Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

Resumo

Descrição de um processo de fosforilação quantitativa usando cryolysis, solubilziation uréia, fracionamento e enriquecimento HILIC IMAC de peptídeos fosforilados.

Resumo

Este protocolo descreve o crescimento e estímulo, com o oleato de ácidos graxos, de células de Saccharomyces isotopicamente leves e pesados ​​S.. Células são solo usando um procedimento cryolysis em um moedor de moinho de bolas e os grindate resultando colocada em solução de solubilização da uréia. Este procedimento permite a lise das células em um estado metabolicamente inativas, preservando fosforilação e evitando reorientação da phosphoproteome durante a lise celular. Após a redução, alquilação, digestão com tripsina das proteínas, as amostras são dessalinizada em colunas C18 e da complexidade amostra reduzida por fracionamento através de cromatografia de interação hidrofílica (HILIC). Colunas HILIC preferencialmente reter moléculas hidrofílicas que é bem adequado para phosphoproteomics. Peptídeos fosforilados tendem a eluir mais tarde no perfil cromatográfico do que as contrapartes não fosforilado. Após o fracionamento, fosfopeptídeos são enriquecidos por cromatografia em fase de metal imobilizado, que conta com carga baseada em afinidades de enriquecimento fosfopeptídeos. No final deste procedimento as amostras estão prontas para serem analisadas quantitativamente por espectrometria de massa.

Protocolo

Crescimento celular e media

1. Uma única colônia de células BY4742Δarg4Δlys1 overnight em 100 mL de rich media para um OD ₆₀₀ de 1,0 sementes, em seguida, em duas culturas 1 litro de um meio de levedura mínimo (0,17% Base de Dados de nitrogênio fermento sem sulfato de amônio ou Aminoácidos, sulfato de amônio 0,5%), contendo uma conjunto completo de aminoácidos, suplementado com L / 20mg de arginina isotopicamente normal ou pesado ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _4; Isotec) e lisina ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. As células foram cultivadas por 18 horas, para um OD ₆₀₀ de 1.8. É fundamental que as células passam por pelo menos 9 gerações para alcançar a plena incorporação dos isótopos rotulados. A amostra foi peletizada luz, lavados com água estéril, reseeded em um meio contendo oleato (arginina isotopicamente normal e lisina, oleato de 0,2% (Sigma Chemicals) e 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) e estimulado por outros 85 minutos. Isso gera uma isotopicamente leve, com respeito a arginina e lisina, oleato estimulada amostra e uma amostra de referência isotopicamente pesada glucose-grown.

