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Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Wesleyan University

DNA &#x9519;&#x914D;&#x4FEE;&#x590D;&#x662F;&#x7531; MutS &#x86CB;&#x767D;&#x542F;&#x52A8;&#x627F;&#x8BA4;&#x7684;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x3002;&#x5176;&#x4E2D; MutS &#x641C;&#x7D22;&#xFF0C;&#x5E76;&#x786E;&#x8BA4;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x5E76;&#x968F;&#x540E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4FEE;&#x590D;&#x4ECD;&#x7136;&#x5F88;&#x5DEE;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x7684;&#x7406;&#x89E3;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x539F;&#x5B50;&#x529B;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x56FE;&#x50CF;&#x7684; MutS-DNA &#x590D;&#x5408;&#x7269;&#xFF0C;&#x52A0;&#x4E0A;&#x751F;&#x5316;&#x5316;&#x9A8C;&#x3001; &#x5206;&#x6790;&#x6765;&#x786E;&#x5B9A;&#x6784;&#x8C61;&#x56FD;&#x5BB6;&#x3001; DNA &#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#xFF0C;&#x548C;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x7684; ATPase &#x6D3B;&#x52A8;&#x548C;&#x5B88;&#x6052;&#x82EF;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;-Xaa-Glu &#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x8BC6;&#x522B;&#x6BCD;&#x9898;&#x4E2D;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x66FF;&#x6362;&#x7684; MutS&#xFF0C;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x5206;&#x5E03;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#xFF0C;&#x5BF9; homoduplex &#x7684; DNA&#xFF0C;&#x5B88;&#x6052; Glu&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x516C;&#x5171;&#x5C4B; &#xE473;&#xFF0C;&#x4FBF;&#x4E8E; MutS &#x8BF1;&#x5BFC; DNA &#x5F2F;&#x66F2;&#xFF0C;&#x800C;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#xFF0C;&#x5728;&#x516C;&#x5171;&#x5C4B; &#xE473; &#x548C; Glu &#x4FC3;&#x8FDB;&#x5C55;&#x5E73;&#x6784;&#x8C61;&#x7684;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#x82EF;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x7684;&#x975E;&#x540C;&#x5BFB;&#x5E38;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5B83;&#x80FD;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x5C55;&#x5E73;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x5F2F;&#x66F2;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x5730;&#x76D8;&#x7684; DNA&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5728;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x5C55;&#x5E73; MutS DNA &#x6784;&#x8C61;&#x7684;&#x5F62;&#x6210;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x662F;&#x7531;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4FEE;&#x590D;&#x5F00;&#x59CB;&#x7684; MutS &#x9700;&#x8981; ATP &#x6C34;&#x89E3;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x89E3;&#x91CA;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D; MutS &#x641C;&#x7D22;&#xFF0C;&#x5E76;&#x8BA4;&#x8BC6;&#x5230;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#xFF0C;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x8868;&#x578B;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x4E2D;&#x7684;&#x82EF;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;-Xaa-&#x8C37;&#x6C28;&#x9178;&#x6BCD;&#x9898;&#x7684;&#x66FF;&#x6362;&#x3002;

MutS &#x5BFB;&#x627E; DNA &#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x548C;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4FEE;&#x590D;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x3002;

DNA mismatch repair is initiated by the recognition of mismatches by MutS proteins. The mechanism by which MutS searches for and recognizes mismatches and subsequently signals repair remains poorly understood. We used single-molecule analyses of atomic force microscopy images of MutS-DNA complexes, coupled with biochemical assays, to determine the distributions of conformational states, the DNA binding affinities, and the ATPase activities of wild type and two mutants of MutS, with alanine substitutions in the conserved Phe-Xaa-Glu mismatch recognition motif. We find that on homoduplex DNA, the conserved Glu, but not the Phe, facilitates MutS-induced DNA bending, whereas at mismatches, both Phe and Glu promote the formation of an unbent conformation. The data reveal an unusual role for the Phe residue in that it promotes the unbending, not bending, of DNA at mismatch sites. In addition, formation of the specific unbent MutS-DNA conformation at mismatches appears to be required for the inhibition of ATP hydrolysis by MutS that signals initiation of repair. These results provide a structural explanation for the mechanism by which MutS searches for and recognizes mismatches and for the observed phenotypes of mutants with substitutions in the Phe-Xaa-Glu motif.

Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.

