a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

University of California, San Francisco - UCSF

&#x4EBA;&#x7C7B;&#x553E;&#x6DB2;&#x7B49;&#x4F53;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x7684;&#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4EA7;&#x751F;&#x4E30;&#x5BCC;&#x80BD;&#x6C47;&#x8F91; &#x300B;&#xFF0C;&#x53CD;&#x6620;&#x4E86;&#x9176;&#x3001; &#x886C;&#x5E95;&#x548C;&#x6291;&#x5236;&#x5242;/&#x6D3B;&#x5316;&#x5242;&#x7684;&#x72EC;&#x7279;&#x7EC4;&#x5408;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6B64; subproteome &#x662F;&#x6709;&#x8DA3;&#x7684;&#x75BE;&#x75C5;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x7684;&#x76F4;&#x63A5;&#x6216;&#x95F4;&#x63A5;&#x5730;&#x6D89;&#x53CA;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x964D;&#x89E3;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x7684;&#x6765;&#x6E90;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#xFF0C;&#x901A;&#x5E38;&#x5F88;&#x4F4E;&#x4E30;&#x5EA6;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#xFF0C;&#x5F88;&#x96BE;&#x8FDB;&#x884C;&#x5206;&#x7C7B;&#x548C;&#x6807;&#x8BC6;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5047;&#x8BBE;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x5E26;&#x504F;&#x89C1;&#x7684;&#x3001; &#x5168;&#x7403;&#x6027;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x76D1;&#x6D4B;&#x7D2F;&#x79EF;&#x7684;&#x80BD;&#x4EA7;&#x54C1;&#x654F;&#x611F;&#x6280;&#x672F;&#x5C06;&#x7528;&#x4E8E;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6837;&#x54C1;&#x4E2D;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x6D3B;&#x52A8;&#x975E;&#x5E38;&#x6709;&#x7528;&#x3002;&#x5EFA;&#x8BBE; 18O &#x540C;&#x4F4D;&#x7D20;&#x4E3A;&#x57FA;&#x7840;&#x7684;&#x529E;&#x6CD5;&#x957F;&#x671F;&#x7528;&#x4E8E;&#x5206;&#x7C7B;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6;&#x9176;&#x7684;&#x8FDB;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5236;&#x8BA2;&#x4E86;&#x4E00;&#x79CD;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x7684;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x5177;&#x4F53;&#x800C;&#x8A00;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x660E;&#x540E; ex &#x4F53;&#x5185;&#x5B75;&#x5316;&#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x816E;&#x817A;&#x553E;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x5F15;&#x5165; 18O &#x60F0;&#x6027;&#x6D53;&#x7F29;&#x6C34;&#x4ECE; C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x7FA7;&#x80BD;&#x4EA7;&#x54C1;&#x3002;&#x968F;&#x540E;&#x80BD;&#x5E8F;&#x5217;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x542F;&#x7528;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x9176;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x4EA7;&#x54C1;&#x79BB;&#x6563;&#x4E9A;&#x7FA4;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x3002;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x8BC1;&#x660E;&#x7684;&#x539F;&#x5219;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6307;&#x7EB9;&#x4E4B;&#x4E00;&#x6765;&#x6807;&#x8BC6;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x6FC0;&#x80BD;&#x91CA;&#x653E;&#x9176;&#x7684;&#x76F8;&#x5173;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x79F0;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6280;&#x672F;&#x53E4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x53E4;&#x5168;&#x7403;&#x8BC4;&#x4F30;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6837;&#x54C1;&#x4E2D;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x5FEB;&#x901F;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x654F;&#x611F;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

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Endogenous proteinases in biological fluids such as human saliva produce a rich peptide repertoire that reflects a unique combination of enzymes, substrates, and inhibitors/activators. Accordingly, this subproteome is an interesting source of biomarkers for disease processes that either directly or indirectly involve proteolysis. However, the relevant proteinases, typically very low abundance molecules, are difficult to classify and identify. We hypothesized that a sensitive technique for monitoring accumulated peptide products in an unbiased, global manner would be very useful for detecting and profiling proteolytic activities in complex biological samples. Building on the longstanding use of 18O isotope-based approaches for the classification of proteolytic and other enzymatic processes we devised a new method for evaluating endogenous proteinases. Specifically, we showed that upon ex vivo incubation endogenous proteinases in human parotid saliva introduced 18O from isotopically enriched water into the C-terminal carboxylic groups of their peptide products. Subsequent peptide sequence determination and inhibitor profiling enabled the detection of discrete subsets of proteolytic products that were generated by different enzymes. As a proof-of-principle we used one of these fingerprints to identify the relevant activity as tissue kallikrein. We termed this technique PALeO. Our results suggest that PALeO is a rapid and highly sensitive method for globally assessing proteinase activities in complex biological samples.

A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.

Les prot&eacute;inases endog&egrave;nes dans les fluides biologiques tels que la salive humaine produisent un r&eacute;pertoire riche de peptide qui refl&egrave;te une combinaison unique d&#39;enzymes, substrats et inhibiteurs/activateurs. En cons&eacute;quence, cette subproteome est une source int&eacute;ressante de biomarqueurs pour des processus morbides qui directement ou indirectement impliquent la prot&eacute;olyse. Toutefois, les prot&eacute;inases pertinentes, des mol&eacute;cules en g&eacute;n&eacute;ral tr&egrave;s peu abondantes, sont difficiles &agrave; classer et identifier. Nous avons &eacute;mis l&#39;hypoth&egrave;se qu&#39;une technique sensible pour la surveillance des produits peptidiques accumul&eacute;s de mani&egrave;re impartiale, globale serait tr&egrave;s utile pour la d&eacute;tection et le profilage des activit&eacute;s prot&eacute;olytiques dans des &eacute;chantillons biologiques complexes. S&#39;appuyant sur l&#39;utilisation de longue date des approches isotope 18O pour la classification des prot&eacute;olytiques et autres proc&eacute;d&eacute;s enzymatiques nous mis au point une nouvelle m&eacute;thode d&#39;&eacute;valuation des prot&eacute;inases endog&egrave;nes. Plus pr&eacute;cis&eacute;ment, nous avons montr&eacute; que sur ex vivo des prot&eacute;inases endog&egrave;nes d&#39;incubation dans la salive parotide humaine introduit 18O de l&#39;eau isotopiquement enrichie en groupes carboxyliques de leurs produits de peptide C-terminal. D&eacute;termination de la s&eacute;quence peptidique ult&eacute;rieures et inhibiteur de profilage activ&eacute; la d&eacute;tection de sous-ensembles discrets de prot&eacute;olytiques produits g&eacute;n&eacute;r&eacute;s par les diff&eacute;rentes enzymes. Comme une preuve de principe, nous avons utilis&eacute; un de ces empreintes digitales pour identifier l&#39;activit&eacute; pertinente comme la kallikr&eacute;ine tissulaire. On appelle cette technique pal&eacute;o. Nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que le Pal&eacute;o est une m&eacute;thode rapide et tr&egrave;s sensible pour &eacute;valuer globalement les activit&eacute;s de prot&eacute;inase dans des &eacute;chantillons biologiques complexes.

Une strat&eacute;gie bas&eacute; sur la spectrom&eacute;trie de masse pour d&eacute;tecter et caract&eacute;riser les activit&eacute;s des prot&eacute;inases endog&egrave;nes dans les &eacute;chantillons biologiques complexes.

Endogene Proteinasen in biologischen Fl&uuml;ssigkeiten, wie menschliche Speichel produzieren ein Reich Peptid-Repertoire, das eine einzigartige Kombination der Enzyme, Substrate und Inhibitoren/Aktivatoren widerspiegelt. Dementsprechend ist diese Subproteome eine interessante Quelle f&uuml;r Biomarker f&uuml;r Krankheitsprozesse, die direkt oder indirekt Proteolyse betreffen. Allerdings sind die relevanten Proteinasen, in der Regel sehr niedrig F&uuml;lle Molek&uuml;le, schwer zu klassifizieren und zu identifizieren. Wir die Hypothese, dass eine sensible Technik zur &Uuml;berwachung von angesammelten Peptid Produkte unvoreingenommene global kosteng&Atilde;&frac14;nstig sehr n&uuml;tzlich w&auml;re f&uuml;r die Erkennung und Profilerstellung proteolytische Aktivit&auml;ten in komplexen biologischen Proben. Aufbauend auf die langj&auml;hrige Verwendung von 18O Isotop-basierte Ans&auml;tze f&uuml;r die Einstufung von proteolytischen und andere enzymatische Prozesse, die wir entwickelt eine neue Methode zur Bewertung von endogener Proteinasen. Insbesondere haben wir gezeigt, dass bei ex Vivo Inkubation endogene Proteinasen im menschlichen Ohrspeicheldr&uuml;senlymphknoten Speichel 18O aus isotopischer angereichertes Wasser in der C-terminalen carboxylic Gruppen ihrer Peptid-Produkte eingef&uuml;hrt. Nachfolgende Peptid Sequenz Entschlossenheit und Inhibitor Profilerstellung aktiviert die Erkennung von diskrete Teilmengen der proteolytische Produkte, die durch verschiedene Enzyme generiert wurden. Als Beweis-des-Prinzip haben wir eines dieser Fingerabdr&uuml;cke identifizieren die relevante T&auml;tigkeit als Gewebe Kallikrein. Wir bezeichnet diese Technik PALeO. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass PALeO eine schnelle und hochempfindlichen Methode zur Bewertung von Global Proteinase Aktivit&auml;ten in komplexen biologischen Proben ist.

Eine Massen-Spektrometrie-basierte Strategie f&uuml;r die Erkennung und Charakterisierung von endogenen Proteinase Aktivit&auml;ten in komplexen biologischen Proben.

Proteinases endogeno in liquidi biologici come la saliva umana di produrre un repertorio ricco del peptide che riflette una combinazione unica di enzimi, substrati e inibitori/attivatori. Di conseguenza, questo subproteome &egrave; una fonte interessante di biomarcatori per i processi di malattia che direttamente o indirettamente coinvolgono proteolisi. Tuttavia, il proteinases pertinenti, molecole di abbondanza in genere molto bassi, sono difficili da classificare e identificare. Abbiamo ipotizzato che una tecnica sensibile per il monitoraggio del peptide accumulato prodotti in maniera imparziale, globale sarebbe molto utile per il rilevamento e analisi attivit&agrave; proteolitica in campioni biologici complessi. Edificio sull&#39;uso pluriennale di approcci basati su isotopo 18O per la classificazione dei proteolitici e altri processi enzimatici abbiamo ideato un nuovo metodo per la valutazione proteinases endogeno. In particolare, abbiamo mostrato che su ex vivo proteinases endogeno di incubazione in 18O saliva umana parotide introdotto dall&#39;acqua isotopicamente arricchito nei gruppi carbossilici dei loro prodotti del peptide C-terminale. Determinazione di sequenza del peptide successive e inibitore della profilatura abilitato il rilevamento di discreti sottoinsiemi di proteolitici prodotti che sono stati generati da diversi enzimi. Come una prova di principio abbiamo utilizzato uno di queste impronte per identificare l&#39;attivit&agrave; rilevante come callicreina tissutale. Abbiamo chiamato questa tecnica PALeO. I nostri risultati suggeriscono che il PALeO &egrave; un metodo rapido e altamente sensibile per valutare globalmente le attivit&agrave; della proteinasi in campioni biologici complessi.

Una strategia di base di spettrometria di massa per individuare e caratterizzare le attivit&agrave; della proteinasi endogeno in campioni biologici complessi.