Lise celular, Isolamento e fracionamento de Peptídeos

3. Pesar garrafa centrífuga. Colheita de amostras por centrifugação por 3 minutos. Remova a mídia e aspirar o excesso de líquido. Pesar pellet e garrafa (normalmente rendimento entre 1-2 gramas), em seguida, congelar flash em nitrogênio líquido. Adicionar um volume equivalente a pelota peso de 'moer' buffer para as pelotas congelados em nitrogênio líquido (Phosphate Buffered Saline (PBS, Gibco), 10% glicerol, inibidores da protease (Comprimidos Inibidor da Protease SigmaFAST, Sigma) e HALT inibidores de fosfatase (Thermo Scientific )).
4. Congelar o navio de moagem em nitrogênio líquido. Aguarde até que o nitrogênio líquido deixa ferver. Transferir a pelota para o navio de moagem, com rolamentos de esferas congelada.
5. Moagem de 600 rpm com um ciclo de 1 min 20 sec com uma inversão direção por 3 minutos. Recongelar o navio de moagem em nitrogênio líquido. Repita 4 vezes mais por 15 minutos tempo de moagem total.
6. Recolher o grindate congelados em um tubo de 50ml de gelo lugar Falcon seco. Armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso.
7. Fazer uma solução de 10ml de 8M uréia, bicarbonato de amônio 0,1 M, 0,1 M Tris pH 8.6. Adicionar 3 volumes do buffer de uréia para 1 volume do grindate congelados (por exemplo 3mls do buffer de uréia adicionados a um 1 grama pellet com 1 ml de tampão PBS). Sonicate imediatamente a mistura com um sonicador ponta da sonda (2 - 10 pulsos segundo). Manter a ponta na parte inferior do tubo para evitar a formação de espuma da solução. O grindate deve imediatamente entrar em solução.
8. Limpar o lisado por centrifugação por 5 minutos a 4 ° C.
9. Transfira o sobrenadante para tubos fresco.
10. Faça uma nova porção de Tris 0,5 M [2-carboxietil] fosfina (TCEP). Adicionar ao da amostra em 1:100 para uma concentração 5mM final. Incubar a 37 ° C por 1 h.
11. Alquilação de cisteínas reduzidas. Deixe esfriar até a temperatura ambiente. Faça uma nova porção da iodoacetamida 1M. Manter no escuro (que envolva o tubo em papel alumínio). Adicionar a uma concentração final de 20mM. Incubar no escuro por 1 h em temperatura ambiente.
12. Saciar a iodoacetamida com DTT 20mM de um estoque 1M em temperatura ambiente por 1 h.
13. Quantificar a proteína com um padrão ou Bradford ensaio BCA (não descritos). Tomar uma amostra para análise por SDS-PAGE abaixo.
14. Para validar a incorporação dos isótopos pesados, use 100 ml do lisado reduzidos e alquilados. Diluir 1:4 com dH ₂ O, sonicate e adicione tripsina em 50:1 proteína para tripsina. Digest para um mínimo de 4 horas, amostra seca para baixo em uma velocidade vac e depois desalt com colunas Ultramicrospin C18 (Grupo A Nest).
    1. Coluna hidratado com 100 ml de Acetonitrila
    2. Equilibrar com 200 mL TFA 0,1%.
    3. Ressuspender amostra seca em 200 mL TFA 0,1%. Carga para coluna. Centrifugar a 200 xg ~ ou a velocidade mínima necessária para o fluxo através da coluna.
    4. Lavar duas vezes com 200 mL TFA 0,1%.
    5. Eluir com duas vezes com 50 mL Acetonitrila 60%, TFA 0,1%.
    6. Amostra seca em uma velocidade vac.
    7. Amostra ressuspender em 20 mL de ácido fórmico 0,1%. Executar 2 l em um espectrômetro de massa. Verifique incorporação de arginina e lisina isotopicamente pesado por uma mudança Dalton 10 e 8 no espectro m / z respectivos. A incorporação de cada aminoácido deve estar entre 96-98%.
15. Misture quantidades equivalentes (mg de proteínas) das amostras isotopicamente leves e pesados.
16. Diluir a amostra 1:4 com metanol 20%.
17. Adicionar tripsina 1:200. Incubar durante a 37 ° C.
18. Verificar que a digestão tem ido até a conclusão por PAGE SDS. Executar 2 e 4 mL da amostra predigestion e 8 umd mL 16 da tripsina pós digerir. Visualize por coloração Coomassie que a digestão é completa. Se ele não estiver completo, sonicate a amostra com um breve sonicador ponta da sonda e digerir novamente com tripsina.
19. Secar a amostra para baixo em uma velocidade vac. Ao adicionar a seco de 200 mL filtrado dH ₂ O e vortex até o pellet entra em solução. Amostra seca para baixo em uma velocidade vac. Ressuspender novamente com dH ₂ O. Seco da amostra novamente.
20. Ressuspender pellet em 0,1% Ácido Trifluoracetic (TFA; Sigma). Verifique se o pH é de cerca de 3 usando tiras de pH. Se necessário acidificar o meio com TFA 10%.
21. Pellet qualquer precipitado.
22. Dessalinizar as amostras em um Waters Sep-Pak Vac coluna C18 de 500 mg. Não sobrecarregue as colunas. A quantidade máxima é de 5 mg, mas é melhor carregar um pouco menos. Dividir a amostra entre várias colunas se necessário.
    1. Coluna o hidrato com 5 ml de acetonitrila 100%. Centrifugar a 200 xg ~ ou a velocidade mínima necessária para o fluxo através da coluna.
    2. Equilibrar coluna com TFA 0,1% 5ml. Carga da amostra. Colete de fluxo e de carga novamente.
    3. Lavar com 5 ml TFA 0,1%. Repetir.
    4. Eluir com 2ml Acetonitrila 60%, TFA 0,1%.
    5. Amostra seca para baixo em uma velocidade vac.

Fracionamento e Isolamento de peptídeo Fosfopeptídeos

1. Peptídeos são fracionado em uma coluna HILIC. Nós usamos um TOSOH TSK Gel-amida-80 4,6 milímetros x 25 cm coluna analítica com uma coluna de guarda. Leve o seu tempo com este passo, execute a coluna por 2 horas a 90% A em seguida, executar dois gradientes em branco antes de colocar a sua amostra. A carga máxima em uma coluna deste tamanho é pensado para ser em torno de XX, que normalmente não carregar mais de 5 mg por corrida.
2. Um solvente - 98% ACN/0.1% TFA
   Solvente B - 2% ACN/0.1% TFA
   Carga em 90% A mais de 20 ', 90% A 85% A mais de 5', 85% A 60% A mais de 40 ', 60% A para 0% A mais de 5', 0% A% a 90 A mais 5 '.
3. A taxa de fluxo é 1mL/min e frações foram coletadas em intervalos de 2 minutos, começando às 85% a 60% A um gradiente.
4. Combine frações para reduzir o número de fracções a 10. Frações aumentou, provavelmente, maior rendimento de cobertura do phosphoproteome.

Enriquecimento de fosfopeptídeos

1. Fosfopeptídeos são enriquecidos com PHOS-Select Gel de Afinidade de Ferro. Nós alíquota nossa resina IMAC para evitar congelar repetido descongelamento. Fazer 50 mls de um ácido acético 250 mM, a solução de carga de 30% ACN. Trazer o pH para 2,7 com HCl. Ressuspender pellets em 500 ml de solução de carga. Verificar o pH, ajuste com HCl ou NaOH, conforme necessário.
2. ML de pré-lavagem de 200 contas IMAC em uma coluna apropriada. Usamos colunas giram Molbiotec.
   Adicionar 15 mL de uma suspensão de 50% (gel para carregar solução) a cada fração, e incubar as amostras de 30 'com final mais rotação final. Manter o fluxo para análise.
3. Lavar as amostras 3 vezes com solução de carga e uma vez com 500 mL filtrado dH ₂ O.
4. Peptídeos eluir com 2 - 3 min com 400 mL de 50 mM Na ₂ HPO ₄ (pH 8,4) buffer. Transferir para um frasco de vidro.
5. Acidificar a pH 3 com 5 mL de ácido fórmico 100%, congelamento de flash em nitrogênio líquido, e amostra seca para baixo em uma velocidade vac.
6. Fosfopeptídeos ressuspender em 200 mL de TFA 0,1% e C18 limpo como descrito acima. Seco para baixo amostras eluídas em uma velocidade vac.
7. Ressuspender peptídeos em 20 l de 0,1% de ácido fórmico. Use 2 mL por análise de espectrometria de massa ou conforme necessário.

Notas

Durante boa parte deste protocolo que você estará trabalhando "cega". A lise celular pode ser monitorada por Western Blotting e ensaios Bradford ou BCA, ea digestão com tripsina também pode ser facilmente avaliada. A coluna vai HILIC deu um traço semelhante a esta, ou como pode ser visto por outros [1, 2] dependendo da máquina de cromatografia líquida que é usado. Amostras são monitorados por espectrometria de massa, teste a sua amostras em máquinas de baixo custo, tais como LCQs ou MALDIs antes de ir para as análises de custo alto de uma massa de alta precisão, máquina de alta resolução. Finalmente, se você uma secagem para baixo uma amostra com ácido nele, use vidro.

Discussão

Este método irá produzir um enriquecimento da fosfopeptídeos que podem ser analisadas quantitativamente. Um número de parâmetros podem ser alterados neste protocolo, mas o aspecto mais importante a lembrar é o de preservar a sua fosforilação. Preparação de células para a quantificação pode ser alcançado em um número de diferentes maneiras, por exemplo, se você não pode rotular suas células in vivo, tags, tais como ICAT [3] ou ITRAC [4] pode ser usado extração post para diferencialmente etiqu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lysine-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid	Invitrogen	70011044
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets	Sigma-Aldrich	S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Retsch PM100 Ball Mill Grinder	Retsch	20.540.0001
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar	Retsch	01.462.0148
Ultramicrospin C18 column	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column	Tosoh Corp.	13071	This is the HILIC chromatographic column.
Guard column 4.6 mm ID x1 cm	Tosoh Corp.	19021	We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel	Sigma-Aldrich	P9740	This is the IMAC resin. Aliquot and store.