R&#xE9;paration de m&#xE9;sappariement d&#x26;#39;ADN est initi&#xE9;e par la reconnaissance de m&#xE9;sappariements par les prot&#xE9;ines MutS. Le m&#xE9;canisme par lequel MutS recherches et reconna&#xEE;t les inad&#xE9;quations et la suite de r&#xE9;paration signaux reste mal comprise. Nous avons utilis&#xE9; une seule mol&#xE9;cule analyses de microscopie &#xE0; force atomique images de MutS-ADN complexes, associ&#xE9;es &#xE0; des dosages biochimiques, afin de d&#xE9;terminer les distributions d&#x26;#39;&#xE9;tats conformationnels, les affinit&#xE9;s de liaison d&#x26;#39;ADN, et les activit&#xE9;s ATPase de type sauvage et deux mutants de MutS, avec de l&#x26;#39;alanine substitutions dans la r&#xE9;gion conserv&#xE9;e du Phe-Glu-Xaa motif de reconnaissance d&#xE9;calage. On trouve que sur l&#x26;#39;ADN homoduplex, l&#x26;#39;conserv&#xE9;e Glu, mais pas l&#x26;#39;Phe, facilite l&#x26;#39;ADN induite par flexion MutS, tandis qu&#x26;#39;&#xE0; m&#xE9;sappariements, &#xE0; la fois Phe et Glu favoriser la formation d&#x26;#39;une conformation non pli&#xE9;e. Les donn&#xE9;es r&#xE9;v&#xE8;lent un r&#xF4;le inhabituel pour le r&#xE9;sidu Phe en ce qu&#x26;#39;elle favorise la inflexible, pas de flexion, de l&#x26;#39;ADN &#xE0; des sites non-concordance. En outre, la formation de l&#x26;#39;ADN d&#xE9;pli&#xE9; MutS-conformation sp&#xE9;cifique &#xE0; inad&#xE9;quations semble &#xEA;tre n&#xE9;cessaire pour l&#x26;#39;inhibition de l&#x26;#39;hydrolyse d&#x26;#39;ATP par MutS que des signaux d&#x26;#39;initiation de la r&#xE9;paration. Ces r&#xE9;sultats fournissent une explication structurelle pour le m&#xE9;canisme par lequel MutS recherches et reconna&#xEE;t les divergences et les ph&#xE9;notypes observ&#xE9;s de mutants avec des substitutions dans le motif Phe-Glu-Xaa.

M&#xE9;canisme de MutS la recherche d&#x26;#39;incompatibilit&#xE9;s d&#x26;#39;ADN et de la signalisation de r&#xE9;paration

DNA-Mismatch-Reparatur wird durch die Anerkennung der Unterschiede von MutS Proteine initiiert. Der Mechanismus, durch den MutS sucht und erkennt Konflikte und anschlie&szlig;end reparieren Signale bleibt schlecht, verstanden. Wir bestimmt Einzelmolek&uuml;l-Analysen der Rasterkraft Mikroskopie Bilder von MutS-DNA-komplexen, gepaart mit biochemischen Tests, die Verteilung von Konformations&auml;nderungen Staaten, die DNA-Bindung-Affinit&auml;ten und die ATPase-Aktivit&auml;ten der Wildtyp und zwei Mutanten des MutS, Alanin Ersetzungen in der konservierten Phe-Xaa-Glu Missverh&auml;ltnis Anerkennung Motiv. Wir finden, die auf Homoduplex DNA, die konservierte Glu, sondern nicht der Phe, erleichtert MutS-induzierten DNA biegen, w&auml;hrend bei Mismatches, Phe und Glu f&ouml;rdern die Bildung von eine geradegebogene Konformation. Die Daten zeigen eine ungew&ouml;hnliche Rolle f&uuml;r die Phe-R&uuml;ckst&auml;nde, es die abwickeln f&ouml;rdert, nicht b&uuml;cken, DNA Fehlanpassung Standorte. Bildung von der spezifischen abgewickelter MutS-DNA Konformation bei Missverh&auml;ltnis scheint dar&uuml;ber hinaus f&uuml;r die Hemmung der ATP-Hydrolyse von MutS erforderlich, die Einleitung der Reparatur signalisiert. Diese Ergebnisse liefern eine strukturelle Erkl&auml;rung f&uuml;r den Mechanismus, durch den MutS sucht und erkennt Konflikte, und die beobachteten Ph&auml;notypen von Mutanten mit Ersetzungen in der Phe-Xaa-Glu-Motiv.

Mechanismus des MutS Suche nach DNA Missverh&auml;ltnisse und Signalisierung Reparatur.

Riparazione del DNA mismatch &egrave; iniziata con il riconoscimento di mancate corrispondenze da MutS proteine. Il meccanismo mediante il quale MutS cerca e riconosce mancate corrispondenze e successivamente segnali ripristino rimane scarsamente compreso. Abbiamo usato la singola molecola analisi di immagini di microscopia forza atomica dei complessi DNA-MutS, accoppiati con dosaggi biochimici, per determinare le distribuzioni di stati conformazionali, le affinit&agrave; di legame del DNA e le attivit&agrave; dell&#39;atpasi di tipo selvatico e due mutanti di MutS, con le sostituzioni di alanina nel motivo del riconoscimento di disadattamento Glu-Phe-Xaa conservata. Che troviamo su homoduplex del DNA, il Glu conservata, ma non la Phe, facilita MutS-induced DNA flessione, considerando che al disadattamento, sia Phe e Glu promuovere la formazione di una conformazione raddrizzata. I dati rivelano un ruolo insolito per il residuo di Phe in quanto promuove l&#39;inflessibile, non piegare, del DNA in siti di disadattamento. Inoltre, formazione di specifica conformazione MutS-DNA raddrizzata a mancate corrispondenze sembra essere necessaria per l&#39;inibizione della idrolisi dell&#39;ATP da MutS che segnala l&#39;inizio della riparazione. Questi risultati forniscono una spiegazione strutturale per il meccanismo mediante il quale MutS cerca e riconosce mancate corrispondenze e per i fenotipi osservati dei mutanti con le sostituzioni nel motivo Glu-Phe-Xaa.

Meccanismo di MutS ricerca DNA mismatch e riparazione di segnalazione.

