동물 모델을 아낌없이 공유해 주신 UT Southwestern Medical Center의 Eric Olson 박사 그룹에 감사를 표합니다. UT Dallas의 D-incubator 회원들이 제공한 모든 건설적인 의견에 감사드립니다. 이 연구는 NIH R00HL148493(Y.D.), R01HL162635(Y.D.) 및 UT Dallas STARS 프로그램(Y.D.)의 지원을 받았습니다.

동물 프로토콜 및 실험은 텍사스 대학교 댈러스 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC #21-03)의 감독하에 승인 및 수행되었습니다. 이 연구에는 출생 후 1일차(P1)의 신생아와 8주 된 성인을 포함한 C57BL6 마우스가 사용되었습니다. 남성과 여성 사이에는 차이가 관찰되지 않았다. 모든 데이터 수집 및 이미지 후처리는 연구 또는 교육용 라이선스가 있는 오픈 소스 소프트웨어 또는 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 리소스는 합당한 요청에 따라 저자가 사용할 수 있습니다.
1. 시료 전처리 및 조직 투명화(6 - 10일)
<ol><li>조직 투명화 절차를 시작하기 전에 조직 투명화 방법에 필요한 재료 표 의 모든 화학 용액을 준비하십시오. 알림: 특히 독성 화학 물질을 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 모든 절차를 수행하십시오.</li>
	<li>CO2가 있는 동물을 P1 및 8주와 같은 원하는 시점에CO2 챔버에 넣어 전체 심장 채취를 위해 안락사시키고 갓 격리된 심장을 0.2M KCl의 실온(RT)에 담가 이완기16에서 정지시킵니다.</li>
	<li>4x 인산염 완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 넣고 밤새 로커에서 부드럽게 교반하여 심장을 고정하여 심장 해부학적 구조를 4°C에서 보존합니다( 표 1 참조). 주의 : PFA는 독성 화학 물질이므로 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>RT에서 1x PBS로 30분, 3x 심장을 씻습니다. 참고: 선택 사항: 아래 설명된 대로 2단계에서 맞춤형 LSM 시스템용 하트 어셈블리를 만들려면 아가로스 겔에 심장을 내장합니다.<ol><li>PBS에 아가로스를 녹여 1% 아가로스 용액을 준비하고 혼합물을 전자레인지에서 완전히 용해될 때까지 가열합니다. 용액을 금형에 붓고 용액이 40°C로 냉각될 때까지 바닥층을 만듭니다.</li>
		<li>심장을 틀에 넣고 굳어질 때까지 아가로스 젤로 틀을 채웁니다. 이미징의 아티팩트를 최소화하기 위해 아가로스 겔의 기포를 제거합니다. 알림: 샘플을 삽입하면 장착 중 심장 해부학에 대한 잠재적인 손상 위험을 줄일 수 있습니다. 주의: 저융점 아가로스를 사용하고 심장을 가열된 아가로스에 직접 두지 마십시오.ample가 고온에 노출될 위험을 완화하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>탈이온수(그림 1B)와 혼합된 메탄올의 구배를 사용하여 심장을 탈수하고 표 1에 설명된 대로 20, 40%, 60%, 80% 및 100%의 순차적 농도를 통해 처리합니다. 완전한 탈수를 보장하기 위해 신선한 100% 메탄올 1x로 반복합니다. 신생아 쥐의 심장을 흔들어 각 메탄올 혼합물에서 1시간 동안 탈수시킵니다. 8주 된 쥐 심장과 쥐 심장의 경우 배양 시간을 2시간으로 조정합니다. 주의: 메탄올은 휘발성, 자극성 및 가연성 화학 물질입니다.</li>
	<li>심장을 신선한 100% 메탄올로 교체하고 4°C에서 10분 동안 식힙니다.</li>
	<li>용액을 교체하고 4°C에서 하룻밤 동안 1:5(30% H2O2-100% 메탄올)의 부피 비율로 메탄올의 5%과산화수소(H2O2)로 심장을 표백하여 색소를 제거합니다. 참고: 색소를 제거하면 광자 흡수를 최소화할 수 있어 아티팩트를 줄이고 이미지 품질을 향상시킬 수 있습니다.</li>
	<li>용액을 교체하고 RT에서 1시간 동안 100% 메탄올로 심장을 배양합니다.</li>