&#x3072;&#x3068;&#x553E;&#x6DB2;&#x306A;&#x3069;&#x4F53;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x306E;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x9175;&#x7D20;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x57FA;&#x677F;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;/&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3092;&#x53CD;&#x6620;&#x3057;&#x3066;&#x8C4A;&#x304B;&#x306A;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x30EC;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x3053;&#x306E; subproteome &#x306F;&#x76F4;&#x63A5;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x9593;&#x63A5;&#x7684;&#x306B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5206;&#x89E3;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x75C5;&#x6C17;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA; &#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x306E;&#x8208;&#x5473;&#x6DF1;&#x3044;&#x30BD;&#x30FC;&#x30B9;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3001;&#x901A;&#x5E38;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x4F4E;&#x3044;&#x8C4A;&#x304B;&#x306A;&#x5206;&#x5B50;&#x5206;&#x985E;&#x3057;&#x3001;&#x8B58;&#x5225;&#x304C;&#x56F0;&#x96E3;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x516C;&#x5E73;&#x3001;&#x30B0;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D0;&#x30EB;&#x7684;&#x306B;&#x84C4;&#x7A4D;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C3;&#x30C9;&#x88FD;&#x54C1;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x6A5F;&#x5BC6;&#x6280;&#x8853;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x691C;&#x51FA;&#x3057;&#x3001;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x751F;&#x4F53;&#x8A66;&#x6599;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5206;&#x89E3;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x5F79;&#x306B;&#x7ACB;&#x3064;&#x3060;&#x308D;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x4EEE;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;18 O &#x540C;&#x4F4D;&#x4F53;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306E;&#x9577;&#x5E74;&#x306B;&#x308F;&#x305F;&#x308B;&#x4F7F;&#x7528;&#x86CB;&#x767D;&#x5206;&#x89E3;&#x306E;&#x5206;&#x985E;&#x3068;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x8003;&#x6848;&#x3057;&#x305F;&#x4ED6;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5EFA;&#x7269;&#x3002;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x6642;&#x306B; ex vivo &#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30E5;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x5C0E;&#x5165;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x8033;&#x4E0B;&#x306E;&#x553E;&#x6DB2;&#x306E; 18 o &#x540C;&#x4F4D;&#x4F53;&#x6FC3;&#x7E2E;&#x6C34;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C3;&#x30C9;&#x88FD;&#x54C1;&#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x306E;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30F3;&#x9178;&#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306B;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5F8C;&#x7D9A;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C3;&#x30C9; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3068;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x5206;&#x89E3;&#x88FD;&#x54C1;&#x306E;&#x96E2;&#x6563;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x539F;&#x7406;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6211;&#x3005; &#x7D44;&#x7E54;&#x30AB;&#x30EA;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6307;&#x7D0B;&#x306E; 1 &#x3064;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30C6;&#x30AF;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x306E;&#x53E4;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x53E4;&#x30B0;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D0;&#x30EB;&#x306B;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x751F;&#x4F53;&#x8A66;&#x6599;&#x4E2D;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8FC5;&#x901F;&#x304B;&#x3064;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x6CD5;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x691C;&#x51FA;&#x3057;&#x3001;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x751F;&#x4F53;&#x8A66;&#x6599;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x308B;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x6CD5;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x3002;

&#xC778;&#xAC04; &#xCE68; &#xAC19;&#xC740; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xCCB4;&#xC561; &#xB0B4; proteinases &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD6A8;&#xC18C;, &#xAE30;&#xC9C8;, &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;/&#xD65C;&#xC131; &#xC81C;&#xC758; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xACB0;&#xD569;&#xC744; &#xBC18;&#xC601; &#xD558;&#xB294; &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xB808; &#xD37C; &#xD1A0;&#xB9AC;. &#xC774; &#xB530;&#xB77C;&#xC774; subproteome &#xC9C8;&#xBCD1; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C1;&#xC811; &#xB610;&#xB294; &#xAC04;&#xC811;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCA0;&#xC774;&#xC2A4;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xB9C8;&#xCEE4;&#xC758; &#xC7AC;&#xBBF8; &#xC788;&#xB294; &#xC18C;&#xC2A4;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB0AE;&#xC740; &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; &#xBD84;&#xC790; &#xAD00;&#xB828; proteinases&#xB294; &#xBD84;&#xB958; &#xBC0F; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30;&#xAC00; &#xC5B4;&#xB835;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xD3B8;&#xACAC;, &#xAE00;&#xB85C;&#xBC8C; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xCD95;&#xC801; &#xB41C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC81C;&#xD488;&#xC744; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB294; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAE30;&#xC220; &#xAC80;&#xC0C9; &#xBC0F; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC704;&#xD558;&#xC5EC; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC0D8;&#xD50C; &#xD504;&#xB85C; &#xD30C;&#xC77C;&#xB9C1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC720;&#xC6A9;&#xD560; &#xAC83; &#xC774;&#xB77C;&#xACE0; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xC138;&#xC6E0;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xBD84;&#xB958; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xB978; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4; &#xB0B4; proteinases&#xB97C; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xACE0;&#xC548; 18O &#xB3D9;&#xC704; &#xC6D0;&#xC18C; &#xAE30;&#xBC18; &#xC811;&#xADFC;&#xC758; &#xC624;&#xB79C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xAC74;&#xBB3C;. &#xD2B9;&#xD788;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xADF8;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; ex vivo &#xC778;&#xAC04; parotid &#xCE68;&#xC5D0; &#xBD80; &#xD654; &#xC0DD; proteinases &#xB3C4;&#xC785; 18O isotopically &#xB18D;&#xCD95;&#xB41C; &#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC790;&#xC2E0;&#xC758; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC81C;&#xD488;&#xC758; C-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; carboxylic &#xADF8;&#xB8F9;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. &#xD6C4;&#xC18D; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC21C;&#xC11C; &#xACB0;&#xC815; &#xBC0F; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xD504;&#xB85C; &#xD30C;&#xC77C;&#xB9C1; &#xB2E4;&#xB978; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC81C;&#xD488;&#xC758; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xD558;&#xC704; &#xC9D1;&#xD569;&#xC758; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC99D;&#xAC70;&#xC758; &#xC6D0;&#xCE59;&#xC73C;&#xB85C; &#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC870;&#xC9C1; kallikrein&#xC73C;&#xB85C; &#xAD00;&#xB828; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC9C0;&#xBB38; &#xC911; &#xD558;&#xB098;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294;&#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC744; PALeO &#xB418; &#xB098;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; PALeO &#xC138;&#xACC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xACE0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95; &#xC81C;&#xC548;.

&#xAC10;&#xC9C0; &#xD558; &#xACE0; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD65C;&#xB3D9; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xAE30;&#xBC18; &#xC804;&#xB7B5;.

Proteinasas end&oacute;genas en fluidos biol&oacute;gicos como la saliva humana producen un repertorio rico p&eacute;ptido que refleja una combinaci&oacute;n &uacute;nica de enzimas, sustratos y los inhibidores/activadores. Por consiguiente, este subproteomas es una interesante fuente de biomarcadores para procesos de la enfermedad que directa o indirectamente involucran prote&oacute;lisis. Sin embargo, las proteinasas pertinentes, mol&eacute;culas t&iacute;picamente muy baja abundancia, son dif&iacute;ciles de clasificar e identificar. Nuestra hip&oacute;tesis es que una t&eacute;cnica sensible para monitoreo p&eacute;ptido acumulado productos de una manera imparcial, global ser&iacute;a muy &uacute;til para detectar y perfilar las actividades proteol&iacute;ticas en muestras biol&oacute;gicas complejas. Bas&aacute;ndose en el uso desde hace mucho tiempo de enfoques is&oacute;topo 18O para la clasificaci&oacute;n de proteol&iacute;tica y otros procesos enzim&aacute;ticos ideamos un nuevo m&eacute;todo para la evaluaci&oacute;n de proteinasas end&oacute;genos. Espec&iacute;ficamente, nos demostr&oacute; que al ex vivo proteinasas end&oacute;gena de incubaci&oacute;n en humano saliva par&oacute;tida introducido 18O de agua isot&oacute;picamente enriquecido en los grupos carbox&iacute;licos c-terminal de sus productos de p&eacute;ptido. Determinaci&oacute;n de secuencia del p&eacute;ptido posterior y perfiles de inhibidor permitieron la detecci&oacute;n de subconjuntos discretos de productos proteol&iacute;ticos que fueron generados por diferentes enzimas. Como prueba-de-principio utilizamos uno de estas huellas dactilares para identificar la actividad relevante como tejido calicre&iacute;na. Denomina esta t&eacute;cnica PALeO. Nuestros resultados sugieren que el PALeO es un m&eacute;todo r&aacute;pido y altamente sensible para evaluar globalmente las actividades proteinasa en muestras biol&oacute;gicas complejas.

Una estrategia para detectar y caracterizar las actividades de la proteinasa end&oacute;gena en muestras biol&oacute;gicas complejas basadas en espectrometr&iacute;a de masa.

&#x759F;&#x539F;&#x866B;&#x6076;&#x6027;&#x759F;&#x539F;&#x866B;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176; falcipain-2 &#x548C; falcipain-3 &#x964D;&#x4F4E;&#x4E3B;&#x673A;&#x8840;&#x7EA2;&#x86CB;&#x767D;&#x4E3A;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5408;&#x6210;&#x63D0;&#x4F9B;&#x6E38;&#x79BB;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x3002;&#x8840;&#x7EA2;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x5DF2;&#x88AB;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E3A;&#x6709;&#x5E8F;&#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x63D0;&#x51FA;&#x5929;&#x51AC;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#xFF0C;&#x4F46;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x5B8C;&#x5168;&#x963B;&#x6B62;&#x8FD9;&#x4E00;&#x8FDB;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4E5F;&#x53EF;&#x4EE5;&#x542F;&#x52A8;&#x8840;&#x7EA2;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x3002;&#x628A; falcipains &#x7684;&#x5177;&#x4F53;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4E09;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E00;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x968F;&#x673A; P(1)-P(4) &#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x886C;&#x5E95;&#x5E93;&#x3001; falcipain-2 &#x548C; falcipain 3 &#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x5F3A;&#x70C8;&#x504F;&#x597D;&#x4F4E;&#x6D53;&#x7F29;&#x94C0;&#x7684; P(2) &#x4F4D;&#x7F6E;&#x4E0E;&#x5288;&#x88C2;&#x7AD9;&#x70B9;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#xFF0C;&#x5177;&#x6709;&#x91CD;&#x53E0;&#x591A;&#x80BD;&#x8DE8;&#x8D8A; &alpha; &#x548C; &beta; &#x73E0;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x964D;&#x89E3;&#x4F9D;&#x8D56; (18) O &#x8D34;&#x6807;&#x3001; &#x6C34;&#x89E3;&#x5F53;&#x65F6;&#x770B;&#x5F85;&#x5F88;&#x591A;&#x5288;&#x88C2;&#x7F51;&#x7AD9;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E09;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5B8C;&#x597D;&#x7684;&#x8840;&#x7EA2;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E86;&#x65E0;&#x6570;&#x88C2;&#x89E3;&#x4EA7;&#x54C1;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x8840;&#x7EA2;&#x86CB;&#x767D;&#x7531;&#x759F;&#x75BE;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x7684;&#x6C34;&#x89E3;&#x4E0D;&#x662F;&#x4E00;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x6709;&#x5E8F;&#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x4F46;&#x800C;&#x662F;&#x7531;&#x591A;&#x4E2A;&#x7AD9;&#x70B9; falcipains &#x6536;&#x76CA;&#x4E0E;&#x5FEB;&#x901F;&#x88C2;&#x89E3;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;falcipain-2 &#x548C; falcipain-3 P(2) &#x4F4E;&#x6D53;&#x94C0;&#x7684;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x591A;&#x80BD;&#x57FA;&#x8D28;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x4E4B;&#x524D;&#x5DF2;&#x786E;&#x5B9A;&#x4F18;&#x5316;&#x7684;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x663E;&#x793A;&#x5F3A;&#x7684;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x662F;&#x7B26;&#x5408; falcipain-2 &#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x4F5C;&#x7528;&#x548C; falcipain-3 &#x4E2D;&#x7684;&#x6C34;&#x89E3;&#x8840;&#x7EA2;&#x86CB;&#x767D;&#x7531;&#x759F;&#x539F;&#x866B;&#x548C;&#x4E0E;&#x53D1;&#x5C55;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6297;&#x759F;&#x5242;&#x4F18;&#x5316;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3002;

&#x8840;&#x7EA2;&#x86CB;&#x767D;&#x5288;&#x88C2;&#x7684;&#x759F;&#x539F;&#x866B;&#x6076;&#x6027;&#x759F;&#x539F;&#x866B;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176; falcipain-2 &#x548C; falcipain-3 site-specificity&#x3002;

The Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3 degrade host hemoglobin to provide free amino acids for parasite protein synthesis. Hemoglobin hydrolysis has been described as an ordered process initiated by aspartic proteases, but cysteine protease inhibitors completely block the process, suggesting that cysteine proteases can also initiate hemoglobin hydrolysis. To characterize the specific roles of falcipains, we used three approaches. First, using random P(1) - P(4) amino acid substrate libraries, falcipain-2 and falcipain-3 demonstrated strong preference for cleavage sites with Leu at the P(2) position. Second, with overlapping peptides spanning alpha and beta globin and proteolysis-dependent (18)O labeling, hydrolysis was seen at many cleavage sites. Third, with intact hemoglobin, numerous cleavage products were identified. Our results suggest that hemoglobin hydrolysis by malaria parasites is not a highly ordered process, but rather proceeds with rapid cleavage by falcipains at multiple sites. However, falcipain-2 and falcipain-3 show strong specificity for P(2) Leu in small peptide substrates, in agreement with the specificity in optimized small molecule inhibitors that was identified previously. These results are consistent with a principal role of falcipain-2 and falcipain-3 in the hydrolysis of hemoglobin by P. falciparum and with the possibility of developing small molecule inhibitors with optimized specificity as antimalarial agents.

Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.