DNA&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x306E;MutS&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x306E;&#x8A8D;&#x8B58;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x958B;&#x59CB;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3092;&#x691C;&#x7D22;&#x3057;&#x306E;MutS&#x3068;&#x306E;&#x4E0D;&#x4E00;&#x81F4;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x3001;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306E;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x3092;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306F;&#x3042;&#x307E;&#x308A;&#x7406;&#x89E3;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x307E;&#x307E;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3;&#x3067;&#x3001;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x72B6;&#x614B;&#x3001;DNA&#x7D50;&#x5408;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3068;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x3068;&#x306E;MutS&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;ATPase&#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x5206;&#x5E03;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3068;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x308B;&#x306E;MutS-DNA&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x539F;&#x5B50;&#x9593;&#x529B;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x753B;&#x50CF;&#x306E;&#x5358;&#x5206;&#x5B50;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;PHE-Xaa&#x306F;-Glu&#x306E;&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x8A8D;&#x8B58;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x306E;&#x7F6E;&#x63DB;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x3067;&#x3001;Phe&#x53CA;&#x3073;Glu&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x304C;&#x66F2;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x4E00;&#x65B9;&#x3001;homoduplex DNA&#x4E0A;&#x306B;&#x3001;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30F3;&#x9178;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;Phe&#x306F;&#x3001;&#x306E;MutS&#x306B;&#x3088;&#x308B;DNA&#x306E;&#x66F2;&#x3052;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x306E;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3067;DNA&#x306E;&#x66F2;&#x3052;&#x306A;&#x3044;&#x66F2;&#x304C;&#x3089;&#x306A;&#x3044;&#x3057;&#x3001;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x70B9;&#x3067;Phe&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x73CD;&#x3057;&#x3044;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x3067;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x66F2;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x306E;MutS-DNA&#x306E;&#x7ACB;&#x4F53;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x306F;&#x3001;&#x4FEE;&#x7406;&#x306E;&#x958B;&#x59CB;&#x3092;&#x901A;&#x77E5;&#x306E;MutS&#x306B;&#x3088;&#x308B;ATP&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x3092;&#x691C;&#x7D22;&#x3057;&#x306E;MutS&#x3068;&#x306E;&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x304A;&#x3088;&#x3073;Phe-Xaa&#x306F;-Glu&#x306E;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3067;&#x7F6E;&#x63DB;&#x3057;&#x305F;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x3092;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x8AAC;&#x660E;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

DNA&#x306E;&#x4E0D;&#x4E00;&#x81F4;&#x3068;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x3092;&#x6C42;&#x3081;&#x3066;&#x306E;MutS&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;

DNA &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xBCF5;&#xAD6C; MutS &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58;&#xC758; &#xC778;&#xC2DD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2DC;&#xC791; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. MutS &#xAC80;&#xC0C9; &#xD558; &#xACE0; &#xC778;&#xC2DD; &#xD558;&#xB294; &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xBC0F; &#xC774;&#xD6C4;&#xC5D0; &#xC2E0;&#xD638; &#xC81C;&#xB300;&#xB85C; &#xB0A8;&#xC544; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC774;&#xD574;. &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC0C1;&#xD0DC;, DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3D9;&#xC9C8;&#xC131; &#xBC0F; &#xC57C;&#xC0DD; &#xD0C0;&#xC785;&#xC758; ATPase &#xD65C;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; Phe-Xaa-Glu &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xC778;&#xC2DD; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC; &#xB300;&#xCCB4;&#xC640; MutS&#xC758; &#xB450; &#xBA85;&#xC758; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xBC30;&#xD3EC;&#xD310;&#xC744; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; MutS DNA &#xB2E8;&#xC9C0;, &#xC0DD; &#xD654; &#xD655; &#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC640; &#xACB0;&#xD569;&#xC758; &#xC6D0;&#xC790; &#xD798; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; homoduplex DNA, &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; Glu &#xCC3E;&#xC744; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xD558;&#xC9C0; Phe &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58;&#xC5D0; Phe&#xC640; Glu &#xBCA4;&#xB4DC;&#xD3B4;&#xAE30; &#xB098; &#xB780;&#xC758; &#xD615;&#xC131;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74; &#xC808;&#xACE1;, MutS &#xC720;&#xBC1C; DNA&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6A9;&#xC774; &#xD558; &#xAC8C;. &#xADF8; &#xD398; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC774; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560; &#xBCA4;&#xB4DC;&#xD3B4;&#xAE30;, &#xC548; &#xBCA4;&#xB529; &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; DNA&#xC758; &#xCD09;&#xC9C4; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xACF5;&#xAC1C;. &#xB610;&#xD55C;, &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xC815; &#xBCA4;&#xB4DC;&#xD3B4;&#xAE30; MutS DNA &#xB098; &#xB780;&#xC758; &#xD615;&#xC131; MutS &#xC218;&#xB9AC; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xC2E0;&#xD638;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; ATP &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xAC83; &#xC778; &#xB4EF;&#xD558;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; Phe-Xaa-Glu &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C;&#xC758; &#xB300;&#xCCB4;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xBBA4;&#xD134;&#xD2B8;&#xC758; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; &#xACE0;&#xAE30;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; MutS &#xAC80;&#xC0C9; &#xD558; &#xACE0; &#xC778;&#xC2DD; &#xD558;&#xB294; &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC124;&#xBA85; &#xC81C;&#xACF5;.

MutS DNA &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC80;&#xC0C9; &#xBC0F; &#xBCF5;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC2E0;&#xD638; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;.

