Micro-drive Array para Crônica In vivo: Assembléia Tetrodo

Resumo

Neste protocolo, demonstramos como fabricar e tetrodes condição para uso com uma matriz de micro-drive, que foi projetada para gravações eletrofisiológicas crônica em ratos. Além disso, ilustram as fases finais do micro-drive de construção da matriz, que inclui a instalação de fios de aterramento e um cone de proteção.

Resumo

O tetrode, um pacote de quatro eletrodos, tem provado ser uma ferramenta valiosa para a gravação simultânea de múltiplos neurônios in-vivo. A amplitude diferencial de assinaturas do potencial de ação sobre os canais de um tetrode permite o isolamento da unidade única atividade da unidade de multi-sinais. A capacidade de controlar com precisão a localização estereotáxica e profundidade do tetrode é fundamental para estudar a atividade neural coordenada em todas as regiões do cérebro. Em combinação com uma matriz de unidade micro-, é possível alcançar posicionamento preciso e estável de controle tetrodes muitos ao longo de dias ou semanas. Neste protocolo, demonstramos como fabricar e tetrodes condição usando ferramentas básicas e materiais, instalar o tetrodes em uma matriz tetrode multi-disco para doenças crônicas in vivo de gravação no rato, fazer conexões fio terra para a matriz de micro-drive, e anexar um cone de proteção em série na unidade de micro-, a fim de proteger a tetrodes do contato físico com o meio ambiente.

Protocolo

1. Fabricação de tetrodes

1. Iniciar a construção de um tetrode pela obtenção de um 50 cm de comprimento, poliimida isolado, ni-cromo fio com um núcleo de diâmetro 12,5 micra. Dobre o arame ao meio. Correr os dedos ao longo do par para fazê-los ficarem juntos. Verifique se o par de fios de ter um bom contato durante toda a sua extensão.
2. Dobre a par de novo, segurando as duas pontas. Certifique-se que o laço formado em uma extremidade não está dobrada. Corte a quatro fios na extremidade não-looped para que os quatro dicas são alinhados.
3. Para a próxima etapa, você vai precisar de um jacaré modificado, um dispositivo de giro motorizado, e uma barra horizontal acima do dispositivo de giro. O jacaré é modificado por colagem de uma barra de plástico à base do clipe. Onde as pontas do fio são expostos, prender a quatro fios, juntamente com o clipe de jacaré modificado. Pendurar o laço de fios por cima da barra horizontal. Coloque o jacaré para o palco motorizado.
4. Aplicar 80 clock-wise torce seguida de 40 voltas dos ponteiros do relógio contra o conjunto de cabo ao longo de aproximadamente três minutos. Estes parâmetros podem ser variados de acordo com suas necessidades.
5. Após a torção tetrode estiver concluída, fundir os fios juntos por aquecimento a partir de três ângulos diferentes, com uma pistola de calor (420 ° C ou 790 ° F), utilizando média-baixa vazão. Para cada ângulo, comece 1-2 cm abaixo de onde o conjunto de cabo divide, execute o injetor de calor para baixo e para cima a uma distância de 2 cm dos fios por cerca de 5 segundos. Tenha cuidado as altas temperaturas vão derreter completamente o isolamento e provocar curto-circuitos.
6. Agora que os fios têm fundidos, remova o tetrode do aparelho torcer suavemente levantar o jacaré para aliviar a tensão sobre o tetrode, e cortar o tetrode perto do jacaré. Na outra ponta, corte o laço de tal forma que existem quatro eixos não-ligado de fio de comprimento igual.
7. Em seguida, separe os fios de cabelo no topo por dobrando os fios com uma pinça com ponta macia.
8. O tetrode está agora pronto para carregar na matriz micro-drive. Faça 21-25 mais tetrodes e armazená-los em uma caixa livre de poeira até que seja tempo para o processo de carregamento tetrode.

