Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Resumo

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática de Xenopus laevis Oócitos com um substrato de importação nuclear, bem como a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte de microscopia eletrônica.

Resumo

Microinjeção de oócitos Xenopus laevis seguido por thin-corte de microscopia eletrônica (EM) é um excelente sistema para estudar o transporte nucleocytoplasmic. Por causa de seu grande núcleo e alta densidade dos complexos de poro nuclear (NPCs), o transporte nuclear pode ser facilmente visualizado no oócito Xenopus. Visão muito sobre os mecanismos de importação e exportação nuclear foi adquirida através do uso deste sistema (revisado por Pante, 2006). Além disso, temos utilizado microinjeção de oócitos Xenopus para dissecar as vias de importação nuclear de vários vírus que se replicam no núcleo host.

Aqui demonstramos a microinjeção citoplasmática de oócitos Xenopus com um substrato importação nuclear. Mostramos também a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte EM, incluindo dissecção, desidratação e incorporação dos oócitos em uma resina epóxi incorporação. Finalmente, fornecemos resultados representativos para oócitos que foram microinjeções do capsídeo do baculovírus nucleopoliedrovirus Autographa californica (AcMNPV) ou o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), e discutir possíveis aplicações da técnica.

Protocolo

Parte 1: Preparação de ovócitos para Xenopus microinjeção

1. Coloque um pedaço pequeno (cerca de 2 cm) de Xenopus ovário laevis em um tubo de 50 ml cônico contendo 20 ml de colagenase solução (5 mg / ml de colagenase em cálcio livre modificado Barth salina: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Colagenase é usado para remover as células do folículo que cercam os oócitos.
2. Colocar o tubo em uma plataforma shaker e rock-a gentilmente (a 100 RPM) por uma hora. Esse tempo varia com diferentes lotes de colagenase. Assim, após uma hora, dê uma pequena amostra de oócitos e examiná-las sob um microscópio de dissecação. Adequadamente de-folliculated oócitos devem ser bem separados um do outro, e isso deve ser fácil de inserir uma agulha de vidro no citoplasma do ovócito. Se os oócitos não são suficientemente de-folliculated, eles são deixados na solução de colagenase e verificados novamente a cada cinco minutos.
3. Lavar os oócitos três vezes com solução salina modificada Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 0,33 mM Ca (NO _{3) 2,} 0,41 mM CaCl _2, 10 Hepes mM, pH 7,5), e transferi-los para um de 100 mm de diâmetro prato de Petri contendo MBS mais 1% de penicilina / estreptomicina. Os ovócitos são agora pronto para ser microinjeção. Se microinjeção será realizada em outro dia, armazenar os ovócitos a 4 ° C por até uma semana.
4. Usando um microscópio de dissecação, selecione oócitos estágio maduro VI para microinjeção. Estes oócitos são grandes, com bom contraste entre o hemisfério negros de origem animal e do hemisfério cremosa de cor vegetal.
5. Transferência dos ovócitos maduros VI estágio em uma microplaca (Nunc, 10 mL de volume bem). Isto deve ser feito com cuidado, usando uma pipeta de 200 mL com uma ponteira que foi cortado no final para permitir sucção ininterrupta dos ovócitos.

Parte 2: microinjeção de oócitos Xenopus

1. Prepare o substrato de importação a microinjeção, adicionando uma pequena quantidade de 1% azul de bromofenol, para ajudar na visualização de microinjeção. Por exemplo, podemos adicionar 1 ml de azul de bromofenol para 10 ml de substrato.
2. Coloque uma pequena tira de Parafilm em um prato de 100 mm de diâmetro Petri, e dispensar uma queda de 5 mL da solução a ser injetado na faixa Parafilm.
3. Preencher uma agulha de injeção previamente calibrado (obtida por puxar um 6,6 mL micropipeta Drummond com o Inject + Extrator Matic) com a solução a ser injetada. Para isso, o microinjetor está definido o modo de aspiração. Para calibrar a agulha de injeção fazer marcas ponto na agulha a cada 0,5 mm, que correspondem a um volume de 50 nl.
4. Para injeção citoplasmática, insira a ponta da agulha em um óvulo no hemisfério vegetal, muito perto do hemisfério animal, em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Ativar a configuração microinjetor para microinject e microinject cada ovócito com 50 nl de substrato de importação. As marcas de ponto na agulha são usados ​​para monitorar a quantidade de substrato que foi injetado.
5. Transferir os oócitos injetados para uma pequena placa de Petri (35 mm de diâmetro) cheio de MBS, e incubar à temperatura ambiente durante o período de tempo desejado (pontos no tempo são escolhidos de forma a permitir a observação do substrato importação associado com NPCs, o que ocorre entre 10 e 30 minutos para as proteínas e vírus que são ativamente transportados para o NPC, desta vez também depende do local da injeção e do tamanho da proteína / vírus).
6. Quando a incubação é completa, a transferência de oócitos para um frasco de vidro de 4 ml contendo glutaraldeído 2% em MBS, e corrigir durante a noite a 4 ° C.