La reparaci&#xF3;n del ADN no coincide se inicia por el reconocimiento de los desajustes por las prote&#xED;nas MutS. El mecanismo por el cual MutS busca y reconoce los desajustes y, posteriormente, de reparaci&#xF3;n de se&#xF1;ales sigue siendo poco conocida. Se utiliz&#xF3; una sola mol&#xE9;cula de an&#xE1;lisis de im&#xE1;genes de microscop&#xED;a de fuerza at&#xF3;mica de los complejos de ADN MutS, junto con ensayos bioqu&#xED;micos para determinar las distribuciones de los estados de conformaci&#xF3;n, las afinidades de uni&#xF3;n a ADN, y las actividades ATPasa de tipo salvaje y dos mutantes de MutS, con alanina sustituciones en la conserva Phe-Glu-Xaa motivo de reconocimiento de desajuste. Se encuentra que el ADN homod&#xFA;plex, la conservadas Glu, pero no la Phe, facilita MutS inducida ADN de flexi&#xF3;n, mientras que a los desajustes, tanto Phe y Glu promover la formaci&#xF3;n de una conformaci&#xF3;n sin doblar. Los datos revelan un papel inusual para el residuo Phe en que promueve la inflexible, no plegado, de ADN en sitios desajuste. Adem&#xE1;s, la formaci&#xF3;n de la espec&#xED;fica sin doblar MutS-ADN conformaci&#xF3;n a desajustes parece ser necesario para la inhibici&#xF3;n de la hidr&#xF3;lisis de ATP por MutS que se&#xF1;ales de iniciaci&#xF3;n de la reparaci&#xF3;n. Estos resultados proporcionan una explicaci&#xF3;n estructural para el mecanismo por el cual MutS b&#xFA;squedas de desajustes y reconoce y para los fenotipos observados de mutantes con sustituciones en el motivo Phe-Xaa-Glu.

Mecanismo de B&#xFA;squeda de MutS desajustes de ADN de reparaci&#xF3;n y se&#xF1;alizaci&#xF3;n

DNA &#x9519;&#x914D;&#x4FEE;&#x590D;&#x7CFB;&#x7EDF; (MMR) &#x6807;&#x8BC6;&#x590D;&#x5236;&#x9519;&#x8BEF;&#x548C;&#x635F;&#x574F; DNA &#x548C;&#x804C;&#x80FD;&#x7EF4;&#x62A4;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7684;&#x5B8C;&#x6574;&#x7684;&#x57FA;&#x5730;&#x3002;MutS &#x6267;&#x884C;&#x67E5;&#x627E;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x7684;&#x78B1;&#x57FA;&#xFF0C;&#x5FAA;&#x73AF;&#x548C;&#x75C5;&#x53D8;&#x548C;&#x53D1;&#x8D77; MMR &#x7684;&#x4EFB;&#x52A1;&#x548C;&#x57FA;&#x672C;&#x95EE;&#x9898;&#xFF0C;&#x5982;&#x4F55;&#x6B64;&#x86CB;&#x767D;&#x76EE;&#x6807;&#x7279;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x4E2D; DNA &#x662F;&#x672A;&#x5F97;&#x5230;&#x89E3;&#x51B3;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x89E3;&#x51B3;&#x8FD9;&#x4E00;&#x95EE;&#x9898;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5BA1;&#x67E5;&#x4E86;&#x5B9E;&#x65F6;&#x917F;&#x9152;&#x9175;&#x6BCD; Msh2 Msh6&#x3001; &#x771F;&#x6838;&#x7684; MutS &#x540C;&#x6E90;&#x4E0E; DNA &#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x53CD;&#x5E94;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x63ED;&#x793A; Msh2 Msh6 &#x7ED1;&#x5B9A;&#x5404;&#x79CD;&#x7AD9;&#x70B9;&#x5728;&#x540C;&#x6837;&#x5FEB;&#x901F;&#x7387; (k &#xFF08;&#x4E0A;&#xFF09; &#x7EA6; 10(7) M(-1) s(-1)) &#x548C;&#x5176;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x6E05;&#x5355;&#x5DEE;&#x79BB;&#x89E3;&#x7387; &#xFF1B;&#x4F8B;&#x5982;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x91CA;&#x653E; 2-Aminopurine:T &#x78B1;&#x57FA;&#x5BF9;&#x5927;&#x7EA6; G:T &#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x6BD4; 90-fold &#x66F4;&#x5FEB;&#x3002;&#x5173;&#x4E8E;&#x91CA;&#x653E; 2-Ap:T &#x7F51;&#x7AD9; Msh2 Msh6 &#x662F;&#x80FD;&#x591F;&#x79FB;&#x52A8;&#x6A2A;&#x5411;&#x4E0A; DNA &#x627E;&#x5230;&#x9644;&#x8FD1;&#x7684; G:T &#x7AD9;&#x70B9;&#x3002;&#x957F;&#x5BFF; Msh2 Msh6.G:T &#x590D;&#x6742;&#x89E6;&#x53D1; MMR &mdash; &mdash; &#x5F62;&#x6210; ATP &#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x4E0B;&#x4E00;&#x6B65; &mdash; &mdash; &#x6BD4;&#x77ED;&#x6682;&#x7684; Msh2 &#x66F4;&#x4E3A;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x5939;-Msh6.2-Ap:T &#x590D;&#x6742;&#x3002;&#x5B88;&#x6052;&#x82EF;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;-X-Glu DNA &#x7ED1;&#x5B9A;&#x6BCD;&#x9898;&#x7684;&#x8C37;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8;&#x7A33;&#x5B9A; Msh2-Msh6 (E339A).2-Ap:T &#x590D;&#x6742;&#x548C;&#x7A81;&#x53D8;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4FE1;&#x53F7; 2-Ap:T &#x4FEE;&#x590D;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; Msh2 Msh6 &#x4FE1;&#x53F7; G:T &#x4FEE;&#x590D;&#x90A3;&#x6837;&#x6709;&#x6548;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x4E00;&#x79CD;&#x76EE;&#x6807;&#x673A;&#x5236;&#x5373; Msh2 Msh6 &#x626B;&#x63CF; DNA&#xFF0C;&#x5BA1;&#x95EE;&#x78B1;&#x57FA;&#x7684;&#x77AC;&#x6001;&#x8054;&#x7CFB;&#x4EBA;&#x548C;&#x6682;&#x505C;&#x7684;&#x6F5C;&#x529B;&#x5728;&#x76EE;&#x6807;&#x7AD9;&#x70B9;&#xFF0C;&#x548C;&#x66F4;&#x957F;&#x65F6;&#x95F4;&#x6682;&#x505C; MMR &#x7684;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x5C31;&#x8D8A;&#x5927;&#x3002;