2. Carregando o tetrodes e fios de aterramento na matriz micro-drive

1. Para continuar, você precisará de um conjunto de micro-drive completo. Se você ainda não construiu um, consulte o vídeo 'array drive-Micro para doenças crônicas in-vivo gravação:. Fabricação drive' Em nosso plano de design, o tetrode será anexado em uma extremidade para hardware de conexão, e será executado através do tubo transportador poliimida na unidade de micro-tal forma que as pontas de eletrodos se estendem abaixo da base da unidade matriz-micro.
2. Antes de começar, construir uma unidade de suporte que pode ser conectada à placa conector em uma extremidade e na outra extremidade, podem ser fixadas por um Panavise. Neste exemplo, o titular da unidade é um conector de moinho-max colada a uma extremidade de um cabo da faca X-Acto (Figura 1c).
3. Segurando o tetrode com pinças com ponta macia e usando um estereoscópio, empurre a ponta do tetrode no poliimida tubo transportador de uma das unidades de micro-. Empurrar o tetrode no tubo até que o eletrodo fios individuais estão perto do conector da placa no topo da unidade matriz. Tenha cuidado para não torcer ou dobrar os fios, pois isso fará com que o tetrode para entrar no cérebro em um ângulo, em vez de perpendicular, e vai enfraquecer a integridade do tetrode.
4. Suavemente alimentar o outro lado dos quatro fios em seus respectivos furos na placa de interface eletrodo usando uma pinça com ponta macia. Novamente, evite torcer ou dobrar os fios. Com todos os quatro fios no lugar, empurre os pinos de ouro em seus buracos com um par de alicates que possuem uma mandíbula inferior encurtado. Quando os pinos são empurrados para dentro do buraco, eles vão retirar o isolamento de fios e criar uma conexão elétrica.
5. Para posterior referência, manter o controle do mapeamento entre o micro-drives e posição do pino na placa de interface eletrodo.
6. Continuar a carregar um total de 18 tetrodes. Os três restantes micro-drives no array serão usados ​​para abrigar os eletrodos de referência. Cada eletrodo de referência é feita de um tetrode que usa apenas uma das quatro extremidades dos fios não colados. Para prender os eletrodos de referência, siga o procedimento de carregamento, mas anexar apenas um dos quatro eletrodos para o pino de referência respectivos eletrodo na placa do conector.
7. Se você está planejando gravações multi-site, pode ser útil para planejar as conexões do tetrodes ao conector da placa antes do tempo. Isso deve minimizar a possibilidade de ajustar o tetrode errado durante as experiências.
8. Após o carregamento tetrode estiver concluída, fazer dois fios de aterramento, um para o animal e uma para o cone de proteção. Cortar uma 6 'fio de aço longo isolados (texto: 0,005 "de diâmetro) e remover 3 mm de isolamento, usando uma pinça de metal, de cada extremidade do fio. Em seguida, corte a 4'Fio de aço longo isolados (texto: 0,005 "de diâmetro). Remover 3 mm de isolamento de um lado e 1 cm na outra extremidade.
9. Route fio 6 'chão através do buraco do lado da unidade matriz micro-e até para a placa de interface. Ligue o fio exposto à placa de interface eletrodo com um alfinete de ouro para o buraco terreno designado. Este fio vai ligar ao crânio do animal.
10. Encaminhar a 4 'paralela fio terra para o fio terra instalado anteriormente. Conecte a extremidade 3 milímetros despido até a placa de interface eletrodo usando um alfinete de ouro em outro buraco terreno designado. Este fio será posteriormente ligado a um cone de proteção, que funcionará como uma gaiola de Faraday pequenos para reduzir a captação de ruídos. Estamos agora a terminar fios de ligação e pode continuar com o nosso tetrodes refino.