	<li>66% 디클로로메탄(DCM)과 33% 메탄올을 함유한 용액으로 3시간 동안 흔들어 심장을 박리합니다. 이 단계가 끝날 때까지 심장이 바이알 바닥으로 가라앉는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 용액(66% DCM / 33% 메탄올)을 갱신하고 배양 시간(예: 1시간 추가)을 연장하여 완전한 탈지화를 달성합니다. DCM은 휘발성이 높기 때문에 건조를 방지하기 위해 심장을 새로운 용액으로 빠르게 옮깁니다. 주의: DCM은 폴리스티렌과 호환되지 않으므로 실험에 폴리프로필렌 또는 유리 제품을 사용하십시오.</li>
	<li>굴절률 정합을 위해 디벤질 에테르(DBE)를 사용합니다(RI = 1.56). 신생아 쥐 심장의 경우 굴절률 일치 과정에 2일이 소요되며, 8주 된 쥐 심장의 경우 가벼운 흔들림으로 5일이 걸립니다. 새로운 DBE로 교체하고 심장이 완전히 투명해질 때까지 배양 시간을 연장합니다. 주의: DBE는 위험합니다. 피부와의 접촉을 피하십시오.</li>
</ol>2. 샘플 장착(1일)
주: 상용 LSM 시스템을 사용하는 경우 회사에서 제공하는 특정 프로토콜에 따라 심장을 수리하고 2.1 - 2.9단계를 건너뜁니다.
<ol><li>3D 프린터와 Onyx 재료를 사용하여 굴절률 매칭 솔루션(예: 적응형 iDISCO 접근 방식의 DBE)에 내성이 있는 챔버와 홀더를 사용자 정의합니다(그림 2A)16.</li>
	<li>챔버 바닥에 자석을 부착하여 LSM 시스템에서 빠른 연결과 정확한 위치 파악을 용이하게 합니다(그림 2B).</li>
	<li>투명 실리콘 접착제를 사용하여 25mm x 50mm x 0.17mm 커버 유리를 챔버에 부착하고 DBE로 채우고 1일 후 누출 여부를 확인하여 챔버의 방수 무결성을 확인합니다.</li>
	<li>3D 프린터를 사용하여 클램프 홀더를 사용자 정의하고 챔버 내부에 심장 어셈블리를 장착하기 위한 자석을 부착하거나(그림 2C) 심장 어셈블리를 장착하기 위해 아가로스 젤에 바늘을 삽입합니다.</li>
	<li>이전에 보고된 대로 원통형 렌즈와 연속파 다이오드 펌핑 고체(DPSS) 레이저를 사용하여 사내 LSM 시스템 개발을 수행합니다16,22. 532nm의 여기 파장을 사용하여 심근에서 자가형광을 캡처합니다(그림 2D).</li>
	<li>챔버를 6차원 스테이지에 장착하고 챔버가 레이저 전파 방향에 수직인 최적의 위치를 찾습니다.</li>
	<li>마그네틱 클램프 홀더를 사용하여 샘플을 챔버 중앙에 배치하고 홀더를 4차원 전동 스테이지(X, Y, Z 및 Yaw; 그림 2D).</li>
	<li>전동 스테이지를 사용하여 DBE로 채워진 챔버에 심장 어셈블리를 담그고 감지 축(Z 방향)을 따라 스캐닝 범위를 결정합니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 이미지의 단계 크기(S)와 획득 시간(T)을 기반으로 Z 방향을 따라 모터의 스캐닝 속도(V, z)를 결정합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq01.jpg" style="margin: auto;"> 참고: 이미징 시스템의 단계 크기와 축 방향 해상도 간의 관계는 Nyquist-Shannon 샘플링 정리를 따릅니다. 예를 들어, 이전 보고서16에서 나타난 바와 같이, 축 분해능이 2.91 μm인 것을 감안할 때, 스텝 크기는 1 μm로 설정되었다.</li>
	<li>공간 해상도를 확인하고 다양한 깊이에서 잠재적인 불투명도 문제를 최소화하려면 직경이 0.53μm인 형광 비드를 1% 저융점 아가로스 겔에 희석하여 1:1.5 x 105 농도로 이미징하여 시스템의 포인트 확산 함수(PSF)를 측정합니다. FWHM(Full Width at Half Maximum)을 측정하여 전체 샘플에서 PSF를 계산합니다16.</li>
</ol>3. 이미지 스티칭 (4-8 시간)
<ol><li>제한된 FOV를 고려하여 전체 마우스 심장을 덮는 데 필요한 타일 수를 계산합니다. 각 타일의 치수는 LSM 시스템의 FOV에 해당합니다. 예를 들어, 단면적 측정치가 3 x 3.6mm2인 신생아 쥐의 심장은 맞춤형 LSM에서 커버리지를 위해 2 x 2 타일이 필요합니다(그림 3A). 대조적으로, 5 x 8mm2 크기의 8주 된 쥐의 심장은 전체 심장 구조를 덮기 위해 3 x 4 타일이 필요합니다(그림 3B). 참고: 기존 LSM이 심장 전체를 이미징하기 위한 FOV가 제한된 경우 이미지 스티칭이 필요합니다.</li>
	<li>타일 1, 즉 심장의 왼쪽 상단 모서리 타일에서 시작하여 심장 이미지를 캡처합니다(그림 3A-B).</li>