&#x917F;&#x9152;&#x9175;&#x6BCD; Msh2 Msh6 DNA &#x7ED1;&#x5B9A;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x63ED;&#x793A;&#x76EE;&#x6807;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684; DNA &#x9519;&#x914D;&#x4FEE;&#x590D;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x3002;

The DNA mismatch repair system (MMR) identifies replication errors and damaged bases in DNA and functions to preserve genomic integrity. MutS performs the task of locating mismatched base pairs, loops and lesions and initiating MMR, and the fundamental question of how this protein targets specific sites in DNA is unresolved. To address this question, we examined the interactions between Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6, a eukaryotic MutS homolog, and DNA in real time. The reaction kinetics reveal that Msh2-Msh6 binds a variety of sites at similarly fast rates (k (ON) approximately 10(7) M(-1) s(-1)), and its selectivity manifests in differential dissociation rates; e.g., the protein releases a 2-Aminopurine:T base pair approximately 90-fold faster than a G:T mismatch. On releasing the 2-Ap:T site, Msh2-Msh6 is able to move laterally on DNA to locate a nearby G:T site. The long-lived Msh2-Msh6.G:T complex triggers the next step in MMR--formation of an ATP-bound clamp--more effectively than the short-lived Msh2-Msh6.2-Ap:T complex. Mutation of Glu in the conserved Phe-X-Glu DNA binding motif stabilizes Msh2-Msh6(E339A).2-Ap:T complex, and the mutant can signal 2-Ap:T repair as effectively as wild-type Msh2-Msh6 signals G:T repair. These findings suggest a targeting mechanism whereby Msh2-Msh6 scans DNA, interrogating base pairs by transient contacts and pausing at potential target sites, and the longer the pause the greater the likelihood of MMR.

Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.

Le syst&#xE8;me de r&#xE9;paration de m&#xE9;sappariements de l&#x26;#39;ADN (MMR) identifie les erreurs de r&#xE9;plication et de bases dans l&#x26;#39;ADN endommag&#xE9;s et des fonctions afin de pr&#xE9;server l&#x26;#39;int&#xE9;grit&#xE9; du g&#xE9;nome. MutS effectue la t&#xE2;che de localisation de paires de bases incompatibles, des boucles et des l&#xE9;sions et d&#x26;#39;initier ROR, et la question fondamentale de savoir comment cette prot&#xE9;ine cible des sites sp&#xE9;cifiques dans l&#x26;#39;ADN n&#x26;#39;est pas r&#xE9;solu. Pour r&#xE9;pondre &#xE0; cette question, nous avons examin&#xE9; les interactions entre Saccharomyces cerevisiae Msh2-MSH6, un homologue de MutS eucaryote, l&#x26;#39;ADN et en temps r&#xE9;el. La cin&#xE9;tique de r&#xE9;action montrent que Msh2-MSH6 se lie &#xE0; une vari&#xE9;t&#xE9; de sites &#xE0; taux similaires rapides (k (ON) d&#x26;#39;environ 10 (7) M (-1) s (-1)), et sa s&#xE9;lectivit&#xE9; manifeste dans les taux de dissociation diff&#xE9;rentielles; par exemple, la prot&#xE9;ine lib&#xE8;re un 2-aminopurine: paire de base T environ 90 fois plus rapide qu&#x26;#39;un G: T inad&#xE9;quation. Le 2-lib&#xE9;rant la Ap: site de T, Msh2-MSH6 est capable de se d&#xE9;placer lat&#xE9;ralement sur l&#x26;#39;ADN pour localiser un G &#xE0; proximit&#xE9;: site de T. La longue dur&#xE9;e de vie Msh2-Msh6.G: complexe T d&#xE9;clenche l&#x26;#39;&#xE9;tape suivante dans le ROR - la formation d&#x26;#39;une pince ATP-bound - plus efficacement que la courte dur&#xE9;e Msh2-Msh6.2-Ap: complexe T. La mutation de Glu dans la r&#xE9;gion conserv&#xE9;e du Phe-X-Glu ADN motif de liaison se stabilise Msh2-MSH6 (E339A) 0,2-Ap: T complexe, et le mutant peut signaler 2-O: T r&#xE9;paration aussi efficacement que de type sauvage Msh2-MSH6 signaux G: T r&#xE9;paration. Ces r&#xE9;sultats sugg&#xE8;rent un m&#xE9;canisme de ciblage permettant Msh2-MSH6 analyses ADN, l&#x26;#39;interrogatoire de paires de bases par des contacts transitoires et faire une pause dans les sites cibles potentiels, et plus la pause la plus grande la probabilit&#xE9; de ROR.