Les prot&eacute;ases de cyst&eacute;ine Plasmodium falciparum falcipain-2 et falcipain-3 d&eacute;gradent l&#39;h&eacute;moglobine h&ocirc;te pour fournir des acides amin&eacute;s libres pour la synth&egrave;se de prot&eacute;ine parasite. Hydrolyse de l&#39;h&eacute;moglobine a &eacute;t&eacute; d&eacute;crit comme un processus ordonn&eacute; initi&eacute; par aspartique prot&eacute;ases, mais les inhibiteurs de prot&eacute;ase de cyst&eacute;ine bloquent compl&egrave;tement le processus, ce qui sugg&egrave;re que les prot&eacute;ases de cyst&eacute;ine peuvent d&eacute;clencher aussi hydrolyse de l&#39;h&eacute;moglobine. Afin de caract&eacute;riser le r&ocirc;le sp&eacute;cifique de falcipains, nous avons utilis&eacute; trois approches. Tout d&#39;abord, &agrave; l&#39;aide de p al&eacute;atoire - P(4) biblioth&egrave;ques de substrat acide amin&eacute;, falcipain-2 et falcipain-3 a montr&eacute; une pr&eacute;f&eacute;rence marqu&eacute;e pour les sites de clivage avec Leu &agrave; la position p (2). Deuxi&egrave;mement, avec chevauchement des peptides couvrant la globine alpha et b&ecirc;ta et d&eacute;pendante de la prot&eacute;olyse (18) O &eacute;tiquetage, hydrolyse a &eacute;t&eacute; observ&eacute;e dans de nombreux sites de clivage. Troisi&egrave;mement, avec h&eacute;moglobine intact, nombreux produits de clivage ont &eacute;t&eacute; identifi&eacute;s. Nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que l&#39;h&eacute;moglobine hydrolyse par les parasites du paludisme n&#39;est pas un processus tr&egrave;s ordonn&eacute;, mais plut&ocirc;t un produit avec clivage rapid par falcipains sur plusieurs sites. Toutefois, falcipain-2 et falcipain-3 montrent forte sp&eacute;cificit&eacute; pour Leu p (2) dans les substrats de petit peptide, en accord avec la sp&eacute;cificit&eacute; en optimis&eacute;e de petites mol&eacute;cules inhibitrices identifi&eacute;es pr&eacute;c&eacute;demment. Ces r&eacute;sultats sont compatibles avec le r&ocirc;le principal de falcipain-2 et falcipain-3 lors de l&#39;hydrolyse de l&#39;h&eacute;moglobine par P. falciparum et avec la possibilit&eacute; de d&eacute;velopper de petites mol&eacute;cules inhibitrices avec sp&eacute;cificit&eacute; optimis&eacute;e comme agents antipaludiques.

R&eacute;agissaient clivage de l&#39;h&eacute;moglobine des prot&eacute;ases &agrave; cyst&eacute;ine Plasmodium falciparum falcipain-2 et falcipain-3.

Die Plasmodium Falciparum-Cystein-Proteasen Falcipain-2 und Falcipain-3 verschlechtern Host H&auml;moglobin um Freie Aminos&auml;uren f&uuml;r Parasit Proteinsynthese bereitzustellen. Hydrolyse H&auml;moglobin ist als ein geordneter Prozess initiierten Aspartic Proteasen beschrieben worden, aber Cystein-Protease-Inhibitoren vollst&auml;ndig blockieren den Prozess, die darauf hindeutet, dass Cystein-Proteasen auch H&auml;moglobin Hydrolyse initiieren k&ouml;nnen. Um die spezifischen Rollen von Falcipains zu charakterisieren, haben wir drei Ans&auml;tze verwendet. Zuerst verwenden zuf&auml;llige P(1) - P(4) Aminos&auml;ure Substrat Bibliotheken, Falcipain-2 und Falcipain-3 starke Vorliebe f&uuml;r Spaltung Websites mit Leu an der P(2)-Position gezeigt. Zweitens spanning mit &uuml;berlappenden Peptide Alpha- und Beta-Globin und Proteolyse-abh&auml;ngige (18) O beschriften, Hydrolyse an vielen Standorten der Spaltung gesehen wurde. Drittens wurden mit intakten H&auml;moglobin, zahlreiche Zerfallsprodukte identifiziert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass H&auml;moglobin Hydrolyse von Malaria-Parasiten ist kein h&ouml;chst geordneten Prozess, sondern vielmehr f&auml;hrt mit schnellen Spaltung von Falcipains an mehreren Standorten. Allerdings zeigen Falcipain-2 und Falcipain-3 starke Spezifit&auml;t f&uuml;r P(2) Leu in kleinen Peptid-Substrate, im Einvernehmen mit der Besonderheit im optimierten niedermolekularer Hemmer, die zuvor identifiziert wurde. Diese Ergebnisse sind konsistent mit einer Hauptrolle Falcipain-2 und Falcipain-3 bei der Hydrolyse von H&auml;moglobin durch p. Falciparum und mit der M&ouml;glichkeit der Entwicklung niedermolekularer Hemmer mit optimierten Spezifit&auml;t gegen Malaria Agenturt&auml;tigkeit.

H&auml;moglobin Spaltung Site-specificity von der Plasmodium Falciparum-Cystein-Proteasen Falcipain-2 und Falcipain-3.

Il Plasmodium falciparum cisteina proteasi falcipain-2 e 3 falcipain degradano emoglobina host per fornire aminoacidi liberi per la sintesi proteica parassita. Idrolisi dell&#39;emoglobina sono stata descritta come un processo ordinato iniziato da aspartico proteasi, ma gli inibitori della proteasi cisteina bloccare completamente il processo, suggerendo che le proteasi cisteina possono anche avviare idrolisi dell&#39;emoglobina. Per caratterizzare i ruoli specifici di falcipains, abbiamo utilizzato tre approcci. In primo luogo, utilizzando P(1) casuale - P(4) librerie substrato dell&#39;amminoacido e falcipain-2 falcipain-3 hanno dimostrato forte preferenza per i siti di clivaggio con Leu dalla posizione P(2). In secondo luogo, con sovrapposizione di peptidi che abbracciano alfa e beta globina e proteolisi-dipendente (18) O etichettatura, idrolisi &egrave; stato visto in molti siti di clivaggio. In terzo luogo, con emoglobina intatto, sono stati identificati numerosi prodotti di clivaggio. I nostri risultati suggeriscono che l&#39;emoglobina idrolisi di parassiti della malaria non &egrave; un processo altamente ordinato, ma piuttosto procede con rapida scissione da falcipains a pi&ugrave; siti. Tuttavia, falcipain-2 e falcipain-3 mostrano forti specificit&agrave; per P(2) Leu in substrati piccolo peptide, d&#39;intesa con la specificit&agrave; in ottimizzato piccole molecole inibitori identificati in precedenza. Questi risultati sono coerenti con il ruolo principale di falcipain-2 e falcipain-3 nell&#39;idrolisi dell&#39;emoglobina da p. falciparum e con la possibilit&agrave; di sviluppare piccole molecole inibitori con specificit&agrave; ottimizzato come agenti antimalarici.

Site-specificity di scissione dell&#39;emoglobina di il Plasmodium falciparum cisteina proteasi falcipain-2 e falcipain-3.

&#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x539F;&#x866B;&#x71B1;&#x5E2F;&#x71B1;&#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x539F;&#x866B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC; falcipain 2 &#x3068; falcipain 3 &#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x904A;&#x96E2;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x30D8;&#x30E2;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x304C;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D8;&#x30E2;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x30A2;&#x30B9;&#x30D1;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3; &#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x958B;&#x59CB;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x9806;&#x5E8F;&#x7ACB;&#x3066;&#x305F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8A18;&#x8F09;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306F;&#x3001;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x304C;&#x307E;&#x305F;&#x30D8;&#x30E2;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x306E;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3092;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Falcipains &#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;3 &#x3064;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x521D;&#x306B;&#x3001;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x306A; P(1) - &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066; P(4) &#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x57FA;&#x677F;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x3001;falcipain 2&#x3001;falcipain 3 &#x5B9F;&#x8A3C;&#x958B;&#x88C2;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; &#x30EB;&#x30FC; P(2) &#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3068;&#x306E;&#x5F37;&#x3044;&#x5E0C;&#x671B;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x306B;&#x3001;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E;&#x91CD;&#x8907;&#x3068; &alpha; &#x3068; &beta; &#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x3068;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5206;&#x89E3;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3059;&#x308B; &#xFF08;18 O &#x306E;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x958B;&#x88C2;&#x306E;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x898B;&#x3089;&#x308C;&#x305F;) &#x306B; &#x3002;&#x7B2C;&#x4E09;&#x306B;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x306E;&#x30D8;&#x30E2;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x3068;&#x591A;&#x6570;&#x306E;&#x958B;&#x88C2;&#x88FD;&#x54C1;&#x8B58;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x30D8;&#x30E2;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x793A;&#x5506;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x767A;&#x6CE8;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3067;&#x306F;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x304C;&#x3001;&#x3080;&#x3057;&#x308D;&#x3068;&#x6025;&#x901F;&#x306A;&#x958B;&#x88C2;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067; falcipains &#x306B;&#x9032;&#x307F;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;falcipain 2 &#x3068; falcipain 3 P(2) &#x30EB;&#x30FC;&#x5C0F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x57FA;&#x677F;&#x3001;&#x4EE5;&#x524D;&#x8B58;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3067;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x3068;&#x306E;&#x5408;&#x610F;&#x3067;&#x306E;&#x5F37;&#x3044;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;falcipain 2 &#x306E;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B7;&#x30D1;&#x30EB;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x4E00;&#x8CAB;&#x3057;&#x3066; falcipain-3 &#x306E;&#x30D8;&#x30E2;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x6297;&#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x85AC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3068;&#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x30D8;&#x30E2;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x5375;&#x5272;&#x30AD;&#x30E1;&#x30E9;&#x30D6;&#x30ED;&#x30E2; &#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x539F;&#x866B;&#x71B1;&#x5E2F;&#x71B1;&#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x539F;&#x866B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC; falcipain 2 &#x3068; falcipain 3 &#x306E;&#x3002;

&#xD504;&#xB85C; Plasmodium falciparum &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778; &#xD14C;&#xC544; falcipain 2, falcipain 3 &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBB34;&#xB8CC; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD5E4;&#xBAA8;&#xAE00;&#xB85C;&#xBE48; &#xC800;&#xD558;. &#xD5E4;&#xBAA8;&#xAE00;&#xB85C;&#xBE48; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; aspartic &#xD504;&#xB85C; &#xD14C;&#xC544; &#xC81C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2DC;&#xC791; &#xC21C;&#xC11C;&#xAC00; &#xC9C0;&#xC815; &#xB41C; &#xACFC;&#xC815;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD588;&#xB2E4; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778; &#xD504;&#xB85C; &#xD14C;&#xC544; &#xC81C; &#xC800; &#xD574;&#xC81C; &#xC644;&#xC804;&#xD788; &#xCC28;&#xB2E8; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778; &#xD504;&#xB85C; &#xD14C;&#xC544; &#xD5E4;&#xBAA8;&#xAE00;&#xB85C;&#xBE48; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574;&#xB97C; &#xC2DC;&#xC791;&#xD560; &#xC218;&#xB3C4; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Falcipains&#xC758; &#xD2B9;&#xC815; &#xC5ED;&#xD560;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131;, &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0;. &#xCCAB;&#xC9F8;, &#xC784;&#xC758; P(1)-&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; P(4) &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xAE30;&#xD310; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;, falcipain 2, falcipain 3 &#xC2DC;&#xC5F0; &#xBD84;&#xC5F4; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; P(2) &#xC704;&#xCE58;&#xC5D0; &#xB808; &#xC6B0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC15;&#xD55C; &#xC120;&#xD638;. &#xB458;&#xC9F8;, &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xACB9;&#xCE58;&#xB294; &#xC54C;&#xD30C; &#xBC0F; beta globin &#xBC0F; &#xBCA0;&#xC774;&#xC2A4; &#xC885;&#xC18D; (18) O &#xB77C;&#xBCA8;&#xB9C1;&#xAC00; &#xC218; &#xBD84;&#xD574; &#xBD84;&#xC5F4; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF8;&#xB294; &#xC2A4;&#xD328;&#xB2DD;. &#xC14B;&#xC9F8;, &#xADF8;&#xB300;&#xB85C; &#xD5E4;&#xBAA8;&#xAE00;&#xB85C;&#xBE48;&#xACFC; &#xC218;&#xB9CE;&#xC740; &#xBD84;&#xC5F4; &#xC81C;&#xD488; &#xD655;&#xC778; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xD5E4;&#xBAA8;&#xAE00;&#xB85C;&#xBE48; &#xC81C;&#xC548; &#xB9D0;&#xB77C;&#xB9AC;&#xC544; &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xB418;&#xC9C0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC815;&#xB82C; &#xB41C; &#xACFC;&#xC815; &#xC774;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC624;&#xD788;&#xB824; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xAC8C; &#xBD84;&#xC5F4; &#xB41C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; falcipains&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC9C4;&#xD589; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, falcipain 2, falcipain 3 &#xBBF8;&#xB9AC; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xB294; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; &#xC791;&#xC740; &#xBD84;&#xC790; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; &#xB3D9;&#xC758; &#xC791;&#xC740; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0;&#xC11C; P(2) &#xB808; &#xC6B0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC15;&#xD55C; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC77C;&#xCE58; falcipain 2&#xC758; &#xC8FC; &#xC5ED;&#xD560; &#xBC0F; falcipain-3, P. falciparum &#xBC0F; &#xB9D0;&#xB77C;&#xB9AC;&#xC544; &#xC694;&#xC6D0;&#xC73C;&#xB85C; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC73C;&#xB85C; &#xC791;&#xC740; &#xBD84;&#xC790; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC758; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xACFC; &#xD568;&#xAED8; &#xD5E4;&#xBAA8;&#xAE00;&#xB85C;&#xBE48;&#xC758; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574;&#xC5D0;&#xC11C;.