	<li>그림 3C와 같이 전체 심장이 덮일 때까지 연속된 타일 사이에 10% 겹치는 나머지 타일의 이미지를 순차적으로 캡처합니다.</li>
	<li>Fiji23 오픈 소스 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다. Fiji 플러그인 BigStitcher24를 다운로드하여 설치하십시오.</li>
	<li>도움말 메뉴로 이동하여 업데이트를 선택하고 업데이트 사이트 관리를 선택한 다음 BigStitcher를 선택합니다. 그런 다음 Close( 닫기)를 클릭한 다음 Apply changes(변경 사항 적용)를 클릭합니다. 플러그인 다운로드가 완료되면 피지 소프트웨어를 다시 시작하십시오.</li>
	<li>BigStitcher 플러그인을 열고 이미지 파일 디렉토리를 통해 필요한 모든 타일을 가져옵니다. 데이터셋을 HDF5 파일로 저장합니다.</li>
	<li>일반 그리드로 타일 이동을 선택하여 타일을 구성하고, 하트를 이동하는 데 사용되는 패턴을 선택하고, 각 타일 간에 10% 겹침을 선택합니다. 스티칭 마법사(Stitching Wizard) 옵션을 사용하여 타일을 스티칭합니다.</li>
	<li>Image Fusion을 사용하여 스티칭된 데이터를 내보내 tiff 파일을 생성합니다.</li>
</ol>4. 멀티뷰 디콘볼루션(5일)
<ol><li>형광 비드를 사용하여 심장을 따라 다중보기 재구성을 이미지 정합합니다(그림 3D).<ol><li>비스페놀-A 디글리시딜 에테르(D.E.R. 332), 이소포론 디아민, 5-아미노-1,3,3-트리메틸시클로헥산메틸아민(IPDA) 및 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르(D.E.R 736)를 4:1:1의 부피 비율로 혼합하여 수지25 를 제조한다.</li>
		<li>161 x g 에서 5분 동안 10μL의 형광 비드를 원심분리하고 20μL의 메탄올을 추가하여 비드의 저장 용액을 교체합니다. 3번 반복합니다.</li>
		<li>10 단계에서 제조 된 수지에 메탄올 기반 비드 용액을 혼합하여 1 : 1 x 105 비드 농도의 4.1.1 mL 용액을 준비합니다.</li>
		<li>공기 주머니와 기포를 제거하기 위해 진공 챔버에서 3시간 동안 용액을 탈기합니다.</li>
		<li>용액을 실리콘 몰드나 플라스틱 빨대에 붓고 굳을 때까지 2-3일 동안 기다립니다. 수지가 고체가 되기 1일 전, 유리관을 금형 내부에 넣고 유리관이 수지에 부착될 때까지 기다립니다. 유리관으로 금형에서 수지를 제거합니다(그림 3D).</li>
		<li>심장을 유리관에 넣고 DBE로 채운 다음 DBE로 채워진 챔버에 유리관을 장착합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>검출 축(Z축; 그림 3E-F). 참고: 3단계에서 이미지 스티칭을 구현하여 하트 크기가 FOV를 초과하는 경우 개별 이미지 스택을 생성합니다.</li>
	<li>마우스 하트를 Y축을 따라 60° 회전하여 0°, 60°, 120°, 180°, 240°, 300° 등 여러 각도에서 후속 스택을 캡처합니다(그림 3E-F).</li>
	<li>BigStitcher 플러그인을 열고 이미지 파일 디렉토리를 통해 모든 이미지를 가져옵니다. 데이터셋을 HDF5 파일로 저장합니다.</li>
	<li>Detect Interest Points(관심 포인트 감지)를 선택하고 등록할 관심 비드를 수동으로 선택합니다.</li>
	<li>등록을 위해 아핀 변환 모델을 선택합니다. 점 확산 함수를 선택하고 모든 보기에 PSF를 할당합니다.</li>
	<li>Multiview Deconvolution을 클릭하고 반복 유형을 Efficient Bayesian으로 선택합니다. 반복 횟수를 10으로 정의하고26으로 실행합니다.</li>
	<li>이미지 퓨전을 클릭하여 tiff 파일을 내보냅니다. 참고: 멀티뷰 디콘볼루션에 대한 자세한 정보는 다른 보고서 또는 프로토콜 24,27,28에서 찾을 수 있습니다.</li>
</ol>5. 축 방향 스윕 라이트 시트 시스템 하드웨어(1일)
<ol><li>원통형 렌즈(CL)27 (그림 2D)의 푸리에 평면에 전기 조정 가능 렌즈(ETL)를 설치하여 레이저 빔을 축 방향으로 스캔합니다14. 중력으로 인한 파면 왜곡을 방지하기 위해 ETL의 액체 인터페이스가 수평인지 확인하십시오. 빔 디컨터링 및 고차 광학 수차를 최소화하기 위해 ETL을 정밀하게 정렬30.</li>
