 유전학을 연구할 때 중요한 매개변수인 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 식품 섭취량을 측정하는 것을 목표로 합니다. 대부분의 종에서 먹이는 제공된 먹이의 양과 주어진 시간 간격 후에 남은 양 사이의 차이를 측정하여 결정됩니다. 여기에 제시된 방법은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 먹이를 결정하기 위해 동일한 전략을 사용합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 먹이 공급원인 박테리아의 양을 측정하여 72시간 이내에 제거합니다. 이 방법은 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하며, 다른 동물 모델에서는 불가능한 속도와 깊이로 식품 섭취를 조절하는 능력에 대해 수백 가지 약물을 스크리닝할 수 있었습니다. 이 분석법의 강점은 먹이와 수명을 동시에 측정하고 먹이의 소실을 직접 측정할 수 있으므로 다른 유기체에 사용되는 것과 동일한 원리를 기반으로 하여 종 간 비교를 용이하게 한다는 것입니다.

Caenorhabditis elegans has been extensively used in aging research. &#160;It has been a powerful model to study the genetics underlying metabolism-mediated longevity induced by dietary restriction, reduced mitochondrial activity, or reduced insulin signaling.1,2,3,4,5,6,7. However, measuring feeding in the context of longevity has been proven difficult for C. elegans due to the small size of the animal3,8,9,10,11,12,13,14,15.
Feeding is a fundamental biological behavior required for survival, and its tight regulation lies at the core of maintaining metabolic health, reproduction, and aging. Feeding behavior is controlled by multiple signaling pathways in both the nervous system and periphery and, thus, can only be studied in vivo16,17,18,19. Feeding represents the first of three pillars: (i) energy intake, (ii) energy storage, and (iii) energy expenditure that govern an organism&#39;s energy homeostasis. Feeding in C. elegans has been chiefly investigated by measuring the pharyngeal pumping, as defined by the rate of contractions of the pharynx. This approach has provided crucial insights into C. elegans&#39; feeding behavior3,4,8,12,13,20,21; however, pharyngeal pumping, especially measured over short intervals of minutes, is not necessarily correlated with food intake.
Food intake is not only determined by the pharyngeal pumping rate but also by parameters such as duration and frequency of feeding bouts and the density of food bacteria. An animal may have a very high pharyngeal pumping, but the length of its feeding bouts may be shorter, offsetting the increased rate. Another confounding factor is the efficiency by which pumping may or may not ingest and grind up bacteria. An extreme example of uncoupling food intake from pharyngeal pumping is the addition of serotonin without any food (bacteria) present. In the presence of exogenous serotonin, animals pump at a high rate, but without bacteria present, the high pumping rate does not lead to food intake2,6,13,22,23.
The bacterial clearance method presented here measures the food intake of worm populations in individual wells as the decline of bacterial concentrations over time (Figure&#160;1). This approach is similar to those used in other species where the disappearance of food represents a measure of food intake10,11,24,25,26,27,28. In the original publication, we validated this method of measuring food intake by feeding C. elegans with 15N isotope-labeled bacteria11. Subsequent measures by mass spectrometry showed that measuring the disappearance of bacteria correlated strongly with the occurrence of isotope labeling, revealing the actual uptake of the bacteria into the animal11. Thus, we are confident that the bacterial clearance assay represents food intake in most circumstances. The assay&#39;s purpose is not to replace the pharyngeal pumping assay but to add to the toolbox of assays to study feeding and metabolism in C. elegans and how it relates to aging and longevity.