Saccharomyces cerevisiae Msh2-MSH6 ADN cin&#xE9;tique de liaison R&#xE9;v&#xE9;ler un m&#xE9;canisme de ciblage des sites pour la r&#xE9;paration des m&#xE9;sappariements de l&#x26;#39;ADN

Das DNA Fehlanpassung Reparatur-System (MMR) Replikationsfehler erkennt und besch&auml;digt Basen in der DNA und welche Funktionen genomische Integrit&auml;t zu wahren. MutS f&uuml;hrt die Aufgabe der Lokalisierung nicht &uuml;bereinstimmende Basenpaare, Loops und L&auml;sionen und initiierende MMR, und die grundlegende Frage, wie dieses Protein Ziele bestimmte Sites in DNA ist ungel&ouml;st. Um diese Frage zu l&ouml;sen, haben wir die Interaktionen zwischen DNA, Saccharomyces Cerevisiae Msh2-Msh6 und einer eukaryotischen MutS Homolog in Echtzeit gepr&uuml;ft. Der Reaktionskinetik offenbaren, dass Msh2-Msh6 bindet eine Vielzahl von Websites ebenso schnelle Daten&uuml;bertragungsraten (k (ON) ca. 7 M(-1) s(-1)), und seine Selektivit&auml;t-Manifeste in differenzielle Dissoziation Preise; Das Protein gibt z. B. eine 2-Aminopurine:T Basenpaare etwa 90-fold schneller als ein G:T-Konflikt. &Uuml;ber die Freigabe der 2-Ap:T Site, Msh2-Msh6 ist seitlich auf DNA zu bewegen, um eine nahe gelegene G:T-Website zu suchen. Der langlebige Msh2-Msh6.G:T-Komplex l&ouml;st den n&auml;chsten Schritt in MMR--Bildung eines ATP gebundene Klemmen--effektiver als die kurzlebige Msh2-Msh6.2-Ap:T komplexe. Mutation glu in der konservierten Phe-X-Glu DNA-Bindung-Motiv stabilisiert Msh2-Msh6 (E339A).2-Ap:T komplexe und den Mutanten k&ouml;nnen 2 signal-Ap:T reparieren so effektiv wie Wildtyp Msh2-Msh6 G:T Reparatur signalisiert. Diese Ergebnisse deuten einen zielenden Mechanismus wobei Msh2-Msh6 scannt DNA, Verh&ouml;ren Basenpaare von Transienten Kontakte und anhalten Potenzial Websites, und je l&auml;nger die Pause desto gr&ouml;&szlig;er ist die Wahrscheinlichkeit von MMR.

Saccharomyces Cerevisiae Msh2-Msh6 DNA verbindliche Kinetik offenbaren einen Mechanismus des Zielens der Standorte f&uuml;r DNA-Mismatch-Reparatur.

Il DNA mismatch repair system (MMR) Identifica errori di replicazione e danneggiato di basi nel DNA e funzioni per preservare l&#39;integrit&agrave; genomica. MutS esegue l&#39;operazione di individuazione non corrispondenti coppie di basi, loop e lesioni e avvio MMR, e la questione fondamentale di come questa proteina obiettivi specifici siti nel DNA &egrave; irrisolto. Per rispondere a questa domanda, abbiamo esaminato le interazioni tra Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6, un omologo MutS eucariotico e DNA in tempo reale. La cinetica di reazione rivela che Msh2-Msh6 associa una variet&agrave; di siti a prezzi altrettanto veloce (k (a) circa 10 M(-1) s(-1)) e i relativi manifesti selettivit&agrave; nei tassi di dissociazione differenziale; ad esempio, la proteina rilascia un 2-coppia di basi Aminopurine:T circa 90-fold pi&ugrave; veloce di una mancata corrispondenza G:T. Il rilascio del 2-Ap:T sito, Msh2-Msh6 &egrave; in grado di muoversi lateralmente sul DNA per individuare un sito G:T nelle vicinanze. Il longevo complesso Msh2-Msh6.G:T innesca il passo successivo nel MMR - formazione di un limite ATP morsetto - pi&ugrave; efficacemente che la breve durata Msh2-Msh6.2-Ap:T complesso. Mutazione di Glu il motivo obbligatorio Glu-Phe-X DNA conservato stabilizza Msh2-Msh6 (E339A). 2-complesso Ap:T e il mutante pu&ograve; segnalare 2-Ap:T efficacemente come wild-type Msh2-Msh6 segnali G:T riparazione riparazione. Questi risultati suggeriscono un meccanismo di targeting per cui Msh2-Msh6 scansioni del DNA, interrogare paia di basi da contatti transitori e fermandosi a potenziale target siti e la pi&ugrave; lunga pausa maggiore sar&agrave; la probabilit&agrave; di MMR.

Saccharomyces cerevisiae cinetica di legame del DNA Msh2-Msh6 rivelano un meccanismo di targeting siti per la riparazione del DNA mismatch.

