Nasz protokół opisuje nową metodę oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów triazolowych pestycydów w roślinach. Kultura kalusa roślinnego jest wykorzystywana do wytwarzania metabolitów białek w roślinach, a następnie przeprowadza się testy toksykologiczne z wykorzystaniem ludzkiej linii komórkowej w celu oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów. Metabolity ksenobiotyków w roślinach są niezwykle złożone i można uzyskać tylko kilka stanowisk metabolitów.
W związku z tym dług toksykologiczny metabolitów jest ograniczony, co zagraża kompleksowej ocenie toksyczności. W protokole tym zaproponowano strategię oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów pestycydów triazolowych w roślinach. W tym protokole nośniki roślinne i modele komórek ludzkich są łączone w celu uzyskania integralnej oceny cytotoksyczności metabolitów pestycydów triazolowych w roślinach.
Pozwala to uniknąć skomplikowanych etapów i separacji metabolitów, zapewniając w ten sposób nowy dług do precyzyjnej, wiarygodnej oceny. Zacznij od potraktowania zebranego kalusa marchwi różnymi pestycydami triazolowymi w sterylnych warunkach. W tym celu w oddzielnych szklanych kolbach wykonuje się trzy gramy kalusa marchwi z 10 mililitrami każdego roztworu pestycydu przygotowanego na pożywce MS.
Wymieszaj również trzy gramy kalusa marchwi z 10 mililitrami aseptycznego podłoża MS w innej szklanej kolbie. Przygotowane próbki kalusa marchwi inkubować przy 130 obr./min i 26 stopniach Celsjusza w ciemności przez 72 godziny. Ustaw wszystkie zabiegi w trzech egzemplarzach.
Po inkubacji, za pomocą filtrów z włókna szklanego o grubości 0,5 mikrona, zbierz kalus marchwi z pożywki przez filtrację. Umyj modzel ultraczystą wodą trzy razy. Na koniec liofilizuj kalus za pomocą liofilizatora w temperaturze minus 55 stopni Celsjusza, a następnie homogenizuj je za pomocą wysokowydajnego młynka do tkanek o częstotliwości 70 Hz przez trzy minuty.
Stężenia wszystkich pestycydów w pożywkach hodowlanych gwałtownie spadły. Podczas gdy te w modzelach marchwi zaczęły się zwiększać, osiągając szczyt po czterech lub ośmiu godzinach, po czym nastąpił stopniowy spadek. Wyniki te sugerowały, że pestycydy były szybko wchłaniane i przekształcane przez kalus marchwi.
Czasowe odzyskiwanie pestycydów w systemie hodowli kalusa wykazało, że po 72-godzinnej inkubacji pozostało tylko 8,3 do 11% pestycydów, co wskazuje, że większość pestycydów została przekształcona w metabolity. Na początek wymieszaj 0,2 grama zmielonego proszku z każdej liofilizowanej, poddanej pestycydom próbki kalusa marchwi z trzema mililitrami acetonitrylu w 10-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować probówkę wirówkową przez osiem minut, a następnie poddawać ją sonikacji przez pięć minut z mocą 150 watów i 40 kiloherców.
Następnie odwirować probówkę o stężeniu 8 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut przed pobraniem supernatantu przez pipetowanie. Za pomocą koncentratora przedmuchiwania azotem w temperaturze 40 stopni Celsjusza skoncentruj zebrane ekstrakty do sucha. Ponownie rozpuść pozostałości ekstraktu w jednym mililitrze DMEM zawierającym 0,3% DMSO, aby uzyskać roztwór ekspozycji na metabolit pestycydu.
W podobny sposób należy ponownie rozpuścić pozostałości ekstraktu otrzymanego z ślepych próbek kalusa w jednym mililitrze DMEM zawierającym 0,3% DMSO. Następnie rozpuścić jeden miligram każdego użytego pestycydu w różnych probówkach zawierających roztwór pozostałości ślepej próbki, aby uzyskać macierzyste roztwory ekspozycji na pestycydy. Przystąp do pasażu komórek po ich hodowli, aż osiągną gęstość komórek powyżej 80%Po odrzuceniu pożywki hodowlanej umyj komórki trzykrotnie PBS.
Następnie dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny-EDTA do kolby i równomiernie rozprowadź go, aby uzyskać pełny kontakt z komórkami. Gdy komórki zmienią się z przylegającego kształtu na małe okrągłe punkty, jak obserwuje się pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu, usuń roztwór trawienny. Delikatnie postukaj w ściankę kolby, aby odłączyć komórki.
Dodaj dwa mililitry DMEM i powtórz płukanie ścianki kolby 10 razy. Delikatnie postukać w ściankę kolby i przenieść jeden mililitr zawiesiny komórek do innej szklanej kolby. Dodaj pięć mililitrów DMEM do każdej szklanej kolby.
Delikatnie postukaj w ściankę kolby, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż gęstość komórek przekroczy 80%Kontynuuj wykonywanie testu ekspozycji, gdy zostanie zebrana wystarczająca liczba komórek do tego samego. Delikatnie postukaj w ściankę kolby zawierającej komórki, aby rozprowadzić je równomiernie i przenieś zawiesiny komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.
Rozcieńczyć zawiesinę komórek DMEM w połączeniu z cytometrią, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Delikatnie postukaj w ściankę kolby, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS do zewnętrznych dołków płytki 96-dołkowej, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej z powodu efektu krawędzi.
Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do lewych dołków płytki i pozostawić na 10 minut. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Po wyjęciu płytki 96-dołkowej z inkubatora należy wyrzucić pożywkę hodowlaną.
Aby ustalić grupę metabolitów pestycydów, dodaj 100 mikrolitrów różnych przygotowanych roztworów narażenia na pozostałości pestycydów do każdej wyznaczonej studzienki, a następnie dodaj 100 mikrolitrów różnych przygotowanych roztworów narażenia na pestycydy rodzicielskie do każdej wyznaczonej studzienki w celu porównania, aby ustalić grupę rodzicielską pestycydów. W celu ustawienia ślepej próby kontrolnej dodaj 100 mikrolitrów DMEM zawierającego 0,3% DMSO do każdej wyznaczonej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.
Na początek należy pobrać 96-dołkową płytkę zawierającą komórki z inkubatora po 24-godzinnej ekspozycji na roztwory ekstraktów metabolitów. Usunąć pożywkę hodowlaną i przeprowadzić podwójne płukanie komórek za pomocą PBS. Wprowadź 100 mikrolitrów DMEM do każdej studzienki, a następnie dodaj 10 mikrolitrów odczynników CCK8.
Zapewnij równomierne rozłożenie komórek, delikatnie potrząsając płytką. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny. Na koniec przeprowadź pomiar gęstości optycznej przy 450 nanometrach za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego.
Nie stwierdzono istotnej różnicy między żywotnością komórek metabolitu pestycydu a grupą kontrolną, co wskazuje na brak cytotoksyczności metabolitów pestycydów. Żywotność komórek w grupie rodzicielskiej pestycydów była znacznie niższa w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na oczywistą cytotoksyczność.
