Após a glicólise, as moléculas de piruvato carregadas entram nas mitocôndrias por transporte ativo e passam por três reações enzimáticas. Essas reações garantem que o piruvato possa entrar na próxima via metabólica para que a energia armazenada nas moléculas de piruvato possa ser aproveitada pelas células.

Primeiro, a enzima piruvato desidrogenase remove o grupo carboxilo do piruvato e liberta-o como dióxido de carbono. A molécula clivada é então oxidada e liberta eletrões, que são então capturados por NAD+ para produzir NADH, formando acetato.

Por fim, a coenzima A—um composto contendo enxofre derivado de uma vitamina B—liga-se ao acetato através do seu átomo de enxofre para criar a acetilcoenzima A, ou Acetil-CoA. Acetil-CoA move-se então para o ciclo do ácido cítrico onde será ainda mais oxidada.