Modelo murino para a doença de Parkinson: a partir de 6-OH lesão dopamina para teste comportamental

Resumo

Doença de Parkinson é causada pela perda da inervação dopaminérgica para o estriado, que pode ser induzida experimentalmente por 6-OH-dopamina. Descrevemos como executar uma lesão estereotáxica e monitorar induzida por apomorfina comportamento rotacional em camundongos. Este modelo é útil e confiável para testes de novas terapias para a doença de Parkinson.

Resumo

Doença de Parkinson (PD) afeta pelo menos 6,5 milhões de pessoas em todo o mundo, independentemente do sexo, as fronteiras sociais, étnicas, econômicas ou geográficas. Principais sintomas, como rigidez, tremor e bradikinesia, desenvolver-se quando cerca de 3 / 4 de células dopaminérgicas são perdidos na substância negra, e não conseguem prever o regulamento, suave coordenada dos circuitos motores estriatal. Depressão e alucinações são comuns, e demência, eventualmente, ocorre em 20% dos pacientes. Neste momento, não existe um tratamento para retardar ou parar a progressão da DP. Pelo contrário, o objectivo do medicações atualmente disponíveis mais para o alívio destes sintomas. Novas estratégias cirúrgicas podem reversivelmente ligar os circuitos danificados funcionalmente através da estimulação elétrica de estruturas cerebrais profundas, mas apesar de estimulação profunda do cérebro é um grande avanço, não é adequado para todos os pacientes. Permanece, portanto, necessário para testar abordagens nova terapia celular em modelos pré-clínicos.

Perturbações neurotóxicas seletiva de vias dopaminérgicas podem ser reproduzidas pela injeção de 6 hidroxidopamina (6-OHDA) ou MPTP (1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tertahydropyridine), enquanto esgotando drogas e produtos químicos prejudiciais à oxidativo pode também reproduzir características específicas de PD em roedores. Ao contrário de MPTP, 6-OHDA lesões causar perda irreversível maciça neuronal, e podem ser uni ou bilateral. O modelo de lesão 6-OHDA é de confiança, leva ao déficit motor robusto, e é o mais amplamente utilizado após 40 anos de pesquisa em rats1. Como as interações entre as células enxertadas e host pode agora ser estudado mais profundamente em ratos e não em ratos, o modelo foi transposto para ^2,3 camundongos, onde foi recentemente caracterizada ^4.

Neste vídeo, demonstramos como a lesão da via Nigro-estriatal esquerda de ratos anestesiados por lentamente entregando 2,0 mL de 6-OHDA através de uma agulha inserida stereotaxically micro-seringa. A perda da entrada dopaminérgica ocorre dentro de dias, e as deficiências funcionais podem ser monitorados ao longo do pós-operatório semanas e meses por rotações de classificação de animais induzida por agentes dopaminérgicos ^5. Aqui, vamos mostrar de corpo inteiro rotações contralateral ocorre 10 minutos após uma única administração subcutânea da apomorfina, medido um mês após a lesão. Resultados e as desvantagens são discutidas abaixo.

Protocolo

Todos os produtos químicos armazenados na forma sólida, como 6-OHDA e apomorfina, foram diluídos em água de injeção estéril e filtrado dentro de uma capela de fluxo laminar, para evitar a contaminação. Além disso, neurotoxinas e substâncias neuroactive foram armazenados, preparados, manipulados e eliminados de acordo com normas estabelecidas pelas diretrizes internacionais ⁶ e os locais de Biossegurança.