&#xD504;&#xB85C; Plasmodium falciparum &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778; &#xD14C;&#xC544; falcipain 2, falcipain 3&#xC758; &#xD5E4;&#xBAA8;&#xAE00;&#xB85C;&#xBE48; &#xBD84;&#xC5F4; site-specificity.

Las proteasas de ciste&iacute;na Plasmodium falciparum falcipain-2 y falcipain-3 degradar&aacute;n hemoglobina de anfitri&oacute;n para proporcionar amino&aacute;cidos para la s&iacute;ntesis de prote&iacute;nas del par&aacute;sito. Hidr&oacute;lisis de la hemoglobina se ha descrito como un ordenado proceso iniciado por asp&aacute;rtico proteasas, pero inhibidores de la proteasa de ciste&iacute;na bloquean completamente el proceso, lo que sugiere que las proteasas de ciste&iacute;na tambi&eacute;n pueden iniciar la hidr&oacute;lisis de la hemoglobina. Para caracterizar los roles espec&iacute;ficos de falcipains, se utilizaron tres enfoques. En primer lugar, utilizando al azar p - P(4) del amino&aacute;cido sustrato bibliotecas, falcipain-2 y falcipain-3 demostraron gran preferencia por los sitios de escote con Leu en la posici&oacute;n de P(2). En segundo lugar, con la superposici&oacute;n de p&eacute;ptidos que abarca globina alfa y beta y prote&oacute;lisis dependiente (18) O etiquetado, hidr&oacute;lisis fue visto en muchos sitios de escote. En tercer lugar, con la hemoglobina intacta, se identificaron numerosos productos de escote. Nuestros resultados sugieren que la hemoglobina hidr&oacute;lisis por par&aacute;sitos de la malaria no es un proceso muy ordenado, pero m&aacute;s bien procede con escote r&aacute;pido por falcipains en m&uacute;ltiples sitios. Sin embargo, falcipain-2 y falcipain-3 muestran especificidad fuerte para P(2) Leu en sustratos de p&eacute;ptido peque&ntilde;o, de acuerdo con la especificidad en inhibidores de la mol&eacute;cula peque&ntilde;a optimizado que fue identificado previamente. Estos resultados son consistentes con un papel principal de falcipain-2 y falcipain-3 en la hidr&oacute;lisis de la hemoglobina por p. falciparum y con la posibilidad de desarrollar inhibidores de mol&eacute;cula peque&ntilde;a con especificidad optimizado como agentes antimal&aacute;ricos.

Especificidad del escote de hemoglobina de las proteasas de ciste&iacute;na Plasmodium falciparum falcipain-2 y falcipain-3.

&#x6838;&#x67E5;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x7684;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x5177;&#x4F53;&#x3001; &#x5B9A;&#x91CF;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x68C0;&#x6D4B;&#x76EE;&#x6807;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4F18;&#x5316;&#x548C;&#x8D8A;&#x6765;&#x8D8A;&#x591A;&#x5730;&#x88AB;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x5728;&#x53D1;&#x73B0;&#x4E2D;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x6B65;&#x9AA4;&#x7BA1;&#x9053;&#xFF0C;&#x6865;&#x6881;&#x4E0D;&#x5E26;&#x504F;&#x89C1;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x53D1;&#x73B0;&#x5230;&#x4E34;&#x5E8A;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x4E2A;&#x522B;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x8868;&#x660E;&#x591A;&#x53CD;&#x5E94;&#x76D1;&#x6D4B; (MRM) &#x52A0;&#x540C;&#x4F4D;&#x7D20;&#x7A00;&#x91CA;&#x8D28;&#x8C31;&#x6CD5;&#x53EF;&#x4EE5;&#x91CF;&#x5316;&#x5019;&#x9009;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x8840;&#x6D46;&#x3001; &#x91CD;&#x590D;&#x6027;&#x548C;&#x53EF;&#x8F6C;&#x8BA9;&#x6027;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5316;&#x9A8C;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x4E4B;&#x95F4;&#x6CA1;&#x6709;&#x8BC1;&#x660E;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0; multilaboratory &#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x8BC4;&#x4F30;&#x53EF;&#x91CD;&#x590D;&#x6027;&#x3001; &#x6062;&#x590D;&#x3001; &#x7EBF;&#x6027;&#x52A8;&#x6001;&#x8303;&#x56F4;&#x548C;&#x9650;&#x5236;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#xFF0C;&#x57FA;&#x4E8E; MRM &#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x7531; NCI CPTAC &#x8FDB;&#x884C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x666E;&#x901A;&#x6750;&#x6599;&#x548C;&#x6807;&#x51C6;&#x5316;&#x7684;&#x534F;&#x8BAE;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x53EF;&#x4EE5;&#x662F;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x53EF;&#x91CD;&#x73B0;&#x5185;&#x548C;&#x8DE8;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x548C;&#x4EEA;&#x5668;&#x5E73;&#x53F0;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x662F;&#x654F;&#x611F;&#x5230;&#x4F4E;&#x676F;/&#x6BEB;&#x5347;&#x86CB;&#x767D;&#x6D53;&#x5EA6;&#x809D;&#x7D20;&#x8840;&#x6D46;&#x4E2D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x548C;&#x57FA;&#x51C6;&#x9488;&#x5BF9;&#x7684;&#x4E2A;&#x4EBA;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x53EF;&#x4EE5;&#x6BD4;&#x8F83;&#x5176;&#x4E1A;&#x7EE9;&#x548C;&#x8BC4;&#x4F30;&#x8840;&#x6D46;&#x4E2D;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x7684;&#x65B0;&#x6280;&#x672F;&#x3002;

&#x591A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x548C;&#x53EF;&#x91CD;&#x590D;&#x6027;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x5728;&#x8840;&#x6D46;&#x4E2D;&#x7684;&#x591A;&#x4E2A;&#x53CD;&#x5E94;&#x57FA;&#x4E8E;&#x76D1;&#x6D4B;&#x7684;&#x6D4B;&#x91CF;&#x8BC4;&#x4F30;&#x3002;

Verification of candidate biomarkers relies upon specific, quantitative assays optimized for selective detection of target proteins, and is increasingly viewed as a critical step in the discovery pipeline that bridges unbiased biomarker discovery to preclinical validation. Although individual laboratories have demonstrated that multiple reaction monitoring (MRM) coupled with isotope dilution mass spectrometry can quantify candidate protein biomarkers in plasma, reproducibility and transferability of these assays between laboratories have not been demonstrated. We describe a multilaboratory study to assess reproducibility, recovery, linear dynamic range and limits of detection and quantification of multiplexed, MRM-based assays, conducted by NCI-CPTAC. Using common materials and standardized protocols, we demonstrate that these assays can be highly reproducible within and across laboratories and instrument platforms, and are sensitive to low mug/ml protein concentrations in unfractionated plasma. We provide data and benchmarks against which individual laboratories can compare their performance and evaluate new technologies for biomarker verification in plasma.

Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.

V&#xE9;rification des biomarqueurs candidats s&#x26;#39;appuie sur des analyses quantitatives sp&#xE9;cifiques, optimis&#xE9;s pour la d&#xE9;tection s&#xE9;lective de prot&#xE9;ines cibles, et il est de plus en plus consid&#xE9;r&#xE9;e comme une &#xE9;tape cruciale dans le pipeline de d&#xE9;couvertes que la d&#xE9;couverte de biomarqueurs ponts impartiale &#xE0; la validation pr&#xE9;clinique. Bien que les laboratoires individuels ont d&#xE9;montr&#xE9; que le suivi de r&#xE9;actions multiples (MRM) coupl&#xE9;e &#xE0; la spectrom&#xE9;trie de masse des isotopes de dilution permet de quantifier des biomarqueurs prot&#xE9;iques candidats dans le plasma, la reproductibilit&#xE9; et la transf&#xE9;rabilit&#xE9; de ces dosages entre les laboratoires n&#x26;#39;ont pas &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;montr&#xE9;es. Nous d&#xE9;crivons une &#xE9;tude multilaboratoires pour &#xE9;valuer la reproductibilit&#xE9;, la r&#xE9;cup&#xE9;ration, la gamme dynamique lin&#xE9;aire et les limites de d&#xE9;tection et de quantification des multiplex&#xE9;es, MRM-titrages effectu&#xE9;s par le NCI-CPTAC. L&#x26;#39;utilisation de mat&#xE9;riaux communs et des protocoles normalis&#xE9;s, nous d&#xE9;montrons que ces tests peuvent &#xEA;tre hautement reproductible au sein et entre les laboratoires et les plates-formes d&#x26;#39;instruments, et sont sensibles &#xE0; de faibles concentrations de prot&#xE9;ines mug / ml dans le plasma non fractionn&#xE9;e. Nous fournissons des donn&#xE9;es et rep&#xE8;res par rapport auxquels les laboratoires individuels peuvent comparer leurs performances et &#xE9;valuer les nouvelles technologies pour la v&#xE9;rification des biomarqueurs dans le plasma.

Multi-site d&#x26;#39;&#xE9;valuation de la pr&#xE9;cision et la reproductibilit&#xE9; multiples r&#xE9;action de surveillance des mesures bas&#xE9;es sur des prot&#xE9;ines dans le plasma

&Uuml;berpr&uuml;fung der Kandidat Biomarker ist abh&auml;ngig von spezifischen, quantitative Proben f&uuml;r selektive Erkennung von Zielproteinen optimiert und wird zunehmend als ein entscheidender Schritt bei der Entdeckung pipeline diese Br&uuml;cken unvoreingenommene Biomarker Entdeckung pr&auml;klinische Validation gesehen. Obwohl einzelne Laboratorien bewiesen haben, dass mehrere Reaction monitoring (MRM) mit Isotop Verd&uuml;nnung Massenspektrometrie gekoppelt k&ouml;nnen Kandidaten Protein quantifizieren Biomarker in Plasma, Reproduzierbarkeit und &Uuml;bertragbarkeit der diese Proben zwischen Laboratorien nicht nachgewiesen wurden. Wir beschreiben eine multilaboratory Studie Reproduzierbarkeit, Recovery, linearen Dynamikbereich und Nachweisgrenzen und Quantifizierung von Multiplex, MRM-basierte Assays, dirigiert von NCI-CPTAC. Gemeinsame Materialien und standardisierter Protokolle verwenden, zeigen wir, dass diese Proben k&ouml;nnen hoch reproduzierbare innerhalb und zwischen den Labors und Instrument-Plattformen, und empfindlich auf niedrige Becher/ml Protein-Konzentrationen im Plasma Unfraktioniertes reagieren. Wir liefern Daten und Benchmarks gegen die einzelne Laboratorien k&ouml;nnen vergleichen ihre Leistung und bewerten neue Technologien f&uuml;r Biomarker &Uuml;berpr&uuml;fung im Plasma.

Multisite Beurteilung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der mehrere Reaktion &Uuml;berwachung-basierte Messungen der Proteine im Plasma.

Verifica dei biomarcatori candidato si basa su saggi specifici, quantitative ottimizzati per rilevazione selettiva delle proteine bersaglio e sempre pi&ugrave; &egrave; visto come un passaggio critico nella scoperta della pipeline che scoperta biomarker imparziale ponti di validazione preclinica. Sebbene singoli laboratori hanno dimostrato che pi&ugrave; reazione monitoraggio (MRM) accoppiato con spettrometria di massa di diluizione isotopica pu&ograve; quantificare proteina candidato biomarcatori nel plasma, riproducibilit&agrave; e trasferibilit&agrave; di tali dosaggi tra i laboratori non sono state dimostrate. Descriviamo un multilaboratory studio per valutare la riproducibilit&agrave;, recupero, gamma dinamica lineare ed i limiti di rilevazione e quantificazione dei multiplex, MRM-based assays, condotto da NCI-CPTAC. Utilizzando materiali comuni e protocolli standardizzati, dimostreremo che questi dosaggi possono essere altamente riproducibile entro ed attraverso laboratori e piattaforme di strumento e sono sensibili a concentrazioni di proteina bassa mug/ml nel plasma non frazionato. Forniamo dati e parametri di riferimento contro cui laboratori individuali possono confrontare le loro prestazioni e valutare nuove tecnologie per la verifica di biomarker nel plasma.

Valutazione multi-sito della precisione e la riproducibilit&agrave; delle misurazioni multiple con reazione basata sul monitoraggio delle proteine nel plasma.