DNA&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x7CFB;&#xFF08;MMR&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x5B8C;&#x5168;&#x6027;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;DNA&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3067;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30A8;&#x30E9;&#x30FC;&#x3084;&#x640D;&#x50B7;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x305F;&#x5869;&#x57FA;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x306E;MutS&#x304C;&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x5869;&#x57FA;&#x5BFE;&#x3001;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x3084;&#x75C5;&#x5909;&#x3092;&#x691C;&#x7D22;&#x3057;&#x3066;MMR&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30B9;&#x30AF;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3057;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;DNA&#x306B;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x306A;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x6A19;&#x7684;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E;&#x6839;&#x672C;&#x7684;&#x306A;&#x554F;&#x984C;&#x304C;&#x672A;&#x89E3;&#x6C7A;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x554F;&#x984C;&#x306B;&#x5BFE;&#x51E6;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3067;&#x30B5;&#x30C3;&#x30AB;&#x30ED;&#x30DF;&#x30BB;&#x30B9;&#xB7;&#x30BB;&#x30EC;&#x30D3;&#x30B7;&#x30A8;&#xFF08;Saccharomyces cerevisiae&#xFF09;MSH2&#x3001;MSH6&#x3001;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;MutS&#x30DB;&#x30E2;&#x30ED;&#x30B0;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;DNA&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4F8B;&#x3048;&#x3070;&#x3001;&#x3001;&#x53CD;&#x5FDC;&#x901F;&#x5EA6;&#x306F;&#x3001;MSH2&#x3001;MSH6&#x304C;&#xFF08;M&#xFF08;-1&#xFF09;&#x306E;&#xFF08;-1&#xFF09;k&#xFF08;&#x30AA;&#x30F3;&#xFF09;&#x7D04;10&#xFF08;7&#xFF09;&#xFF09;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x901F;&#x3044;&#x901F;&#x5EA6;&#x3067;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x306F;&#x3001;&#x5DEE;&#x52D5;&#x89E3;&#x96E2;&#x901F;&#x5EA6;&#x306B;&#x73FE;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;T&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#xFF1A;G&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x7D04;90&#x500D;&#x9AD8;&#x901F;&#x306B;T&#x5869;&#x57FA;&#x5BFE;&#xFF1A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;2  - &#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x3092;&#x89E3;&#x653E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 2-AP&#x89E3;&#x653E;&#x306B;&#xFF1A;T&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#xFF1A;T&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3001;MSH2&#x3001;MSH6&#x8FD1;&#x304F;&#x306E;G&#x3092;&#x898B;&#x3064;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;DNA&#x4E0A;&#x306E;&#x6A2A;&#x65B9;&#x5411;&#x306B;&#x79FB;&#x52D5;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002; T&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#xFF1A;MSH2-Msh6.G&#x9577;&#x547D; -   -  ATP-&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x305F;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3092;&#x3088;&#x308A;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306B;&#x77ED;&#x547D;&#x306E;MSH2-Msh6.2-AP&#x3088;&#x308A;T&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;MMR&#x306E;&#x6B21;&#x306E;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3092;&#x30C8;&#x30EA;&#x30AC;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; T&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;2-AP&#x3092;&#x901A;&#x77E5;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#xFF1A;T&#x4FEE;&#x7406;&#x306A;&#x3069;&#x3092;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;MSH2&#x3001;MSH6&#x4FE1;&#x53F7;&#x304C;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;PHE-X-Glu&#x306E;DNA&#x7D50;&#x5408;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3067;Glu&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306F;MSH2&#x3001;MSH6&#xFF08;E339A&#xFF09;0.2-AP&#x3092;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;G&#xFF1A;T&#x4FEE;&#x7406;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x77E5;&#x898B;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;DNA MSH2&#x3001;MSH6&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x3001;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x306A;&#x63A5;&#x89E6;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5869;&#x57FA;&#x5BFE;&#x3092;&#x5C0B;&#x554F;&#x3057;&#x3001;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x6A19;&#x7684;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3067;&#x4E00;&#x6642;&#x505C;&#x6B62;&#x3001;&#x9577;&#x3044;&#x505C;&#x6B62;MMR&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x9AD8;&#x304F;&#x3002;

&#x30B5;&#x30C3;&#x30AB;&#x30ED;&#x30DF;&#x30BB;&#x30B9;&#xB7;&#x30BB;&#x30EC;&#x30D3;&#x30B7;&#x30A8;&#xFF08;Saccharomyces cerevisiae&#xFF09;MSH2&#x3001;MSH6 DNA&#x7D50;&#x5408;&#x901F;&#x5EA6;&#x306F;DNA&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x6A5F;&#x69CB;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;