1 - A anestesia e cirurgia

Adulto masculino camundongos suíços (25-30g) são pré-medicados com Atropina (0,2 mg / Kg, sc) para reduzir o tônus ​​vagal e anestesiados com injeção intraperitoneal de ketamina (90-120 mg / Kg) e xilazina (10 mg / Kg) . O animal é colocado sobre uma almofada de aquecimento controlada eletronicamente (Insight) para garantir a temperatura corporal é mantida a 37 ° C, como indução de sedação leva alguns minutos. O nível de anestesia é verificada em todo o processo por meio de testes a ausência de reflexo de retirada. Da dose do anestésico deve ser Ajustado para cada cepa / colônia. Dependendo do animal e da duração da cirurgia, doses adicionais de Ketamina pode ser necessária. Depois disso, a solução salina (NaCl 0,9%) é aplicado em ambos os olhos para proteger a córnea de secar e testar a ausência do reflexo de pestanejo neste primeiro momento. A pele toda a cabeça é raspada com um trimmer para garantir o mínimo contato com áreas não estéreis. Anestésico local (xilocaína) é aplicado às barras de ouvido para evitar desconforto. Apenas uma vez retirada e reflexo de pestanejo desapareceram, indicando o nível de anestesia é profundo o suficiente para a cirurgia (fase 3), o animal é posicionado sobre a armação estereotáxica utilizando bocal e bares ouvido especialmente concebidos para esta espécie (Insight). Uma vez positionated, uma pomada oftalmológica (MARCA) é aplicada para proteger os olhos dos animais em toda a cirurgia. Somente após ter certeza de que os olhos estão corretamente protegidos, o procedimento continuará com a desinfecção da pele da região cirúrgica, repetindo três aplicações de iodopovidona seguido por etanol 70%, com auxílio de swab estéril algodões Depois, a colocação correta das barras ouvido é assegurada através de testes de movimentos laterais da cabeça (a cabeça não deve mover-se para garantir que os bares estão firmemente fixos). Inclinação dorsoventral adequada da cabeça será verificado mais tarde quando marcos crânio são revelados. Uma incisão sagital (1,5 cm) é feita com um bisturi estéril (# lâmina 15). O periósteo sobre a área de interesse é cuidadosamente raspado afastado com uma lâmina nova, e osso é limpo com o olhar estéril e cotonetes, para descobrir marcos crânio: bregma é definido como o ponto de intersecção das suturas sagital e coronal, enquanto lambda é o ponto de interseção da sutura sagital ea linha de melhor ajuste passando as partes esquerda e direita da sutura lambdóide. A ponta de uma agulha de referência alinhados verticalmente é o primeiro zero no bregma, em análise através do microscópio cirúrgico, em seguida, mudou-se a tocar o ponto lambda. Se a cabeça está posicionada corretamente, lambda deve ser ao nível dorso-ventral mesma bregma, e ambos os marcos devem ser distantes de 4,2 milímetros ao longo do eixo rostro-caudal. Se não, as barras de orelhas e nosepiece deve ser soltar e delicadamente a cabeça inclinada em torno do eixo interaural, a fim de atingir a posição desejada, que define o "flat crânio" de referência para medidas stereotaxical. A ponta da agulha de referência é então posicionado nas coordenadas desejado: ântero-posterior (AP 0,5 milímetros) e lateral (L -2,0 mm, esquerda). O local é marcado no crânio e um buraco (1,2 mm de diâmetro) de pequeno porte é aberto com uma broca esterilizada, usando a ação intermitente para evitar o calor da região. Fragmentos de ossos são cuidadosamente removido com uma cureta odontológica estéril e lavadas com NaCl 0,9% morna. O esterilizados 5 mL Hamilton seringa (26s bitola, 0,47 mm de diâmetro externo) é carregado com a solução de 6-OHDA (ou veículo para animais do grupo controle) e alinhados verticalmente no aparelho estereotáxico. A ponta da agulha (tipo 2 ou 12 bisel °) é então inserido dentro do buraco aberto, até tocar a superfície pial, para determinar o ponto de referência da coordenada dorso-ventral. Uma vez determinada essa coordenada, a agulha é diminuída lentamente para atingir as coordenadas do striatum (AP: 0,5; L: -2,0 e DV: -3,0 mm, abaixo da superfície pial ^7). A solução 6-OHDA (10 mg 6-OHDA em NaCl 0,9% com ácido ascórbico 0,02%), que foi preparada e filtrada dentro de uma capela de fluxo laminar, e deve ser protegido da luz por papel alumínio ao longo do processo, é então injetado no uma vazão de 0.1μL/min. Para os animais de controle, um volume igual de veículo (0,02% ácido ascórbico e 0,9% NaCl em água estéril) é injetado. Uma vez que o 2,0 mL inteira foi injetado, a seringa é mantida no lugar por 5 min antes de ser recolhido de forma muito lenta a partir do cérebro, em nada menos do que em 5 minutos. O crânio é limpo ea incisão é fechada com uma sutura # 6-0 nylon (Shalon). Para tirar um extracuidados contra a infecção, uma pomada antibiótica locais, como a neomicina, pode ser aplicado à pele suturada. Animais são retirados da moldura, dado 0,5 ml de solução salina (sc.) para evitar a desidratação, e manteve quente e sob observação até a recuperação completa. Em seguida, são alojados com alimentos e água ad libitum. Analgésico é adicionado à garrafa de água potável para os dois primeiros dias após a cirurgia (dado um consumo diário médio de 5,5 ml, e uma dose recomendada de ibuprofeno 0,03 mg / g de peso corporal / dia, adicionar 0,82 mL de 20 mg / mL de suspensão Ibuprofen-Abbott para 100 mL de água potável). Camundongos geralmente se recupera rapidamente a partir do procedimento, vagando e procurando pellets comida, água facilmente. Em qualquer caso de desconforto aparente, ou qualquer sinal de infecção, os animais devem ser sacrificados de acordo com as directrizes locais.