3. Ajuste o comprimento do tetrodes

1. Nosso objetivo neste processo é cortar todas as tetrodes de modo que sejam um pouco mais do que a profundidade da estrutura do cérebro alvo. No nosso exemplo, as unidades de micro-são projetados para uma viagem máximo de 5-6 mm, suficiente para chegar a muitas áreas neocortical e do hipocampo dorsal de um rato adulto. Primeiro, baixar todas as unidades de micro-para que o máximo tetrodes são expostos. Simultaneamente cortar todas as tetrodes aos comprimentos que são cerca de 5 mm mais comprido do que o comprimento final desejado usando um par de tesouras afiadas bem.
2. Para o corte final, preparar um par de tesouras serrilhadas em um Panavise. Grampo uma alça com um ligeiro ângulo para baixo e com serrilhas virado para cima, deixando a outra alça balançando.
3. Agora retirar completamente todas as tetrodes em suas cânula guia, transformando as unidades de micro-up.
4. Utilizando um estereoscópio, estender completamente um tetrode fora de sua cânula. Usando uma régua posição, a tesoura serrilhada na distância desejada da cânula guia. Lenta e suavemente cortar o tetrode com um movimento suave. Após este tetrode foi cortada, retirar o micro-drive por 3-4mm. Repita esse processo para cada tetrode até que todos tenham sido cortadas. Neste ponto você está pronto para revestimento de ouro.

4. Revestimento de ouro de tetrodes e verificar a qualidade

Chapeamento de ouro os fios tetrode nichrome é fundamental para gravações de longa duração estável. Ela impede a corrosão e biocompatibilidade melhora.

1. Instalação do medidor de impedância no modo externo eo gerador de corrente DC no modo de verificação com saída de áudio (Figura 1d). Toque os dois terminais do gerador de corrente aos seis possíveis pares de canais dentro de cada tetrode, e usar o feedback de áudio para determinar se existem calções entre pares. Se existe um curto, re-cortar o tetrode com tesoura serrilhada e teste novamente. Se o problema persistir, descarte o tetrode e substituí-lo.
2. Quando não existem bermuda dentro de todos os tetrodes, mover todas as unidades micro-down, estendendo-se todos os tetrodes tão longe quanto possível.
3. Modificar a configuração do equipamento para verificação de impedância do eletrodo (Figura 1e). Agora mergulhe as pontas de todos os tetrodes em um banho de solução sobre-padrão. O banho de ouro é eletricamente conectada ao terminal positivo do medidor de impedância. Verifique a impedância do eletrodo tocando o polo negativo do medidor de impedância para o pino correspondente na placa do conector.
4. Medir e registrar a impedância de cada fio na matriz de micro-drive. Valores normais variam de MOhm 1-3.
5. No gerador de corrente, ajuste a corrente entre 1-3 mA. Em seguida, fixar firmemente o cabo negativo do medidor de impedância para o pino do conector da placa. Coloque o equipamento na configuração de galvanoplastia (Figura 1f). No medidor de impedância, rapidamente alternar entre o modo normal, no modo bypass, e nas costas. Enquanto estiver no modo bypass, atual vai passar pelo tetrode e solução de ouro, e ouro será revestida para a ponta do eletrodo. A impedância após cada rodada do chapeamento deve ser menor do que antes. Repita o pulso de corrente se a impedância não caia abaixo de 1 MOhm. Uma gama de impedâncias conservadora aceitáveis ​​são 250kOhm a 350 kOhm. Se a impedância cai abaixo de 200 kOhm, isso pode indicar um curto-circuito.
6. Se depois de pulsos repetidos a impedância não cai bastante, a ponta do eletrodo pode ser obstruído. Re-corte a tetrode, verifique se há shorts, e repita o processo de ouro-plating. Se re-corte não ajudar, substituir o tetrode e começar de novo.
7. Após o plaqueamento todos tetrodes, mergulhe as pontas tetrode brevemente em etanol, e deixe-os secar durante 3-5 minutos.
8. Teste de curto-circuito dentro tetrodes usando o gerador de corrente com as pontas tetrode exposto ao ar. Se uma conexão DC existe entre dois ou mais eletrodos de um tetrode, re-cortar o tetrode, e placa de ouro novamente.
9. Depois de cosmética de todos os tetrodes está completo, adicionar uma gota de meio de espessura cola ciano-acrilato para a interface entre cada tetrode poliimida e sua tubulação. Isto irá assegurar a tetrode à sua unidade de micro-e manter o comprimento do tetrode.
10. Como etapa final, mova todos os tetrodes na unidade, transformando-se todos os parafusos.