저자 스포트라이트: 지독성과 HFpEF의 관계 탐구 

예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

My research focuses on understanding the transcriptional and metabolic pathways underlying drug-induced changes in feeding behavior. I am working to identify drugs that lower food intake and extend lifespan indicative of activating healthy fasting pathways. Using our bacterial clearance assay, we identified two distinct pathways that modulate serotonin-induced food intake and antipsychotic-induced food intake.I am now studying how these pathways relate to feeding in long-lived mutants. This protocol allows researchers to study the relationship between feeding and longevity. The feeding rate is usually characterized by pharyngeal pumping.However, the pumping rate in C.elegans is not necessarily proportional to the amount of food being eaten. When added to those previous assays, this protocol gives a quantifiable amount of food intake per worm population. Our assay allows us to quantitatively modulate feeding using small molecules, and to determine how the induced change alter lifespan simultaneously.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig3_v1.jpg"> 그림 3: 대표 데이터. (A) 그래프는 세로토닌 농도의 함수로서 음식 섭취의 배 변화의 용량-반응 곡선을 보여줍니다. 모든 데이터는 자극되지 않은 기초 음식 섭취가 N2 기초 영양으로 정상화되었음을 보여줍니다. daf-16(mu86) 동물은 세로토닌이 첨가되지 않았을 때 야생형 N2보다 더 많이 먹지만 섭식 조절 능력의 범위는 둔합니다. (B) 그래프는 50μM의 항정신병 약물인 록사핀으로 처리되었지만 X선, γ선 또는 파라포름알데히드에 의해 사멸된 박테리아를 먹인 벌레의 음식 섭취량의 접힘 변화에 대한 바이올린 플롯을 보여줍니다. (C) 그래프는 x축에 표시된 유전자형과 함께 다양한 돌연변이의 음식 섭취량의 접힘 변화에 대한 바이올린 플롯을 보여줍니다. 이 데이터는 exc-4 및 cgr-1 돌연변이가 덜 먹는 반면 srp-6 돌연변이는 더 많이 먹는다는 것을 시사합니다. 별표는 ANOVA 및 Brown-Forsythe-Welch에 의해 결정된 ** p < 0.001, ****p < 0.0001을 나타내며 여러 가설 검정을 고려하여 사후 수정되었습니다. 오차 막대에 ±S.E.M.이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig3large_v1.jpg" target="_blank">표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 1은 이 프로토콜의 전반적인 워크플로우를 보여줍니다. 박테리아를 만드는 것부터 1일차와 4일차에 OD600 판독값을 획득하는 것까지의 전체 과정을 보여줍니다. 또한 인포그래픽은 사용 중인 방법의 특정 단계를 참조합니다. 그림 2A, B 는 논의 섹션에 설명된 자기 분해 율을 계산하는 데 필요한 H행의 "무-웜" 제어 웰을 포함하여 두 가지 가능한 실험 플레이트 레이아웃을 보여줍니다. 우리 실험실의 경험에 따르면, 실험 간에 관찰된 웜의 박테리아 섭취량의 변동성을 설명하기 위해 치료되지 않은 N2 대조군이 조건 중 하나가 필요합니다(토론 참조: 계획 [N2 참조 모집단]).
그림 2C 는 이 프로토콜에서 생성된 데이터를 분석하는 데 사용되는 스프레드시트의 예입니다. 웜 수는 녹색, 자기 분해 는 파란색, 1일 OD600 및 4일 OD600 은 주황색, 웜당 음식 섭취량은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 또한 각 웰의 균주, 약물, 농도, 실험 날짜 및 추가된 기타 처리에 대해 추적됩니다. 사용된 특정 방정식에 대한 자세한 내용은 프로토콜 섹션 3에서 확인할 수 있습니다. 전반적으로 이러한 스프레드시트( 보충 자료로 제공되는 템플릿)는 이 프로토콜에 대한 효율적인 데이터 수집 및 분석을 제공합니다.
그림 3A 는 이 프로토콜을 사용하여 세로토닌이 N2 및 daf-16 돌연변이의 섭식을 조절하는 방법에 대한 용량-반응 곡선에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 실험에서는 세로토닌 용량이 5회 증가하여 기초 음식 섭취량(곡선의 첫 번째 점)으로 인한 접힘 변화를 계산했습니다. 이러한 결과가 강조하듯이 N2 균주는 용량 의존적 방식으로 과식할 수 있습니다. 그러나, daf-16(mu86) 돌연변이의 경우, 기초 섭식이 N2보다 높지만, 돌연변이는 N2 균주와 동일한 용량 의존적 방식으로 세로토닌에 반응할 수 없다. 이 프로토콜을 통해 세로토닌 농도가 용량-반응 곡선을 생성하는 변수 요인이었던 두 균주 간의 섭식 거동을 결정할 수 있습니다. 그림 3B 는 항정신병 약물인 록사핀(Loxapine)으로 처리했지만 X선, γ선 또는 파라포름알데히드에 의해 사멸된 박테리아를 먹인 벌레의 먹이 섭취량을 보여줍니다. 이러한 실험은 병렬로 수행되지 않았으며 차이점은 박테리아를 죽이는 다양한 방법을 나타내는 것이 아니라 실험 간 변동성 때문입니다. 그림 3C 는 일련의 유전적 균주의 음식 섭취량을 보여주며, 두 균주는 감소를 보이고 한 균주는 N2에 비해 섭식 행동의 증가를 보여줍니다. 이러한 프로토콜의 적용을 통해 서로 다른 유전적 배경에 걸쳐 한 농도에서 하나의 약물을 테스트할 수 있습니다. 동일한 약물을 투여했을 때 야생형 N2 대조군과 다른 음식 섭취 반응을 보이는 유전적 배경을 식별하는 데 적합합니다. 동일한 플레이트 설정31에서 음식 섭취량과 수명을 빠르게 선별하기 위해 수명 프로토콜과 짝을 이룰 수 있습니다.
보충 자료: 그림 2C에 표시된 스프레드시트 템플릿. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422.zip" target="_blank">이 자료를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring the Relationship Between Lipotoxicity and HFpEF at JoVE.com

이 프로토콜은 액체 배양에서 박테리아의 청소율을 측정하여 Caenorhabditis elegans 섭식 속도를 정량화하는 분석을 설명합니다.

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

제 연구는 약물로 인한 섭식 행동 변화의 기저에 있는 전사 및 대사 경로를 이해하는 데 중점을 둡니다. 저는 음식 섭취를 줄이고 수명을 연장하는 약물을 찾기 위해 노력하고 있으며, 이는 건강한 단식 경로를 활성화하는 데 도움이 됩니다. 세균 제거 분석을 사용하여 세로토닌 유발 음식 섭취와 항정신병 약물 유발 음식 섭취를 조절하는 두 가지 뚜렷한 경로를 확인했습니다.나는 지금 이러한 경로가 수명이 긴 돌연변이의 먹이와 어떤 관련이 있는지 연구하고 있습니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 섭식과 수명 사이의 관계를 연구할 수 있습니다. 수유 속도는 일반적으로 인두 펌핑이 특징입니다.그러나 예쁜꼬마선충의 펌핑 속도가 반드시 섭취하는 음식의 양에 비례하는 것은 아닙니다. 이전 분석에 추가되면 이 프로토콜은 지렁이 개체군당 정량화 가능한 음식 섭취량을 제공합니다. 당사의 분석을 통해 작은 분자를 사용하여 섭식을 정량적으로 조절하고 유도된 변화가 수명을 동시에 어떻게 변화시키는지 확인할 수 있습니다.

quantifying-food-intake-caenorhabditis-elegans-measuring-bacterial

Research

JoVE Journal

Behavior

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

1.3K 조회수.  The Scripps Research Institute. 제 연구는 약물로 인한 섭식 행동 변화의 기저에 있는 전사 및 대사 경로를 이해하는 데 중점을 둡니다. 저는 음식 섭취를 줄이고 수명을 연장하는 약물을 찾기 위해 노력하고 있으며, 이는 건강한 단식 경로를 활성화하는 데 도움이 됩니다. 세균 제거 분석을 사용하여 세로토닌 유발 음식 섭취와 항정신병 약물 유발 음식 섭취를 조절하는 두 가지 뚜렷한 경로를 확인했습니?...

비디오: 저자 스포트라이트: 지독성과 HFpEF의 관계 탐구 

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

연구

행동분석학

Preparation of OP50 for Caenorhabditis elegans Culture

To begin, inoculate a single OP50 colony in five milliliters of LB with ampicillin and amphotericin B and incubate for approximately six hours at 37 degrees Celsius in a bacterial shaker. Once the culture becomes cloudy, dilute the preinoculum culture of OP50 by 1 to 2, 000 in 250 milliliters of TB with ampicillin and glycerol. Then transfer the OP50 liquid culture into a sterile centrifugation tube.Centrifuge the tube for 15 minutes at 3, 100 G in a tabletop centrifuge at four degrees Celsius. Discard the supernatant and resuspend the OP50 pellet in sterile water before recentrifugation. After the second wash, discard the supernatant and resuspend the OP50 pellet in sterile water to a volume of 50 milliliters.Transfer it to a pre-weighed 50 milliliter conical tube. Centrifuge the tube for 20 minutes to pellet the OP50. At the end of the centrifugation, carefully remove all remaining supernatant, ensuring no water remains in the tube.Calculate the weight of the pellet by subtracting the weight of the empty centrifugation tube from the weight of the centrifugation tube with the pellet. Thoroughly resuspend the OP50 pellet in S-complete buffer to achieve a concentration of 100 milligrams per milliliter. Test the OP50 suspension on an agar plate to check for any contamination.Store the OP50 suspension in S-complete buffer at four degrees Celsius.

예쁜꼬마선충 배양을 위한 OP50 제조

Synchronous Caenorhabditis elegans Culture Preparation and Measurement of Bacterial Clearance for Food Intake Assay

To begin, select a nematode growth medium or NGM plate occupied by starved L1 stage Caenorhabditis elegans larvae. Using one milliliter of sterile water, wash the worms off the plate gently. Aliquot approximately 300 microliters of the worm population onto NGM plates seeded with concentrated OP50.Allow the plates to dry using a plate dryer or a Bunsen burner, and then incubate at 20 degree Celsius until a significant population becomes gravid adults. To collect the worms, wash them off the plate with up to 10 milliliters of sterile water and transfer a warm water mixture into a 15-milliliter conical tube. Allow the worms to settle by gravity at the bottom of the tube for approximately four minutes.Using a small pipette tip, carefully aspirate and discard the supernatant. Then add up to 15 milliliters of sterile water. After the final wash, remove the supernatant and add five milliliters of a freshly prepared solution of bleach and sodium hydroxide.Incubate the worms for five minutes at room temperature while vortexing every minute for at least 10 seconds. Monitor the progress using a dissecting microscope. Once all the adults break open or dissolve, add M9 buffer to neutralize the reaction, bringing the final volume to 15 milliliters.Then centrifuge the tube for two minutes at 1, 300 G.Wash the eggs two more times with 13 milliliters of M9 buffer via centrifugation followed by a single wash with 15 milliliters of S complete buffer. Then centrifuge the eggs for two minutes at 1, 300 G.After centrifugation, aspirate the supernatant and add 10 milliliters of S complete buffer. Rotate the tube gently at room temperature overnight using a mutator or a similar device.Using a dissecting microscope, assess if the worms have hatched. Count the worms in 10-microliter drops of S buffer under the microscope. Prepare a liquid worm mixture with 60 worms per milliliter in S complete medium containing carbenicillin, amphotericin B, and OP50.Add 120 microliters of medium with worms to rows A to G and no worms medium to row H.Then seal the plate with a tape sealer to prevent contamination and evaporation. Incubate the sealed plates for approximately 65 hours at 20 degrees Celsius until the animals become L4 worms. Add 30 microliters of a 0.6-millimolar fluorodeoxyuridine stock solution to each well to sterilize the animals at the L4 stage.Reseal the plate using tape sealers and agitate it for 20 minutes at 800 RPM on a microtiter plate shaker. Return the plates to the 20-degree-Celsius incubator. The following day, add the drug of interest to the day one culture.Reseal the plates with tape sealer and shake for 20 minutes at 800 RPM on a plate shaker. Then after removing the lid and seal, measure the OD600 in a plate reader for the day one measurement. Reseal and return the plates to a 20-degree-Celsius incubator.Using an inverted microscope, preferably with a two times objective, count the worm population in each well and record the numbers in a spreadsheet. After counting, return the plates to the 20-degree-Celsius incubator. The dose response curve's a full change in food intake as a function of serotonin concentration showed that the N2 strain can overeat in a dose-dependent manner.The daf-16 mu86 mutant exhibits higher basal feeding than N2.However, it cannot respond to serotonin in the same dose-dependent manner as the N2 strain. A significant difference was observed in the food intake of worms treated with loxapine but fed with bacteria killed by either x-rays, gamma rays, or paraformaldehyde. Comparison of the food intake of a series of genetic strains showed that exc-4 and cgr-1 mutants eat less while srp-6 mutants eat more.

Synchronous Caenorhabditis elegans Culture Preparation and Measurement of Bacterial Clearance for Food Intake Assay(예쁜꼬마선충 배양 준비 및 식품 섭취 분석을 위한 박테리아 청소율 측정)