2 - teste comportamental

Embora deficiência motora podem ser observadas após uma semana, um intervalo de pós-lesão de um mês é permitido antes quantificação fiável com o teste de rotação. O animal recebe uma injeção subcutânea de apomorfina DA agonista (0,5 mg / Kg), e é colocado em um cilindro opaco de 30 cm de diâmetro, colocado 45 centímetros abaixo da câmera de gravação. É importante remover os resíduos e odores de animais previamente testados antes de cada teste. Depois de um período de habituação 5 min, os movimentos são registrados ao longo de um horizonte de 5 min. Ambos os contra-rotação e de corpo inteiro ipsilateral são medidos e comparados com o grupo controle (veículo injetado). Se o procedimento foi realizado corretamente, os animais de controle não apresenta qualquer rotação, enquanto que 6-OHDA animais lesionados vai começar a girar para o lado contralateral, uma vez que o agonista predominantemente ativa o striatum supersensível desnervados do lado lesionado. Animais marcar mais de 7 rpm (exibindo pelo menos 7 de corpo inteiro rotações por minuto contralateral) são considerados sucesso lesada. O animal pode ser seguramente retornado à sua moradia min 30 após o teste, que pode ser repetida semanalmente. Em nossas mãos, a menos de 5% dos ratos lesionados exibido taxas de rotação abaixo do ideal.

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Discussão

Extensa lesão unilateral da via Nigro-estriatal pode ser alcançado de forma confiável em camundongos por uma única injeção estereotáxica de 6-OHDA no striatum. A extensão da lesão pode ser verificado post-mortem por imuno-histoquímica para a tirosina hidroxilase (que catalisa a etapa limitante da taxa da síntese de DA, ou seja, a conversão de L-Tirosina para dihidroxifenilalanina), como ilustrado no vídeo.

In vivo, as rotações contralaterais induzidas por apomorfina é um melh...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride	König		90-120 mg/Kg
Xylazine hydrochloride	König		10 mg/Kg
Atropine Sulfate	Isofarma		Isofarma
6 – Hydroxydopamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich		5 μg/μL
L - Ascorbic Acid	USB Corp., Affymetrix		0.2%
Xylocaine (Lidocaine Chloridrate)	AstraZeneca		5% 50 mg
Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin)	Altana Pharma		5 mg/g + 250 Ul/g
R-(-)-Apomorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich		0.5 mg/Kg
GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose	Novartis AG		0.33%
Ibuprofen	Abbott Laboratories		4 mg/ 100 ml drinking water
Povidine	Johnson Diversey
R-(-)-Apomorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich		0.5 mg/Kg