	<li>워크스테이션에 DAQ 카드를 설치하고 BNC 케이블을 DAQ 카드에 연결하여 카메라 노출과 ETL 스캔을 동기화합니다.</li>
	<li>ETL 드라이버의 하우징을 열고 덮개를 분리합니다(그림 4).</li>
	<li>BNC 케이블의 신호 와이어를 PCB 기판 하단에 표시된 대로 아날로그 in B 핀에 납땜합니다(그림 4).</li>
	<li>BNC 케이블의 접지선을 GND 핀에 납땜합니다. 그런 다음 BNC 케이블의 다른 쪽 끝을 DAQ 카드의 AO(아날로그 출력)에 연결합니다(그림 4).</li>
	<li>ETL 드라이버를 워크스테이션의 USB 포트에 연결하고, 히로세 케이블을 사용하여 드라이버를 ETL에 연결하고, 렌즈 드라이버 컨트롤러 소프트웨어를 설치합니다.</li>
	<li>렌즈 드라이버 컨트롤러 소프트웨어의 작동 모드를 아날로그로 변경하여 DAQ 카드에서 생성된 트리거로 ETL을 제어합니다.</li>
	<li>sCMOS 카메라의 소프트웨어에서 캡처 모드를 외부(라이트 시트)로 전환합니다. 동기화를 돕기 위해 활성 픽셀 스캐닝 방향이 레이저 스캐닝 방향과 수직인지 확인하십시오.</li>
	<li>BNC 케이블을 사용하여 sCMOS 카메라 뒷면의 외부 트리거 포트를 DAQ 카드의 AO에 연결합니다(그림 4).</li>
</ol>6. 축 방향 스윕 광시트 시스템 동기화(7일)
<ol><li>제안된 연구의 경우 최소 10인 허용 가능한 신호 대 배경 비율(SBR)을 기준으로 노출 시간을 정의합니다. SBR이 10 미만인 경우 노출 시간을 늘립니다. 참고: 10에서 50ms 범위의 노출 시간은 이 프로젝트에서 허용 가능한 SBR을 제공합니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 카메라의 노출 시간(E)과 ETL 주파수(f)를 기반으로 이미지의 획득 시간(T)과 라인 간격(L)을 정의합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq03.jpg" style="margin: auto;"> 여기서 P 는 카메라 센서의 픽셀 열 수를 나타냅니다. 레퍼런스의 대표 파라미터는 각각 f = 1Hz, P = 2048, E = 10ms, L = 243μs입니다.</li>
	<li>LabVIEW 프로그램 Trigger Generator.vi 에서 동기화를 위해 사각형 및 삼각형 트리거를 모두 생성합니다(그림 5). 참고: 맞춤형 LabVIEW 프로그램은 합당한 요청에 따라 작성자가 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>이미지에서 빔 웨이스트의 위치를 찾기 위해 1:1 x 103 농도의 1% 저융점 아가로스 겔16에 희석된 마운트 형광 비드(그림 6A).</li>
	<li>프로그램에서 스캐닝 방향을 따라 전압을 변경하여 FOV 아래에서 레이저 빔의 시작점과 끝점을 식별합니다.</li>
	<li>sCMOS 카메라와 ETL을 동기화하려면 X축을 따라 레이저 빔을 스캔하고 Y축을 따라 활성 픽셀을 스캔하여 2D 이미지를 생성합니다(그림 6B). 이미지의 대각선을 따라 더 밝고 선명한 비드는 sCMOS와 ETL 간의 정확한 동기화를 나타냅니다. 참고: ETL과 sCMOS 픽셀 활성화의 스캔 속도 동기화는 이미지 품질에 매우 중요합니다. 다양한 일반적인 비동기 오류가 그림 6C-F에 요약되어 있습니다.</li>
	<li>동기화를 위한 최적의 동기화 매개변수를 결정한 후 sCMOS 카메라를 Z축을 중심으로 90° 회전하여 활성 픽셀 방향을 레이저 스캐닝 방향에 맞춥니다.</li>
	<li>2.10단계를 반복하여 PSF의 FWHM을 측정합니다. 이전 보고서16에 표시된 것과 동일한 방법을 사용하여 ASLM의 평균 측면 및 축 방향 해상도를 각각 2.18μm 및 2.88μm로 사용합니다(그림 7). 참고: 전체 FOV에 걸쳐 균일한 조명과 해상도는 이상적인 조건에서 실현 가능합니다(그림 7A-B). sCMOS 카메라를 사용한 ETL의 비동기 작동과 조명 및 감지의 정렬 불량으로 인해 공간 해상도가 균일하지 않을 수 있습니다(그림 7C-D).</li>
	<li>심장 영상의 경우 시스템을 정렬하고 시스템 동기화를 위한 최적의 매개변수를 결정한 후 2.6-2.9단계를 진행합니다.</li>
</ol>