5. Colocar o cone de proteção

O propósito do cone de proteção é para proteger micro-drives eo fio tetrode expostos a partir do ambiente. Ele também fornece suporte para manipulação durante um experimento e reduz o ruído elétrico. Nós usamos um 3-D cone de plástico impresso (Parte Referência I: a fabricação de carro). No entanto, é possível fazer o cone de outros materiais, como um pedaço dobrado de lata de refrigerante.

1. Pegue o cone de plástico e corrigir alguns fita de alumínio para a superfície interna ou externa.
2. Em seguida, faça um furo pequeno (1,5 mm de diâmetro), através do cone e vagamente anexar um parafuso com uma arruela e porca dentro do cone. Isso servirá como uma passagem elétrica para o fio terra. Recomendamos a utilização de um parafuso de tamanho 00-80 e combinação de máquina de lavar.
3. Primeiro, insira e parcialmente volta de três parafusos 1-72 tamanho (3 / 16 polegadas de comprimento) nos lados do cone. Com a unidade matriz suspensos, insira o cone sobre a unidade. Certifique-se de ambos os fios terra se estendem desde o fundo da unidade matriz. Enrole a parte exposta do fio a 4 'do solo em torno de um dos parafusos 1-72 várias vezes e aperte o parafuso firmemente. Garantir o cone à base da unidade, apertando os dois parafusos restantes cone.
4. Por fim, pegue a 1 centímetro extremidade desencapada do fio-terra de curto e vento ao redor do parafuso, entre a fita de alumínio e máquina de lavar. Segura no chão, apertando o parafuso. Agora temos um array micro-drive que está no último pronto para implantação cirúrgica.

6. Resultados representativos

1. Micro-drive de produção da matriz é agora completa. Sua matriz de micro-drive é carregado com 18 tetrodes e 3 canais de referência. É envolto em um cone de proteção e tampa para maior durabilidade. A matriz micro-drive terminou com cone de proteção pesa 20g para 25g, em média.
2. A unidade matriz final é implantado com o procedimento cirúrgico padrão. Como você pode ver, o drive é conectado a um chip pré-amplificador e um conjunto de fios que transportam o sinal de dados de aquisição de hardware e software.

Figura 1: Esquema A) de tetrode configuração de torção. Uma barra horizontal suspende os fios não colados eletrodo do tetrode acima do dispositivo automático tetrode torção. B) de configuração para medição da impedância tetrode e revestimento do eletrodo. Quando a verificação de curtos-circuitos, o circuito é diferente:. O fio preto é ligado a um outro canal de eletrodo no conector da placa C) Um close-up de uma custom made ​​drive-micro ferramenta titular matriz. A barra cilíndrica é um cabo da faca X-Acto. O conector é uma linha de 26 pinos, duplo, Mill-max conector. As duas peças são unidas usando o acrílico dental. D Configuração) para verificar a curto prazo. Canal X e Y estão Canal quaisquer dois canais diferentes dos quatro canais tetrode. E) de configuração para medição da impedância do eletrodo. A fonte atual é 'off'. O medidor de impedância é definida como 'on' e 'teste'. F) de configuração para revestimento de ouro das pontas dos eletrodos. A fonte atual é definida como 'on', o áudio é 'on', o modo é "unipolar", Teste de DC é 'on', a corrente é definido como 2 microampères.

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Discussão

Este protocolo é a segunda parcela de um protocolo de duas partes: "Micro drive-matriz para crônica in vivo de gravação." A combinação da unidade de micro-array e tetrode é uma ferramenta poderosa para a obtenção de gravações simultâneas de muitos neurônios em uma vigília, comportando a preparação animal. Esperançosamente, nós fornecemos-lhe com todas as informações necessárias para que você vai precisar para começar ou melhorar gravações eletrofisiológicas em seu próprio laboratóri...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.