&#x5019;&#x88DC;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x306E;&#x691C;&#x8A3C;&#x306F;&#x3001;&#x6A19;&#x7684;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x7684;&#x306A;&#x691C;&#x51FA;&#x7528;&#x306B;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x7279;&#x5B9A;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x306A;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x307E;&#x3059;&#x307E;&#x3059;&#x81E8;&#x5E8A;&#x691C;&#x8A3C;&#x306B;&#x516C;&#x5E73;&#x306A;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x306E;&#x767A;&#x898B;&#x3092;&#x57CB;&#x3081;&#x308B;&#x767A;&#x898B;&#x30D1;&#x30A4;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3068;&#x898B;&#x306A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x6240;&#x306F;&#x540C;&#x4F4D;&#x4F53;&#x5E0C;&#x91C8;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x6CD5;&#x3068;&#x76F8;&#x307E;&#x3063;&#x3066;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EB;&#x30EA;&#x30A2;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CB;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#xFF08;MRM&#xFF09;&#x304C;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x306B;&#x5019;&#x88DC;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3066;&#x304D;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x9593;&#x306E;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x3084;&#x8EE2;&#x5199;&#x6027;&#x304C;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x3001;&#x30EA;&#x30AB;&#x30D0;&#x30EA;&#x3001;&#x30EA;&#x30CB;&#x30A2;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30C3;&#x30AF;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B8;&#x3068;NCI-CPTAC&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x3001;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;&#x3001;MRM&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x306E;&#x9650;&#x754C;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;multilaboratory&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x6750;&#x6599;&#x3068;&#x6A19;&#x6E96;&#x5316;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x5185;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x3084;&#x6A5F;&#x5668;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x9593;&#x3067;&#x9AD8;&#x3044;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3001;&#x672A;&#x5206;&#x753B;&#x30D8;&#x30D1;&#x30EA;&#x30F3;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x306E;&#x4F4E;&#x30DE;&#x30B0;/ ml&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306B;&#x654F;&#x611F;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x6240;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x6027;&#x80FD;&#x3092;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3001;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x3092;&#x691C;&#x8A3C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x6280;&#x8853;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x306A;&#x308B;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3068;&#x306E;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C1;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;&#x30E2;&#x30CB;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x306E;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x3068;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x306E;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;

&#xD6C4;&#xBCF4; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xB9C8;&#xCEE4;&#xC758; &#xD655;&#xC778; &#xB300;&#xC0C1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801;&#xC778; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; &#xD2B9;&#xC815;, &#xC591;&#xC801; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD558; &#xACE0; &#xC810;&#xC810; &#xBC1C;&#xACAC;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4; &#xD30C;&#xC774;&#xD504;&#xB77C;&#xC778; &#xC804; &#xC784;&#xC0C1; &#xC720;&#xD6A8;&#xC131; &#xAC80;&#xC0AC;&#xB97C; &#xADF8; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xD3B8;&#xACAC;&#xB41C; biomarker &#xBC1C;&#xACAC;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCFC;. &#xBE44;&#xB85D; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBC18;&#xC751; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; (MRM) &#xB3D9;&#xC704; &#xC6D0;&#xC18C; &#xD76C;&#xC11D; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D;&#xC73C;&#xB85C; &#xACB0;&#xD569; &#xB41C; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xC785;&#xC99D; &#xD6C4;&#xBCF4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xB9C8;&#xCEE4;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;, &#xC7AC;&#xD604;&#xC131; &#xBC0F; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC18C; &#xAC04;&#xC758; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC758; &#xC591;&#xB3C4; &#xC99D;&#xBA85; &#xB418;&#xC9C0; &#xACC4;&#xB7C9; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC7AC;&#xD604;&#xC131;, &#xBCF5;&#xAD6C;, &#xC120;&#xD615; &#xB3D9;&#xC801; &#xBC94;&#xC704;&#xC640; &#xAC10;&#xC9C0;&#xC758; &#xD55C;&#xACC4;&#xB97C; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; multilaboratory &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654;&#xC758; &#xB2E4;&#xC911;&#xD654;, MRM &#xAE30;&#xBC18; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;, NCI CPTAC&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2E4;&#xC2DC;. &#xC77C;&#xBC18; &#xC790;&#xB8CC; &#xBC0F; &#xD45C;&#xC900;&#xD654; &#xB41C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xBC0F; &#xC545;&#xAE30; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xB192;&#xC740; &#xC7AC;&#xD604; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC73C;&#xBA70; unfractionated &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xB0AE;&#xC740; &#xB0AF; &#xC9DD;/ml &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB18D;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xBC0F; &#xBCA4;&#xCE58; &#xB9C8;&#xD06C;&#xB294; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xC218; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC131;&#xB2A5;&#xC744; &#xBE44;&#xAD50; &#xD558; &#xACE0; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xC758; biomarker &#xAC80;&#xC99D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558; &#xAC8C; &#xD574; &#xB4DC;&#xB9BD;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB2E4;&#xC911; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xD3C9;&#xAC00; &#xC815;&#xBC00;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xC5D0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBC18;&#xC751; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xAE30;&#xBC18; &#xCE21;&#xC815;&#xC758; &#xC7AC;&#xD604;&#xC131;.

La verificaci&#xF3;n de biomarcadores candidatos se basa en los ensayos cuantitativos espec&#xED;ficos optimizados para la detecci&#xF3;n selectiva de las prote&#xED;nas diana, y est&#xE1; cada vez m&#xE1;s como un paso cr&#xED;tico en el descubrimiento de nuevas que el descubrimiento de biomarcadores puentes imparcial para la validaci&#xF3;n precl&#xED;nica. A pesar de los distintos laboratorios han demostrado que la monitorizaci&#xF3;n de reacci&#xF3;n m&#xFA;ltiple (MRM) acoplada a espectrometr&#xED;a de masas por diluci&#xF3;n isot&#xF3;pica puede cuantificar biomarcadores candidatos de prote&#xED;nas en el plasma, la reproducibilidad y la transferibilidad de estas pruebas entre los laboratorios no han sido demostrados. Se describe un estudio de varios laboratorios para evaluar la reproducibilidad, la recuperaci&#xF3;n, rango din&#xE1;mico lineal y los l&#xED;mites de detecci&#xF3;n y cuantificaci&#xF3;n de MRM multiplexadas, a base de ensayos, llevados a cabo por el NCI CPTAC. El uso de materiales comunes y protocolos estandarizados, se demuestra que estos ensayos pueden ser altamente reproducible dentro y fuera de los laboratorios y plataformas de instrumentos, y son sensibles a bajas concentraciones de prote&#xED;na taza / ml en plasma no fraccionada. Se aportan datos y puntos de referencia contra el cual los distintos laboratorios pueden comparar su desempe&#xF1;o y evaluar nuevas tecnolog&#xED;as para la verificaci&#xF3;n de biomarcadores en el plasma.

Multi-sitio de Evaluaci&#xF3;n de la precisi&#xF3;n y la reproducibilidad de los m&#xFA;ltiples de reacci&#xF3;n a base de Monitoreo-Las mediciones de prote&#xED;nas en el plasma

&#x7CD6;&#x662F;&#x5728;&#x53D1;&#x80B2;&#x671F;&#x95F4;&#x8C03;&#x5236;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x7279;&#x5B9A;&#x3001; &#x7FFB;&#x8BD1;&#x540E;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4FEE;&#x6539;&#x548C;&#x75BE;&#x75C5;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x3002;&#x4E3A;&#x6B64;&#xFF0C;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x662F;&#x6709;&#x5438;&#x5F15;&#x529B;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C06;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x7EB3;&#x5165;&#x4E86;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x4EB2;&#x548C;&#x5C42;&#x6790;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x6267;&#x884C;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x7CD6;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684;&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5149;&#x8C31;&#x6CD5;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6D41;&#x3002;&#x5982;&#x589E;&#x52A0;&#x800C;&#x4E14;&#x548C; fucosylation &#x90FD;&#x662F;&#x660E;&#x663E;&#x7684;&#x764C;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x4FEE;&#x6539;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x91CD;&#x70B9;&#x63A5;&#x9AA8;&#x9ED1;&#x8D28;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20; &#xFF08;SNA&#xFF09; &#x548C; Aleuria aurantia &#x51DD;&#x96C6;&#x7D20; (AAL) &#x5206;&#x522B;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x542B;&#x6709;&#x553E;&#x6DB2;&#x9178;&#x548C;&#x5CA9;&#x85FB;&#x7CD6;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x7684;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x3002;Fucosylated &#x548C; sialylated &#x4ECE;&#x4EBA;&#x4E73;&#x94C1;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7CD6;&#x80BD;&#x62C5;&#x4EFB;&#x79EF;&#x6781;&#x7684;&#x63A7;&#x5236;&#x548C;&#x9AD8;&#x7518;&#x9732;&#x7CD6;&#x7ED3;&#x6784;&#x4ECE;&#x9175;&#x6BCD;&#x8517;&#x7CD6;&#x9176;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x9634;&#x6027;&#x5BF9;&#x7167;&#x3002;&#x6807;&#x51C6;&#x88AB;&#x98D9;&#x5347;&#x5230;&#x591A;&#x4E2A;&#x4EB2;&#x548C;&#x53BB;&#x9664;&#x7CFB;&#x7EDF; (MARS) 14 &#x8D2B;&#x3001; &#x80F0;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x6D88;&#x5316;&#x4EBA;&#x8840;&#x6D46;&#x4ECE;&#x5065;&#x5EB7;&#x7684;&#x6350;&#x52A9;&#x8005;&#x3002;&#x6837;&#x672C;&#x88AB;&#x88C5;&#x4E0A;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x5217;&#x3001; &#x9AD8;&#x6548;&#x6DB2;&#x76F8;&#x8272;&#x8C31;&#x6CD5;&#x5206;&#x4E3A;&#x6D41;&#x901A;&#x8FC7;&#x548C;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x5206;&#x6570;&#xFF0C;&#x548C;&#x80BD;&#x6CBB;&#x7597;&#xFF1A; N-&#x7CD6;&#x82F7;&#x9176; F &#x8981;&#x5220;&#x9664; N-&#x805A;&#x7CD6;&#x3002;Deglycosylated &#x591A;&#x80BD;&#x7EC4;&#x5206;&#x5BA1;&#x95EE;&#x4E86; ESI &#x9AD8;&#x6548;&#x6DB2;&#x76F8;&#x8272;&#x8C31;-&#x8D28;&#x8C31;/&#x8D28;&#x8C31;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x603B;&#x5171;&#x6709; 122 &#x4EBA;&#x8840;&#x6D46;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x542B;&#x6709; 247 &#x72EC;&#x7279; glycosites&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D; (&#x5982;&#x9499;&#x7C98;&#x86CB;&#x767D; 5 &#x548C;&#x4E2D;&#x6027;&#x7C92;&#x7EC6;&#x80DE;&#x660E;&#x80F6;&#x9176;&#x76F8;&#x5173;&#x8F7D;&#x8102;&#x86CB;&#x767D;) &#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x901A;&#x5E38;&#x5728;&#x6BCF;&#x6BEB;&#x5347;&#x7EA7;&#x522B;&#x4F4E;&#x6240;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x4F53;&#x4E2D;&#x5206;&#x53D1;&#x3002;&#x5728;&#x4E00;&#x8D77;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x57FA;&#x4E8E;&#x8D28;&#x8C31;&#x6280;&#x672F;&#x8BC1;&#x636E;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x5206;&#x79BB;&#x5E73;&#x53F0;&#x7EB3;&#x5165;&#x764C;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x53D1;&#x73B0;&#x7BA1;&#x9053;&#x7684;&#x5B9E;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;

&#x9488;&#x5BF9; glycosite &#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x4E0E;&#x764C;&#x75C7;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x78B3;&#x6C34;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x7ED3;&#x6784;&#x80F0;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x6D88;&#x5316;&#x4EBA;&#x8840;&#x6D46;&#x4E2D;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x4EB2;&#x548C;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6D41;&#x3002;

Glycans are cell-type-specific, posttranslational protein modifications that are modulated during developmental and disease processes. As such, glycoproteins are attractive biomarker candidates. Here, we describe a mass spectrometry-based workflow that incorporates lectin affinity chromatography to enrich for proteins that carry specific glycan structures. As increases in sialylation and fucosylation are prominent among cancer-associated modifications, we focused on Sambucus nigra agglutinin (SNA) and Aleuria aurantia lectin (AAL), lectins which bind sialic acid- and fucose-containing structures, respectively. Fucosylated and sialylated glycopeptides from human lactoferrin served as positive controls, and high-mannose structures from yeast invertase served as negative controls. The standards were spiked into Multiple Affinity Removal System (MARS) 14-depleted, trypsin-digested human plasma from healthy donors. Samples were loaded onto lectin columns, separated by HPLC into flow-through and bound fractions, and treated with peptide: N-glycosidase F to remove N-linked glycans. The deglycosylated peptide fractions were interrogated by ESI HPLC-MS/MS. We identified a total of 122 human plasma glycoproteins containing 247 unique glycosites. Importantly, several of the observed glycoproteins (e.g., cadherin 5 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin) typically circulate in plasma at low nanogram per milliliter levels. Together, these results provide mass spectrometry-based evidence of the utility of incorporating lectin-separation platforms into cancer biomarker discovery pipelines.

A lectin affinity workflow targeting glycosite-specific, cancer-related carbohydrate structures in trypsin-digested human plasma.