포괄적인 심장 이미징을 위한 Light-Sheet Microscopy and Tissue Clearing (광시트 현미경 검사) 및 Tissue Clearing(조직 투명화)

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이미징, 계산 및 조직 투명화 방법의 발전은 심장 구조와 기능을 광범위하게 조사할 수 있는 비할 데 없는 기회를 제공했습니다. 이는 온전한 설치류 심장 모델을 사용하여 심장 형태 형성 및 발병 기전에 대한 이해를 심화할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 유사한 접근법40,41,42,43을 사용한 제?...

심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있으며, 주로 성숙한 심근세포의 재생 능력 부족에 기인합니다1. 심장의 복잡한 구조는 심장의 기능에 중요한 역할을 하며 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 심장 구조에 대한 깊은 이해는 심근 경색에 대한 반응으로 심장 형태 형성 및 리모델링의 기본 과정을 설명하는 데 필수적입니다. 최근의 연구 결과에 따르면 신생아 마우스는 부상 후 심장 기능을 회복할 수 있는 반면, 성체 마우스는 이러한 재생 능력이 부족하다2. 이는 마우스 모델의 구조적 및 기능적 이상과 관련된 단서를 조사하기 위한 기반을 마련합니다. 컨포칼 현미경과 같은 기존 이미징 방법은 제한된 침투 깊이, 느린 포인트 스캐닝 방식, 레이저 광에 장기간 노출로 인한 사진 손상 등 기술적 한계가 있습니다. 이는 온전한 심장의 포괄적인 3차원(3D) 이미징을 방해합니다. 이러한 맥락에서 광시트 현미경(LSM)은 고속 이미징, 사진 손상 감소 및 탁월한 광학 절편 기능의 이점을 제공하는 강력한 솔루션으로 부상하고 있습니다 3,4,5. LSM의 고유한 특징은 기존 기술의 한계를 극복할 수 있는 유망한 방법으로 자리 매김하여 심장 발달 및 리모델링 과정에 대한 전례 없는 통찰력을 제공합니다 6,7,8.
이 프로토콜에서는 고급 LSM과 적응된 조직 투명화 접근법9을 결합한 이미징 전략을 도입하여 특정 라벨링 및 기계적 절편 없이 전체 마우스 심장을 이미징할 수 있습니다. 또한, 종래의 LSM 이미징이 멀티뷰 디콘볼루션(multiview deconvolution)10 또는 축방향 스윕 광시트 현미경(ASLM) 기법(11,12,13,14,15)을 통해 향상되어 축 해상도를 향상시킬 수 있음을 제안한다. 또한 이러한 방법 중 하나와 이미지 스티칭을 통합하면 공간 해상도와 시야(FOV) 간의 균형을 효과적으로 극복할 수 있으므로 성인 마우스 심장의 이미징을 발전시킬 수 있습니다. 소수성, 친수성 및 하이드로겔 기반 방법을 포함한 수많은 조직 투명화 접근법의 통합은 전체 심장의 형태를 포착하기 위한 더 깊은 빛 투과를 가능하게 합니다 16,17,18,19.
현재 LSM 시스템에는 여러 가지 투명화 방법이 호환되지만, 목표는 지질을 굴절률과 밀접하게 일치하는 매질로 대체하여 광자 산란을 최소화하고 심장과 같은 조직에서 빛 투과를 향상시키는 것입니다. iDISCO는 대표적인20,21로 선정되었으며 빠른 처리와 높은 투명성으로 인해 이 프로토콜에서 자가형광 이미징에 적합했습니다(그림 1A). 종합적으로, 고급 LSM 접근법과 조직 투명화 기술의 통합은 설치류 심장의 복잡한 심장 해부학을 풀 수 있는 유망한 프레임워크를 제공하며, 심장 형태 형성 및 발병 기전에 대한 이해를 발전시킬 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for tissue clearing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>118184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 332</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 736</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether (DBE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>47392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigStitcher</td>
			<td>H&#246;rl et al.22</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schindelin et al.20</td>
			<td>1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Key components of the customized light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.63 - 6.3X Zoom body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-ZB10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MV PLAPO 1X/0.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0532-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>589&#8201;nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0589-GFF-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC connector</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC-Motor Controller, 4 axes</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>C-884.4DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Cable</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>CAB-6-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Lens Driver</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-E-4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET585-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET645-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel&#160;</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>LAMBDA 10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.20DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.40DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>M-403.4PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI multifunction I/O</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-TLU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet imaging to reveal cardiac structure in rodent hearts

광시트 현미경(LSM)은 심장의 복잡한 3차원(3D) 구조를 이해하는 데 중추적인 역할을 하며, 기본적인 심장 생리학 및 병리학적 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이로써 우리는 마우스 모델에서 심장의 미세 구조를 밝히기 위해 LSM 기술의 개발 및 구현에 대해 탐구합니다. 이 방법론은 맞춤형 LSM 시스템과 조직 투명화 기술을 통합하여 체적 이미징을 위해 심장 조직 내 광 산란을 완화합니다. 기존 LSM과 이미지 스티칭 및 멀티뷰 디콘볼루션 접근 방식을 결합하면 심장 전체를 캡처할 수 있습니다. 축 방향 해상도와 시야(FOV) 사이의 본질적인 균형을 해결하기 위해 ASLM(Axially Swept Light-Sheet Microscopy) 방법을 도입하여 초점에서 벗어난 빛을 최소화하고 전파 방향에 걸쳐 심장을 균일하게 비춥니다. 한편, iDISCO와 같은 조직 투명화 방법은 빛 투과를 향상시켜 심부 구조의 시각화를 용이하게 하고 심장 전체의 심근을 종합적으로 검사할 수 있도록 합니다. 제안된 LSM과 조직 투명화 방법의 조합은 설치류 심장의 심장 구조를 해결하는 연구자에게 유망한 플랫폼을 제공하며, 심장 형태 형성 및 리모델링에 대한 이해를 위한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