Parte 3: Dissecção de oócitos Xenopus

1. No dia seguinte, lave os oócitos 3 vezes com MBS.
2. Transferência de oócitos a uma placa de Petri pequena preenchida com tampão de pouco sal (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl _2, 10 mM HEPES, pH 7,5). Usando um microscópio de dissecação e dissecando uma pinça, remova o pólo vegetal de cada ovócito. É útil para estabilizar o ovócito sendo dissecado com um par de pinças, enquanto o outro par é usado como tesouras para remover o pólo vegetal. Neste ponto, é possível avaliar o sucesso da microinjeção pela presença de uma coloração azul no citosol. O protocolo é mantido apenas para os oócitos que receberam microinjeções com sucesso. Além disso, se as amostras devem estar preparados para EM, este passo dissecção torna muito mais fácil encontrar o núcleo quando desbastar e cortar as amostras.
3. Corrigir os oócitos dissecados novamente com glutaraldeído 2% em LSB durante uma hora a temperatura ambiente.
4. Após a fixação, lave os oócitos dissecados três vezes com LSB.

Parte 4: Preparação de Oócitos Injected para Incorporação e Thin-Seccionamento EM

1. Transferir os oócitos dissecados para um slide depressão. Aspirar o máximo de líquido como posvel, e então rapidamente (para que não sequem) abrangem os oócitos dissecados com 2% de baixo ponto de fusão agarose. Enquanto a agarose ainda está mole, use uma ponteira para separar os oócitos uns dos outros, e para garantir que cada ovócito está virada para cima ou para baixo (não para os lados).
2. Permitir que a agarose para solidificar por aproximadamente 10 minutos. Uma vez que a agarose se solidifica, use uma lâmina de barbear para cortar a agarose em pequenos pedaços, cada um contendo um óvulo dissecados.
3. Coloque os oócitos agarose-incorporado em um frasco de vidro de 4 ml, e pós-corrigi-los com 1% OsO ₄ em LSB durante uma hora a temperatura ambiente.
4. Lavar a amostra três vezes em LSB. Se necessário, guardar a amostra a 4 ° C durante a noite e continuar o protocolo no dia seguinte.
5. Seqüencialmente desidratar as amostras em uma série crescente de álcool (50, 70, e etanol 90% por 20 min cada). Isso é seguido por duas mudanças em etanol 100% por 15 min cada. Finalmente desidratar as amostras com acetona 100% por 15 min.
6. Infiltrar amostras com uma mistura 1:1 de Epon (Fluka) e acetona por uma hora, seguido de infiltração com uma mistura 2:1 de Epon e acetona por duas horas, e finalmente em Epon puro por pelo menos seis horas.
7. Colocar as amostras em moldes de incorporação flat cheio de fresco e puro Epon. Os ovócitos são orientados de tal forma que o lado do núcleo mais próximo do local da injeção - neste caso o lado dos oócitos que tem sido dissecado - será seccionada em primeiro lugar. Este passo otimiza a oportunidade de visualizar de importação do substrato escolhido.
8. Finalmente, a Epon polimerizar por dois dias a 60 ° C.
9. Para visualizar as amostras, os blocos são cortados e seccionados usando um ultramicrótomo. As seções são transferidos para as redes EM, coradas utilizando o procedimento padrão, e visualizados com um microscópio eletrônico de transmissão. Não vamos mostrar essa parte do protocolo, pois é procedimento padrão EM.

Parte 5: Resultados Representante:

Se o protocolo tem sido bem sucedida, então o envelope nuclear (NE) e NPCs deve ser claramente visível em micrografias EM. Dependendo do substrato e injetada a quantidade de tempo entre a injeção e fixação, o substrato deve estar visível na face citoplasmática da NPC, no NPC, ou em face nuclear do NPC.

A Figura 1 mostra um NE seção transversal com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com capsídeos do baculovírus AcMNPV, incubadas a 4 ° C por quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM, como descrito. Setas apontam para NPCs. A docking capsídeo na face citoplasmática de um NPC é indicado por uma seta branca.

Em contraste, a Figura 2 mostra uma seção transversal NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), incubadas à temperatura ambiente durante quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM como descrito. Usando esta técnica, nós descobrimos que induz MVM interrupções da NE (Cohen e Pante, 2005). Parênteses indicam quebra no NE. Setas apontam para NPCs. Capsídeos MVM putativos associados à NE são indicados por setas brancas.

Figura 1: Micrografia eletrônica de uma secção transversal-NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com capsídeos do baculovírus Ac MNPV, incubadas a 4 ° C por quatro horas, e processados ​​para incorporação e seção fina EM como descrito. Setas apontam para NPCs. Capsídeos são indicados por setas brancas. Barra de escala: 100 nm.

Figura 2: Micrografia eletrônica de uma secção transversal-NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), incubadas à temperatura ambiente durante quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM como descrito. Setas apontam para NPCs. Parênteses indicam quebra no NE. Capsídeos MVM putativos associados à NE são indicados por setas brancas. Barra de escala: 100 nm.

Discussão

Microinjeção de oócitos Xenopus combinado com thin-corte EM é uma ferramenta altamente eficaz para estudar o transporte nucleocytoplasmic. Este sistema tem sido usado para mapear etapas distintas de importação através do NPC, por exemplo, a interação de um substrato de importação nuclear com componentes estruturais do NPC, tais como os filamentos citoplasmáticos e cesta nuclear (revisado por Pante, 2006). Também tem sido usado para estudar a importação nuclear nuclear de replicar-vírus (Pante e ...