Glycanes sont un type de cellule-sp&#xE9;cifiques, des modifications post-traductionnelles des prot&#xE9;ines qui sont modul&#xE9;s au cours des processus de d&#xE9;veloppement et de la maladie. En tant que tel, les glycoprot&#xE9;ines sont des candidats biomarqueurs int&#xE9;ressants. Ici, nous d&#xE9;crivons une spectrom&#xE9;trie de masse &#xE0; base de workflow qui int&#xE8;gre chromatographie d&#x26;#39;affinit&#xE9; lectine &#xE0; enrichir pour des prot&#xE9;ines qui transportent sp&#xE9;cifiques structures glycanniques. Comme l&#x26;#39;augmentation des sialylation et fucosylation occupent une place importante parmi les associ&#xE9;s au cancer modifications, nous nous sommes concentr&#xE9;s sur Sambucus nigra agglutinine (SCN) et Aleuria aurantia lectine (AAL), les lectines qui lient l&#x26;#39;acide sialique et le fucose-structures contenant, respectivement. Glycopeptides fucosyl&#xE9;es et sialyl&#xE9;es de la lactoferrine humaine ont servi de t&#xE9;moins positifs, et de haute-mannose structures de invertase de levure ont servi de t&#xE9;moins n&#xE9;gatifs. Les normes ont &#xE9;t&#xE9; charg&#xE9;s dans le Syst&#xE8;me d&#x26;#39;affinit&#xE9; Enl&#xE8;vement multiples (MARS) de 14 appauvri, la trypsine-dig&#xE9;r&#xE9; plasma humain provenant de donneurs sains. Les &#xE9;chantillons ont &#xE9;t&#xE9; charg&#xE9;s sur des colonnes de lectine, s&#xE9;par&#xE9;s par HPLC en flux continu et fractions li&#xE9;es, et trait&#xE9;es avec le peptide: N-glycosidase F pour &#xE9;liminer N-glycanes. Les fractions peptidiques d&#xE9;glycosyl&#xE9;es ont &#xE9;t&#xE9; interrog&#xE9;s par CLHP-SM/SM ESI. Nous avons identifi&#xE9; un total de 122 glycoprot&#xE9;ines plasmatiques humaines contenant 247 glycosites uniques. Il est important, plusieurs des glycoprot&#xE9;ines observ&#xE9;es (par exemple, la cadh&#xE9;rine 5 et des neutrophiles associ&#xE9;e &#xE0; la g&#xE9;latinase lipocaline) g&#xE9;n&#xE9;ralement circuler dans le plasma &#xE0; faible nanogramme par millilitre niveaux. Ensemble, ces r&#xE9;sultats fournissent la spectrom&#xE9;trie de masse &#xE0; base de la preuve de l&#x26;#39;utilit&#xE9; d&#x26;#39;incorporer la lectine de s&#xE9;paration plates-formes dans les pipelines de biomarqueurs du cancer de d&#xE9;couverte.

Un flux de travail d&#x26;#39;affinit&#xE9; sur lectine de ciblage Glycosite-sp&#xE9;cifiques, des structures glucidiques li&#xE9;s au cancer dans la trypsine-dig&#xE9;r&#xE9; du plasma humain

Glykane sind zellspezifische-Typ, posttranslationale Protein-&Auml;nderungen, die w&auml;hrend der Entwicklungsbiologie moduliert werden und Krankheitsprozesse. Glykoproteine sind attraktive Biomarker-Kandidaten. Hier beschreiben wir einen Spektrometrie-basierten Massen-Workflow, der beinhaltet Lektin-Affinit&auml;ts-Chromatographie f&uuml;r Proteine, die bestimmte Glykan-Strukturen tragen zu bereichern. Wie Sialylation und Fucosylation unter Krebs-assoziierte Ver&auml;nderungen hervor, konzentrierten wir uns auf Sambucus Nigra Agglutinin (SNA) und Orangeroter Aurantia Lektin (AAL), Lektine die Sialins&auml;ure und Fucose-haltigen Strukturen, bzw. zu binden. Fucosylated und Sialylated Glycopeptides aus menschlichen Lactoferrin diente als Positivkontrollen und hoch-Mannose Strukturen aus Hefe Invertase diente als Negativkontrolle. Die Standards wurden in mehreren Affinity Removal System (MARS) 14-ersch&ouml;pft, Trypsin verdaut menschlichen Plasma von gesunden Spendern Pfennigabsatz. Proben wurden verladen Lektin Spalten durch HPLC in Passagen- und gebundene Fraktionen getrennt und mit Peptid behandelt: N-Glycosidaseinhibitoren F, N-chromosomale Glykane zu entfernen. Die Deglycosylated-Peptid-Br&uuml;che wurden von ESI-HPLC-MS/MS verh&ouml;rt. Wir haben insgesamt 122 Blutplasma Glykoproteine mit 247 einzigartige Glycosites identifiziert. Wichtiger ist, zirkulieren einige der beobachteten Glykoproteine (z. B. Cadherin 5 und neutrophil Gelatinase-assoziiertes Lipocalin) in der Regel im Plasma bei niedrigen Nanogramm pro Milliliter Ebenen. Zusammen bieten diese Ergebnisse Spektrometrie-basierten Massen-Beweis f&uuml;r den Nutzen der Einbeziehung von Lektin-Trennung-Plattformen in Krebs Biomarker Entdeckung Rohrleitungen.

Ein Lektin-Affinit&auml;t-Workflow f&uuml;r Glycosite-spezifische, Krebs-in Verbindung stehenden Kohlenhydrat-Strukturen im Blutplasma enthalten Trypsin verdaut.

Glicani sono specifici del tipo di cellula, post traduzionale della proteina le modifiche che sono modulate durante lo sviluppo e i processi di malattia. Come tale, glicoproteine sono attraenti biomarker candidati. Qui, descriviamo un flusso di lavoro basato su spettrometria di massa che incorpora la cromatografia di affinit&agrave; lectina arricchire per le proteine che trasportano glycan specifiche strutture. Come aumenti di sialylation e fucosylation sono prominenti tra modifiche associati al cancro, ci siamo concentrati su Sambucus nigra agglutinina (SNA) e Aleuria aurantia lectin (AAL), lectine che legano strutture contenenti acido sialico e fucosio, rispettivamente. Glicopeptidi Fucosylated e sialilato da lattoferrina umana servivano come controlli positivi e le strutture di alta-mannosio da lievito invertasi servito come controlli negativi. Gli standard sono stati a spillo in molteplici affinit&agrave; Removal System (MARS) 14-esaurito, digerite tripsina plasma umano da donatori sani. Campioni sono stati caricati su colonne lectina, separati mediante HPLC in frazioni flow-through e rilegate e trattati con peptide: N-glicosidasico F rimuovere N-linked glicani. Le frazioni di peptide deglycosylated sono state interrogate da HPLC ESI-MS/MS. Abbiamo identificato un totale di 122 glicoproteine di plasma umano contenente 247 glycosites unico. Importante, diverse le glicoproteine osservate (per esempio, 5 caderina e neutrophil gelatinase-associated lipocalin) in genere circolano nel plasma a basso nanogrammi per millilitro livelli. Insieme, questi risultati forniscono massa basati sulla spettrometria di prove dell&#39;utilit&agrave; di integrare piattaforme lectina-separazione nel cancro biomarker discovery oleodotti.

Un workflow di affinit&agrave; lectina targeting strutture glycosite specifici, legati al cancro carboidrati nel plasma umano digerite tripsina.

&#x7CD6;&#x9396;&#x306F;&#x3001;&#x767A;&#x751F;&#x3084;&#x75C5;&#x6C17;&#x306E;&#x904E;&#x7A0B;&#x3067;&#x5909;&#x8ABF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x3001;&#x7FFB;&#x8A33;&#x5F8C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x4FEE;&#x98FE;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x9B45;&#x529B;&#x7684;&#x306A;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x306E;&#x5019;&#x88DC;&#x3068;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x7CD6;&#x9396;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x904B;&#x3076;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x6FC3;&#x7E2E;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x3093;&#x3060;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EA;&#x30EB;&#x5316;&#x53CA;&#x3073;&#x30D5;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306F;&#x764C;&#x95A2;&#x9023;&#x306E;&#x4FEE;&#x6B63;&#x306E;&#x9593;&#x3067;&#x9855;&#x8457;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x3001;&#x30CB;&#x30EF;&#x30C8;&#x30B3;&#x9ED2;&#x8CEA;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#xFF08;SNA&#xFF09;&#x3068;&#x30D2;&#x30A4;&#x30ED;&#x30C1;&#x30E3;&#x30EF;&#x30F3;&#x30BF;&#x30B1;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#xFF08;AAL&#xFF09;&#x3001;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EB;&#x9178;&#x3068;&#x30D5;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x542B;&#x6709;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x305F;&#x3002;&#x30D2;&#x30C8;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A7;&#x30EA;&#x30F3;&#x304B;&#x3089;&#x30D5;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x3068;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EA;&#x30EB;&#x7CD6;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x6B63;&#x306E;&#x5BFE;&#x7167;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x9175;&#x6BCD;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D9;&#x30EB;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x304B;&#x3089;&#x9AD8;&#x30DE;&#x30F3;&#x30CE;&#x30FC;&#x30B9;&#x69CB;&#x9020;&#x306F;&#x3001;&#x30CD;&#x30AC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x5F79;&#x7ACB;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x57FA;&#x6E96;&#x306F;&#x3001;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EB;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x9664;&#x53BB;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x200B;&#x200B;&#xFF08;MARS&#xFF09;14-&#x67AF;&#x6E07;&#x3001;&#x5065;&#x5EB7;&#x306A;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3;&#x6D88;&#x5316;&#x3057;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x8840;&#x6F3F;&#x306B;&#x6DFB;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x3068;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x305F;&#x753B;&#x5206;&#x306B;HPLC&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5206;&#x96E2;&#x3057;&#x3001;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x30AB;&#x30E9;&#x30E0;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3067;&#x51E6;&#x7406;&#x3057;&#x305F;&#xFF1A;N-&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30B7;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC;F&#x306F;N-&#x7D50;&#x5408;&#x578B;&#x7CD6;&#x9396;&#x3092;&#x9664;&#x53BB;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x8131;&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x753B;&#x5206;&#x3092;ESI&#x306E;HPLC-MS/MS&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5C0B;&#x554F;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;247&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;glycosites&#x3092;&#x542B;&#x3080;122&#x30D2;&#x30C8;&#x8840;&#x6F3F;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5408;&#x8A08;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x306E;&#x306F;&#x3001;&#x89B3;&#x6E2C;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;&#x4F8B;&#x3048;&#x3070;&#x3001;&#x30AB;&#x30C9;&#x30D8;&#x30EA;&#x30F3;5&#x3068;&#x597D;&#x4E2D;&#x7403;&#x30BC;&#x30E9;&#x30C1;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x95A2;&#x9023;&#x30EA;&#x30DD;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF09;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306F;&#x3001;&#x901A;&#x5E38;&#x3001;&#x30DF;&#x30EA;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C8;&#x30EB;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3054;&#x3068;&#x306B;&#x3001;&#x4F4E;&#x30CA;&#x30CE;&#x30B0;&#x30E9;&#x30E0;&#x3067;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x306B;&#x5FAA;&#x74B0;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x764C;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x306E;&#x63A2;&#x7D22;&#x30D1;&#x30A4;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x5206;&#x96E2;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x3093;&#x3060;&#x306E;&#x30E6;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30EA;&#x30C6;&#x30A3;&#x306E;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x8A3C;&#x62E0;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3;&#x6D88;&#x5316;&#x3057;&#x305F;&#x30D2;&#x30C8;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;Glycosite&#x7279;&#x6709;&#x306E;&#x304C;&#x3093;&#x95A2;&#x9023;&#x7CD6;&#x9396;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x6A19;&#x7684;&#x3068;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306E;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;