DNA &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; (MMR) &#xBCF5;&#xC81C; &#xC624;&#xB958;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558; &#xACE0; &#xC190;&#xC0C1; &#xB41C; DNA&#xC640; &#xAE30;&#xB2A5; &#xAC8C;&#xB188; &#xBB34;&#xACB0;&#xC131;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xAE30;&#xC5D0;. MutS &#xC77C;&#xCE58; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xB294; &#xAE30;&#xBCF8;&#xC801;&#xC778; &#xC30D;, &#xB8E8;&#xD504; &#xBC0F; &#xBCD1; &#xBCC0; &#xBC0F; &#xC2DC;&#xC791; MMR&#xC744; &#xCC3E;&#xB294; &#xC791;&#xC5C5;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD558; &#xACE0; DNA&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB300;&#xC0C1; &#xD2B9;&#xC815; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xAC00; &#xD574;&#xACB0; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC73C;&#xBA74; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xADFC;&#xBCF8;&#xC801;&#xC778; &#xC9C8;&#xBB38;. &#xC774; &#xBB38;&#xC81C;&#xB97C; &#xD574;&#xACB0; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC5D0;&#xC11C; Saccharomyces cerevisiae Msh2 Msh6, &#xC9C4; &#xD575; MutS &#xCCB4; DNA &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBC18;&#xC751; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xACF5;&#xAC1C; Msh2 Msh6 &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; (k (&#xC5D0;) &#xC57D; 10(7) M(-1) s(-1))&#xC640; &#xCC28;&#xB3D9; &#xBD84;&#xB9AC; &#xC728;;&#xC5D0; &#xD574;&#xB2F9; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xB9E4;&#xB2C8;&#xD398;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xB9C8;&#xCC2C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xB85C; &#xBE60;&#xB978; &#xC18D;&#xB3C4;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC608;&#xB97C; &#xB4E4;&#xC5B4;, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; 2 &#xCD9C;&#xC2DC;-Aminopurine:T &#xC790;&#xB8CC; &#xC30D; &#xC57D; 90-fold G:T &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB354; &#xBE60;&#xB978;. 2 &#xACF5;&#xAC1C;-Ap:T &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; Msh2 Msh6 &#xADFC;&#xCC98; G:T &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xCC3E;&#xC73C;&#xB824;&#xACE0; DNA&#xC5D0; &#xC606;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xB3D9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC218;&#xBA85;&#xC774; &#xAE34; Msh2 Msh6.G:T &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; MMR-ATP &#xBC14;&#xC6B4;&#xB4DC;&#xC758; &#xD615;&#xC131;&#xC758;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E4;&#xC74C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB294; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xAC70; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;-&#xB2E8;&#xAE30; Msh2 &#xBCF4;&#xB2E4;&#xB294; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;-Msh6.2-Ap:T &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C;. Glu&#xC758; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xD398;-X-Glu DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC8FC;&#xC81C;&#xC5D0; &#xBCC0;&#xC774; &#xC548;&#xC815;&#xD654; Msh2 Msh6 (E339A).2-Ap:T &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; 2&#xC758; &#xC2E0;&#xD638;&#xB97C; &#xBCF4;&#xB0BC; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;-Ap:T &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; Msh2 Msh6 &#xC2E0;&#xD638; G:T &#xC218;&#xB9AC; &#xC218;&#xB9AC;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC81C;&#xC548; &#xB300;&#xC0C1; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xBE7C;&#xC557;&#xC544; Msh2 Msh6 &#xAC80;&#xC0AC; DNA, &#xAE30;&#xBCF8;&#xC801;&#xC778; &#xC30D; &#xACFC;&#xB3C4; &#xC811;&#xCD09; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2EC;&#xBB38; &#xD558; &#xACE0; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xC5D0; &#xC77C;&#xC2DC; &#xC911;&#xC9C0; &#xB300;&#xC0C1; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xB354; &#xC774;&#xC0C1; &#xC77C;&#xC2DC; &#xC911;&#xC9C0; MMR&#xC758; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xCEE4;&#xC9D1;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Saccharomyces cerevisiae Msh2 Msh6 DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xACF5;&#xAC1C; DNA &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xBCF5;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558;&#xB294; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;.

La falta de coincidencia de ADN sistema de reparaci&#xF3;n (MMR) identifica los errores de replicaci&#xF3;n y las bases da&#xF1;adas en el ADN y las funciones de preservar la integridad gen&#xF3;mica. MutS lleva a cabo la tarea de localizar pares de bases que no coinciden, los bucles y las lesiones y el inicio de la triple viral y la cuesti&#xF3;n fundamental de c&#xF3;mo esta prote&#xED;na se dirige sitios espec&#xED;ficos en el ADN no se ha resuelto. Para abordar esta cuesti&#xF3;n, hemos examinado las interacciones entre Saccharomyces cerevisiae MSH2, MSH6, un hom&#xF3;logo MutS eucariota, el ADN y en tiempo real. La cin&#xE9;tica de reacci&#xF3;n revelan que MSH2-MSH6 une una variedad de sitios en similarmente altas velocidades (K (ON) de aproximadamente 10 (7) M (-1) s (-1)), y su selectividad se manifiesta en las tasas diferenciales de disociaci&#xF3;n; por ejemplo, la prote&#xED;na libera una aminopurina-2: un par de bases T de aproximadamente 90 veces m&#xE1;s r&#xE1;pido que un G: T desajuste. Al soltar el 2-AP: sitio T, MSH2-MSH6 es capaz de moverse lateralmente en el ADN para localizar una G en las inmediaciones: T sitio. La larga vida MSH2-Msh6.G: Complejo T activa el siguiente paso en la triple v&#xED;rica - formaci&#xF3;n de una abrazadera de la ATP-bound - con m&#xE1;s eficacia que el de breve duraci&#xF3;n-MSH2 Msh6.2-Ap: Complejo T. La mutaci&#xF3;n de Glu en la conserva Phe-X-Glu motivo de uni&#xF3;n al ADN estabiliza MSH2, MSH6 (E339A) 0.2-AP: complejo de T, y el mutante puede ser se&#xF1;al de 2-AP: reparaci&#xF3;n de T la misma eficacia que los de tipo salvaje MSH2, MSH6 se&#xF1;ales G: T reparaci&#xF3;n. Estos hallazgos sugieren un mecanismo de selecci&#xF3;n mediante el cual MSH2, MSH6 exploraciones de ADN, interrogar a los pares de bases por los contactos transitorios y deteni&#xE9;ndose en los sitios de destino potenciales, y cuanto mayor sea la pausa mayor es la probabilidad de MMR.

Saccharomyces cerevisiae MSH2, MSH6 cin&#xE9;tica de uni&#xF3;n de ADN revela un mecanismo de la orientaci&#xF3;n de sitios para la reparaci&#xF3;n del ADN no coincide

Jie Zhai

Molecular Biology and Biochemistry Department

Wesleyan University

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Jie Zhai

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Wesleyan University

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Molecular Biology and Biochemistry Department