Heart failure remains the leading cause of mortality worldwide, primarily due to the lack of regenerative capacity of mature cardiomyocytes1. The intricate architecture of the heart plays a crucial role in its function and provides insights into developmental processes. A profound understanding of cardiac structure is essential for elucidating the fundamental processes of cardiac morphogenesis and remodeling in response to myocardial infarction. Recent progress has demonstrated that neonatal mice can restore cardiac function following injury, while adult mice lack such regenerative capacity2. This establishes a foundation for investigating cues associated with structural and functional abnormalities in mouse models. Traditional imaging methods, such as confocal microscopy, have technical limitations, including restricted penetration depth, slow point-scanning scheme, and photo damage from prolonged exposure to laser light. These hinder comprehensive three-dimensional (3D) imaging of the intact heart. In this context, light-sheet microscopy (LSM) emerges as a powerful solution, offering the advantages of high-speed imaging, reduced photo damage, and exceptional optical sectioning capabilities3,4,5. The unique features of LSM position it as a promising method to overcome the limitations of conventional techniques, providing unprecedented insights into cardiac development and remodeling processes6,7,8.
In this protocol, we introduce an imaging strategy that combines advanced LSM with adapted tissue clearing approaches9, allowing for the imaging of entire mouse hearts without the need for specific labeling and mechanical sectioning. We further propose that conventional LSM imaging can be enhanced through multiview deconvolution10 or axially swept light-sheet microscopy (ASLM) techniques11,12,13,14,15 to improve axial resolution. Additionally, the integration of image stitching with either of these methods can effectively overcome the trade-off between spatial resolution and field of view (FOV), thereby advancing the imaging of adult mouse hearts. The incorporation of numerous tissue clearing approaches, including hydrophobic, hydrophilic, and hydrogel-based methods, enables deeper light penetration for capturing the morphology of the entire heart16,17,18,19.
While multiple clearing methods are compatible with current LSM systems, the goal is to minimize photon scattering and enhance light penetration in tissues, like the heart, by replacing lipids with a medium that closely matches its refractive index. iDISCO was chosen as the representative20,21 and adapted for autofluorescence imaging in this protocol due to its rapid processing and high transparency (Figure 1A). Collectively, the integration of the advanced LSM approach with tissue clearing techniques offers a promising framework to unravel intricate cardiac anatomy in rodent hearts, holding significant potential for advancing our understanding of cardiac morphogenesis and pathogenesis.

저자 스포트라이트: 설치류 심장의 심근 구조를 조사하기 위한 맞춤형 광시트 이미징

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

Our research aims at customizing a light-sheet imaging system to investigate the myocardial structures of the intact rodent heart at a cellular level. We have developed a workflow to explore the intact myocardium with isotropic resolution at the micron level from neonatal to adult rodent hearts. Our study fills a gap in investigating the intricate myocardial microstructures, such as trabeculation, inside the intact ventricles, with high spatial resolution.This imaging strategy provides an entry point to assess microstructure without physical slicing, leading to an enhanced understanding of cardiac development and remodeling. We will concentrate on exploring the structural changes of the myocardium in response to cardiac injury and remodeling.

LSM은 명시야 및 포인트 스캐닝 기술과 같은 다른 광학 이미징 방법과 달리 사진 손상의 위험이 최소화되고 공간 해상도가 높으며 광학 절편이 가능하기 때문에 심장 연구(31,32,33,34,35,36,37)를 촉진하는 것으로 입증되었습니...

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이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

우리의 연구는 세포 수준에서 온전한 설치류 심장의 심근 구조를 조사하기 위해 광시트 이미징 시스템을 맞춤화하는 것을 목표로 합니다. 우리는 신생아에서 성인 설치류 심장에 이르기까지 미크론 수준의 등방성 해상도로 온전한 심근을 탐색하기 위한 워크플로우를 개발했습니다. 우리의 연구는 손상되지 않은 심실 내부의 섬유주와 같은 복잡한 심근 미세 구조를 높은 공간 해상도로 조사하는 데 있어 빈틈을 메웁니다.이 이미징 전략은 물리적 슬라이싱 없이 미세구조를 평가할 수 있는 진입점을 제공하여 심장 발달 및 리모델링에 대한 이해를 향상시킵니다. 우리는 심장 손상에 대한 심근의 구조적 변화를 탐색하고 리모델링하는 데 집중할 것입니다.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

578 조회수.  The University of Texas at Dallas. 우리의 연구는 세포 수준에서 온전한 설치류 심장의 심근 구조를 조사하기 위해 광시트 이미징 시스템을 맞춤화하는 것을 목표로 합니다. 우리는 신생아에서 성인 설치류 심장에 이르기까지 미크론 수준의 등방성 해상도로 온전한 심근을 탐색하기 위한 워크플로우를 개발했습니다. 우리의 연구는 손상되지 않은 심실 내부의 섬유주와 같은 복잡한 심근 미세 구조를 높은 공?...

비디오: 저자 스포트라이트: 설치류 심장의 심근 구조를 조사하기 위한 맞춤형 광시트 이미징

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.