Glycans&#xB294; &#xBC1C;&#xB2EC; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xBCC0;&#xC870; &#xC140; &#xC720;&#xD615;&#xBCC4;, posttranslational &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC218;&#xC815; &#xBC0F; &#xC9C8;&#xBCD1; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;. &#xC774;&#xC640; &#xAC19;&#xC774;, glycoproteins&#xB294; &#xB9E4;&#xB825;&#xC801;&#xC778; biomarker &#xD6C4;&#xBCF4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD2B9;&#xC815; glycan &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD48D;&#xBD80; &#xD558; &#xAC8C; lectin &#xCE5C;&#xD654;&#xC131; &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C; &#xD1B5;&#xD569; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xAE30;&#xBC18; &#xC6CC;&#xD06C;&#xD50C;&#xB85C; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Sialylation &#xBC0F; fucosylation&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; &#xC554; &#xAD00;&#xB828; &#xC218;&#xC815; &#xC911; &#xB208;&#xC5D0; &#xB744;&#xB294;, &#xC6B0;&#xB9AC; Sambucus nigra agglutinin (SNA) &#xBC0F; Aleuria (AAL) aurantia lectin sialic &#xC0B0; &#xACE0; fucose &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xAC01;&#xAC01; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; lectins&#xC5D0; &#xCD08;&#xC810;&#xC744; &#xB9DE;&#xCD98;. &#xC778;&#xAC04;&#xC758; lactoferrin &#xAE0D;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864; &#xBC0F; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB2F9;&#xD654; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864; &#xC5ED;&#xC784;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB192;&#xC740; &#xC2A4; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; Fucosylated &#xBC0F; sialylated glycopeptides. &#xD45C;&#xC900; &#xAC74;&#xAC15; &#xD55C; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xB85C;&#xBD80;&#xD130; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC81C;&#xAC70; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; (&#xD654;&#xC131;) 14 &#xACE0;&#xAC08;, &#xD2B8;&#xB9BD; &#xC2E0; &#xC18C;&#xD654; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xB85C; &#xC544;&#xAD70; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC0D8;&#xD50C; lectin &#xC5F4;&#xC5D0; &#xB85C;&#xB4DC; &#xB41C; HPLC&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAD6C;&#xBD84; &#xD558;&#xB294; &#xD750;&#xB984;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD558; &#xACE0; &#xBC14;&#xC6B4;&#xB4DC; &#xBD84;&#xC218;&#xC5D0; &#xBC0F; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB85C; &#xCE58;&#xB8CC;: N glycosidase F glycans N &#xC5F0;&#xACB0;&#xC744; &#xC81C;&#xAC70; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Deglycosylated &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xBD84;&#xC218; ESI HPLC-MS/MS&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2EC;&#xBB38;&#xC744; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xCD1D; 122 &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; glycoproteins 247 &#xACE0;&#xC720;&#xD55C; glycosites&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xD655;&#xC778;. &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC740;, &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; glycoproteins (&#xC608;&#xB97C; &#xB4E4;&#xC5B4;, cadherin 5&#xC640; &#xD638; gelatinase &#xC5F0;&#xACB0; lipocalin)&#xC758; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBC00;&#xB9AC; &#xB808;&#xBCA8; &#xB2F9; &#xB0AE;&#xC740; &#xB098;&#xB178; &#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC21C;&#xD658;. &#xD568;&#xAED8;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC554; biomarker &#xAC80;&#xC0C9; &#xD30C;&#xC774;&#xD504;&#xB77C;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; lectin &#xBD84;&#xB9AC; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC744; &#xD1B5;&#xD569;&#xC758; &#xC720;&#xD2F8;&#xB9AC;&#xD2F0;&#xC758; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xAE30;&#xBC18; &#xC99D;&#xAC70;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Lectin &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC6CC;&#xD06C;&#xD50C;&#xB85C; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xD2B8;&#xB9BD; &#xC2E0; &#xC18C;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; glycosite &#xAD00;&#xB828;, &#xC554; &#xAD00;&#xB828; &#xD0C4;&#xC218;&#xD654;&#xBB3C; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Los glicanos son las c&#xE9;lulas espec&#xED;ficas del tipo de prote&#xED;na, modificaciones postraduccionales que se modulan en los procesos de desarrollo y de la enfermedad. Como tal, glicoprote&#xED;nas son candidatos atractivos biomarcadores. A continuaci&#xF3;n, describimos una espectrometr&#xED;a de masas basado en flujo de trabajo que incorpora la cromatograf&#xED;a de afinidad de lectina para enriquecer las prote&#xED;nas que transportan determinadas estructuras de glicano. A medida que aumenta en sialilaci&#xF3;n y fucosilaci&#xF3;n destacan entre asociados al c&#xE1;ncer modificaciones, nos centramos en Sambucus nigra aglutinina (SNA) y la lectina Aleuria aurantia (AAL), lectinas que se unen con &#xE1;cido si&#xE1;lico y las estructuras de fucosa que contienen, respectivamente. Glicop&#xE9;ptidos fucosilados y sialilada de lactoferrina humana sirvieron como controles positivos, y alto contenido en manosa estructuras de invertasa de levadura sirvieron como controles negativos. Las normas se dispar&#xF3; en m&#xFA;ltiples sistemas de eliminaci&#xF3;n de afinidad (MARS) de 14 empobrecido, digerido con tripsina plasma humano de donantes sanos. Las muestras se cargaron en columnas de lectina, separados por HPLC en flujo continuo y fracciones enlazados, y tratados con el p&#xE9;ptido N-glicosidasa F para eliminar N-glicanos ligados. Las fracciones pept&#xED;dicas desglicosiladas fueron interrogados por HPLC-MS/MS ESI. Se identificaron un total de 122 glicoprote&#xED;nas del plasma humano que contienen 247 glycosites &#xFA;nicas. Es importante destacar que varias de las glicoprote&#xED;nas observados (por ejemplo, cadherina 5 y neutr&#xF3;filos lipocalina gelatinasa asociada) normalmente circulan en el plasma a baja nanogramos por mililitro niveles. En conjunto, estos resultados proporcionan la espectrometr&#xED;a de masas basada en la evidencia de la utilidad de la incorporaci&#xF3;n de la separaci&#xF3;n lectina-plataformas en las tuber&#xED;as descubrimiento de biomarcadores de c&#xE1;ncer.

Un flujo de trabajo de afinidad de lectina Orientaci&#xF3;n Glycosite espec&#xED;ficos, relacionados con el c&#xE1;ncer estructuras de carbohidratos en la tripsina digerido con plasma humano

&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x7A7A;&#x8C03;&#x7684;&#x5C4F;&#x5E55;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x57FA;&#x4E8E;&#x8272;&#x8C31;/&#x8D28;&#x8C31;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4ECE;&#x9762;&#x677F;&#x7684;&#x9C81;&#x7C73;&#x90A3; (&#x4E0D;&#x90A3;&#x4E48;&#x5484;&#x5484;&#x903C;&#x4EBA;&#xFF09; &#x4ECB;&#x8D28;&#x548C;&#x4E09;&#x8D1F; &#xFF08;&#x66F4;&#x5177;&#x4FB5;&#x7565;&#x6027;) &#x4E73;&#x817A;&#x764C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x682A; (n = 5/&#x5B50;&#x7C7B;&#x578B;&#xFF09;&#x3002;&#x6837;&#x672C;&#x88AB;&#x5206;&#x5272;&#x4F7F;&#x7528;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20; Aleuria aurantia (AAL) &#x548C;&#x63A5;&#x9AA8;&#x9ED1;&#x8D28;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20; &#xFF08;SNA&#xFF09;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5206;&#x522B;&#x786E;&#x8BA4;&#x5CA9;&#x85FB;&#x7CD6;&#x548C;&#x553E;&#x6DB2;&#x9178;&#x3002;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x5206;&#x6570;&#x662F;&#x9176; N deglycosylated &#x548C;&#x6DB2;&#x76F8;&#x8272;&#x8C31;-&#x8D28;&#x8C31;/&#x8D28;&#x8C31;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x603B;&#x8BA1;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E86; 533 &#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;~ 90%&#x7684;&#x662F;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x8868;&#x9762;&#x6216;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5916;&#x57FA;&#x8D28;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230; 1011&#x5E74;&#x72EC;&#x7279;&#x7684; glycosites&#x3001; &ge;3 &#x4E09;&#x91CD;&#x8D1F;&#x6570;&#x884C;&#x53EA;&#x53D1;&#x73B0;&#x4E86;&#x5176;&#x4E2D;&#x7684; 100&#x3002;&#x7EDF;&#x8BA1;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x8FD9;&#x4E9B; glycosites &#x4E09;&#x8D1F;&#x5177;&#x4F53;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x4E3A;&#x6B64;&#x80BF;&#x7624;&#x5B50;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x3002;RNAseq &#x6570;&#x636E;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x5927;&#x7EA6;&#x4E00;&#x534A;&#x7684;&#x7F16;&#x7801;&#x8FDB;&#x884C;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x8BB0;&#x7269; glycosites &#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x652F;&#x67B6;&#x7684;&#x5206;&#x6CCC;&#x662F;&#x4E0A;&#x8C03;&#x4E2D;&#x4E09;&#x8D1F;&#x4E0E;&#x9C81;&#x7C73;&#x90A3;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7CFB;&#xFF0C;&#x548C;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7F16;&#x7801; fucosyl &#x6216; sialyltransferases &#x8868;&#x8FBE;&#x4E4B;&#x95F4;&#x4E24;&#x79CD;&#x4E9A;&#x578B;&#xFF0C;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x4E2D;&#x7CD6;&#x57FA;&#x5316;&#x7684;&#x6539;&#x53D8;&#x4E5F;&#x53EF;&#x80FD;&#x9A71;&#x52A8;&#x5019;&#x9009;&#x9274;&#x5B9A;&#x3002;&#x503C;&#x5F97;&#x6CE8;&#x610F;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5047;&#x5B9A;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x88AB;&#x6D3E;&#x751F;&#x7684;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x53C2;&#x4E0E;&#x4E86;&#x4E0E;&#x764C;&#x75C7;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x53EF;&#x80FD;&#x8868;&#x793A;&#x6B64;&#x4FB5;&#x7565;&#x6027;&#x80BF;&#x7624;&#x4E9A;&#x578B;&#x65B0;&#x578B;&#x6CBB;&#x7597;&#x9776;&#x70B9;&#x3002;

&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x8272;&#x8C31;/&#x8D28;&#x8C31;&#x6CD5;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x53D1;&#x73B0;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6D41;&#x6807;&#x8BC6;&#x4FB5;&#x7565;&#x6027;&#x4E73;&#x817A;&#x764C;&#x6307;&#x8BA4;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7684;&#x7269;&#x3002;

We used a lectin chromatography/MS-based approach to screen conditioned medium from a panel of luminal (less aggressive) and triple negative (more aggressive) breast cancer cell lines (n = 5/subtype). The samples were fractionated using the lectins Aleuria aurantia (AAL) and Sambucus nigra agglutinin (SNA), which recognize fucose and sialic acid, respectively. The bound fractions were enzymatically N-deglycosylated and analyzed by LC-MS/MS. In total, we identified 533 glycoproteins, ~90% of which were components of the cell surface or extracellular matrix. We observed 1011 unique glycosites, 100 of which were solely detected in â‰¥3 triple negative lines. Statistical analyses suggested that a number of these glycosites were triple negative-specific and thus potential biomarkers for this tumor subtype. An analysis of RNAseq data revealed that approximately half of the mRNAs encoding the protein scaffolds that carried potential biomarker glycosites were upregulated in triple negative vs. luminal cell lines, and that a number of genes encoding fucosyl- or sialyltransferases were differentially expressed between the two subtypes, suggesting that alterations in glycosylation may also drive candidate identification. Notably, the glycoproteins from which these putative biomarker candidates were derived are involved in cancer-related processes. Thus, they may represent novel therapeutic targets for this aggressive tumor subtype.

A lectin chromatography/mass spectrometry discovery workflow identifies putative biomarkers of aggressive breast cancers.

Nous avons utilis&eacute; une lectine chromatographie/MS-based approach to &eacute;cran conditionn&eacute; moyen d&#39;un panel de luminal (moins agressif) et triple n&eacute;gatif (plus agressives) lign&eacute;es cellulaires de cancer du sein (n = 5/sous-type). Les &eacute;chantillons ont &eacute;t&eacute; fractionn&eacute;s en utilisant les lectines Aleuria aurantia (AAL) et le Sambucus nigra agglutinine (SNA), qui reconnaissent le fucose et l&#39;acide sialique, respectivement. Les fractions de la li&eacute; ont &eacute;t&eacute; enzymatiquement N-d&eacute;glycosyl&eacute;e et analys&eacute;s par LC-MS/MS. Au total, nous avons identifi&eacute; des 533 glycoprot&eacute;ines, dont environ 90 % &eacute;taient des composants de la cellule de matrice extracellulaire ou de surface. Nous avons observ&eacute; glycosites unique 1011, 100 qui ont &eacute;t&eacute; d&eacute;tect&eacute;s uniquement dans &ge;3 triple lignes n&eacute;gatives. Analyses statistiques sugg&egrave;rent qu&#39;un certain nombre de ces glycosites &eacute;tait triple n&eacute;gatif sp&eacute;cifique et, par cons&eacute;quent, les biomarqueurs potentiels pour ce sous-type de la tumeur. Une analyse des donn&eacute;es de RNAseq a r&eacute;v&eacute;l&eacute; qu&#39;environ la moiti&eacute; de l&#39;ARNm codant pour les &eacute;chafaudages de prot&eacute;ine qui a effectu&eacute; glycosites de biomarqueurs potentiels sont surexprim&eacute;s dans triple n&eacute;gatif par rapport &agrave; des lign&eacute;es de cellules luminales et qu&#39;un certain nombre de g&egrave;nes codant pour la fucosyl - ou sialyltransf&eacute;rases ont &eacute;t&eacute; exprim&eacute; de fa&ccedil;on diff&eacute;rentielle entre les deux sous-types, sugg&eacute;rant que les alt&eacute;rations dans la glycosylation peuvent conduire aussi identification du candidat. Notamment, les glycoprot&eacute;ines d&#39;o&ugrave; provenaient ces candidats putatifs biomarqueurs sont impliqu&eacute;s dans les processus li&eacute;s au cancer. Ainsi, elles peuvent repr&eacute;senter de nouvelles cibles th&eacute;rapeutiques pour ce sous-type de tumeur agressive.

Un workflow de d&eacute;couverte de lectine chromatography/mass spectrometry identifie des biomarqueurs putatifs des cancers du sein agressifs.

Wir verwendeten einen Lektin Chromatographie/MS-Ansatz zum Bildschirm bedingt Medium von einem Gremium der luminalen (weniger aggressiv) und dreifach negativ (aggressivere) Brust-Krebs-Zelllinien (n = 5/Subtyp). Die Proben wurden fraktioniert unter Verwendung der Lektine Orangeroter Aurantia (AAL) und Sambucus Nigra Agglutinin (SNA), die Fucose und Sialins&auml;ure, bzw. zu erkennen. Die gebundenen Br&uuml;che wurden enzymatisch N-Deglycosylated und von LC-MS/MS analysiert. Wir identifiziert insgesamt 533 Glykoproteine, ~ 90 % davon Bestandteile der Zelle waren Oberfl&auml;che oder extrazellul&auml;re Matrix. Wir beobachteten 1011 einzigartige Glycosites, von die 100 allein in &ge;3 dreifach negative Linien erkannt wurden. Statistische Analysen vorgeschlagen, dass eine Anzahl von diesen Glycosites Triple negativ-spezifische und damit potenzielle Biomarker f&uuml;r diesen Tumor-Untertyp waren. Eine Analyse von RNAseq Daten ergab, dass rund die H&auml;lfte der mRNAs, die Codierung der Protein-Ger&uuml;sten, die potenzielle Biomarker-Glycosites durchgef&uuml;hrt herraufreguliert im Triple negativen vs. luminalen Zelllinien waren und eine Anzahl von Genen, die Fucosyl- oder Sialyltransferases-Codierung differentiell zum Ausdruck kamen, zwischen die zwei Untertypen, die darauf hindeutet, dass Ver&auml;nderungen in Glycosylation Kandidaten Identifikation auch fahren k&ouml;nnen. Insbesondere sind die Glykoproteine, aus denen diese vermeintliche Biomarker-Kandidaten abgeleitet wurden, in Krebs-in Verbindung stehenden Prozessen beteiligt. So k&ouml;nnen sie neuartige therapeutische Ziele f&uuml;r diese aggressiven Tumor-Untertyp vertreten.

Ein Lektin Chromatographie/Masse Spektrometrie Entdeckung Workflow bezeichnet vermeintliche Biomarker aggressive Brustkrebserkrankungen.

Abbiamo usato un lectin cromatografia/MS approccio allo schermo condizionato medio da un panel di luminal (meno aggressivo) e triple negative (pi&ugrave; aggressivi) linee di cellule di cancro di seno (n = 5/sottotipo). I campioni sono stati frazionati utilizzando le lectine Aleuria aurantia (AAL) e Sambucus nigra agglutinina (SNA), che riconoscono il fucosio e acido sialico, rispettivamente. Le frazioni di legato erano enzimaticamente N-deglycosylated e analizzati da LC-MS/MS. In totale, abbiamo identificato 533 glicoproteine, ~ 90% dei quali erano componenti della cellula matrice extracellulare o superficiale. Abbiamo osservato glycosites unico 1011, 100 delle quali sono state rilevate esclusivamente in &ge;3 triplo negativo linee. Analisi statistiche ha suggerito che un certo numero di queste glycosites era triplo negativo-specifici e quindi potenziali biomarcatori per questo sottotipo di tumore. Un&#39;analisi dei dati RNAseq ha rivelato che circa la met&agrave; dei mRNAs encoding i ponteggi di proteina che portava potenziale biomarcatore glycosites erano sovraregolati nel triplo negativo vs linee cellulari del lume, e che un certo numero di geni che codificano per fucosyl - o sialyltransferases furono differenzialmente espressi tra i due sottotipi, suggerendo che alterazioni nella glicosilazione possono anche guidare l&#39;identificazione del candidato. In particolare, le glicoproteine da cui derivano questi candidati biomarcatore putativo sono coinvolti nei processi legati al cancro. Cos&igrave;, possono rappresentare nuovi bersagli terapeutici per questo sottotipo di tumore aggressivo.

Un flusso di lavoro scoperta di lectin cromatografia massa spettrometria identifica putativi biomarcatori di tumori al seno aggressivo.

&#x30A8;&#x30A2;&#x30B3;&#x30F3;&#x753B;&#x9762;&#x3078;&#x306E;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3; &#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;/MS &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9; &#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x5A92;&#x4F53; &#xFF08;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306A;) &#x5185;&#x8154;&#x306E;&#x30D1;&#x30CD;&#x30EB;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30EB;&#x8CA0;&#x306E; (&#x3088;&#x308A;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306A;&#xFF09; &#x4E73;&#x623F;&#x304C;&#x3093;&#x7D30;&#x80DE;&#x682A; (n = 5/&#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;)&#x3002;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB; &#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3; Aleuria aurantia (AAL) &#x3068;&#x30CB;&#x30EF;&#x30C8;&#x30B3; &#x30CB;&#x30B0;&#x30E9;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20; (SNA) &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30D5;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x3068;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EB;&#x9178;&#x3092;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x8A8D;&#x8B58;&#x5206;&#x753B;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5206;&#x6570;&#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066; N deglycosylated &#x3068; LC MS/MS &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5408;&#x8A08;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F; &#x301C; 90% &#x3092;&#x5360;&#x3081;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8; &#x30BB;&#x30EB;&#x306E; 533 &#x306E;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8B58;&#x5225;&#x8868;&#x9762;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3002;100 &#x306F;&#x3082;&#x3063;&#x3071;&#x3089; 3 &#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30EB; &#x30CD;&#x30AC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x884C;&#x3067;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x305F; 1011&#x5E74;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A; glycosites &#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7D71;&#x8A08;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E; glycosites &#x306E;&#x6570;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30EB;&#x8CA0;&#x56FA;&#x6709;&#x3001;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3053;&#x306E;&#x816B;&#x760D;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA; &#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;RNAseq &#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x7D04;&#x534A;&#x5206;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA; &#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC; glycosites &#x3092;&#x904B;&#x3093;&#x3060;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8DB3;&#x5834;&#x3092;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0; Mrna &#x306E;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30EB; luminal &#x30BB;&#x30EB;&#x7DDA;&#x5BFE;&#x30CD;&#x30AC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3067;&#x4EA2;&#x9032;&#x3092;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x30D5;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EA;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6570;&#x306F;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x7CD6;&#x9396;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3082;&#x5019;&#x88DC;&#x30C9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x306E;&#x8B58;&#x5225;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x306F;&#x3001;2 &#x3064;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x9593;&#x306B;&#x8868;&#x73FE;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7279;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x63A8;&#x5B9A;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA; &#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x5019;&#x88DC;&#x306E;&#x6D3E;&#x751F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x304C;&#x3093;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x3053;&#x306E;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306A;&#x816B;&#x760D;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x8868;&#x3059;&#x5834;&#x5408;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3; &#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;/&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x6CD5;&#x691C;&#x51FA;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x653B;&#x6483;&#x7684;&#x306A;&#x4E73;&#x764C;&#x306E;&#x63A8;&#x5B9A;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA; &#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xD654;&#xBA74; &#xC870;&#xC808; lectin &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C;/MS &#xAE30;&#xBC18; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xC6B0;&#xB9AC; (&#xB35C; &#xACF5;&#xACA9;&#xC801;) luminal &#xD328;&#xB110;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9E4;&#xCCB4;&#xC640; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C; &#xC74C;&#xC218; (&#xACF5;&#xACA9;&#xC801;&#xC778;) &#xC720; &#xBC29; &#xC554; &#xC138;&#xD3EC; &#xB77C;&#xC778; (n = 5/&#xD558;&#xC704; &#xD615;&#xC2DD;). &#xC0D8;&#xD50C;&#xC740; fractionated lectins Aleuria aurantia (AAL) &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; Sambucus nigra agglutinin (SNA)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC01;&#xAC01; fucose&#xC640; sialic &#xC0B0;&#xC744; &#xC778;&#xC2DD; &#xD558;&#xB294;. &#xBC14;&#xC6B4;&#xB4DC; &#xBD84;&#xC218; enzymatically N deglycosylated &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0;, LC-MS/MS&#xB85C; &#xBD84;&#xC11D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xCD1D;&#xC5D0;&#xC11C; 533 glycoproteins ~ 90%&#xB294; &#xD588;&#xB2E4; &#xC140;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD45C;&#xBA74; &#xB610;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;. 1011 &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; glycosites&#xB294; 100 &ge;3 &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xB77C;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB41C; &#xC804;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD00;&#xCC30; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD1B5;&#xACC4; &#xBD84;&#xC11D; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; glycosites &#xC218; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C; &#xBD80;&#xC815; &#xAD00;&#xB828; &#xD558; &#xACE0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;&#xC774; &#xC885;&#xC591; &#xD558;&#xC704; &#xD615;&#xC2DD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xB9C8;&#xCEE4;&#xC758; &#xD588;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; &#xD588;&#xB2E4;. RNAseq &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D; &#xC57D; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C; luminal &#xC140; &#xB77C;&#xC778;, &#xB300; &#xC74C;&#xC218;&#xC5D0; upregulated &#xC788; &#xC5C8; &#xC808;&#xBC18; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; biomarker glycosites &#xC6B4;&#xBC18; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC74;&#xC124; &#xAE30;&#xACC4; &#xC784;&#xB300; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; mRNAs &#xC778;&#xCF54;&#xB529; fucosyl &#xB610;&#xB294; sialyltransferases &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC218; &#xBCC0;&#xACBD; glycosylation &#xD6C4;&#xBCF4; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xC744; &#xAD6C;&#xB3D9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xB450; &#xD558;&#xC704; &#xC0AC;&#xC774; &#xCC28;&#xB3D9; &#xD45C;&#xD604; &#xD588;&#xB2E4; &#xBC1D;&#xD614;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xD788;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC0C1; biomarker &#xD6C4;&#xBCF4; &#xD30C;&#xC0DD; &#xB41C; glycoproteins &#xC554; &#xAD00;&#xB828; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740;&#xC774; &#xACF5;&#xACA9;&#xC801;&#xC778; &#xC885;&#xC591; &#xD558;&#xC704;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xCE58;&#xB8CC; &#xBAA9;&#xD45C;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0BC; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Lectin &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C;/&#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xAC80;&#xC0C9; &#xC6CC;&#xD06C;&#xD50C;&#xB85C; &#xACF5;&#xACA9;&#xC801;&#xC778; &#xC720;&#xBC29;&#xC554;&#xC758; &#xC0C1; biomarkers&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Utilizamos un lectina cromatograf&iacute;a/MS-enfoque basado en pantalla acondicionado medio de un panel de luminal (menos agresivo) y triple negativo (m&aacute;s agresivas) l&iacute;neas de c&eacute;lulas de c&aacute;ncer de mama (n = 5/subtipo). Las muestras fueron fraccionadas utilizando las lectinas Aleuria aurantia (AAL) y Sambucus nigra aglutinina (SNA), que reconocen la fucosa y &aacute;cido si&aacute;lico, respectivamente. Las fracciones consolidadas fueron enzim&aacute;tico N-deglycosylated y analizan por LC-MS/MS. En total, se identificaron 533 glicoprote&iacute;nas, ~ 90% de los cuales eran los componentes de la c&eacute;lula matriz extracelular o superficial. Observamos 1011 &uacute;nico glycosites, 100 de los cuales fueron detectados &uacute;nicamente en l&iacute;neas negativas triple &ge; 3. An&aacute;lisis estad&iacute;stico indicaron que varios de estos glycosites fueron triple negativo espec&iacute;fico y as&iacute; potenciales biomarcadores para este subtipo de tumor. Un an&aacute;lisis de datos RNAseq revel&oacute; que aproximadamente la mitad de los mRNAs de codificaci&oacute;n de los andamios de la prote&iacute;na que lleva a glycosites de biomarcadores potenciales fueron alza en triple negativo frente a l&iacute;neas celulares luminal, y que un n&uacute;mero de genes que codifican Fucosil - o sialiltransferasas fueron expresado diferencialmente entre los dos subtipos, sugiriendo que alteraciones en la glicosilaci&oacute;n pueden conducir tambi&eacute;n identificaci&oacute;n de candidatos. En particular, las glicoprote&iacute;nas de la que se derivan estos candidatos putativos biomarcador participan en procesos relacionados con el c&aacute;ncer. As&iacute;, pueden representar nuevas dianas terap&eacute;uticas para este subtipo de tumor agresivo.

Un flujo de descubrimiento de lectinas cromatograf&iacute;a/masa espectrometr&iacute;a identifica posibles biomarcadores del c&aacute;ncer de mama agresivo.

Richard K. Niles

Obstetrics,
Gynecology and Reproductive Sciences,
Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences

University of California, San Francisco - UCSF

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Richard K. Niles

Obstetrics,Gynecology and Reproductive Sciences,Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences

University of California, San Francisco - UCSF

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Obstetrics,
Gynecology and Reproductive Sciences,
Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences