O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF

Resumo

SC1 funções através da inibição dual de Ras-GAP e ERK1. Testamos a função de SC1 no apoio célula do rato ES auto-renovação, na ausência de LIF e mostrou que SC1 é capaz de manter a auto-renovação de culturas de células de rato ES.

Resumo

Rato-tronco embrionárias (ES), as células são convencionalmente cultivados com fator inibitório de leucemia (LIF) para manter a auto-renovação.

Protocolo

1. Preparação das placas de alimentação MEF

1. Um dia antes de as células ES de cultura, frasco de descongelar um dos irradiados E14.5 CF-1 células alimentadoras MEF (veja nosso procedimento para descongelar células ES).
2. A placa de células alimentadoras MEF a uma densidade de 10.000 células / poço em uma placa de 12 poços. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO _2. MEF célula mídia: DMEM suplementado com 10% ES-PBS, 1X e 1X glutamina não-aminoácidos essenciais.

2. Manutenção da auto-renovação das células ES rato

1. Separar as células ES usando tripsina. Semente as células a uma densidade de 50.000 células / poço sobre as placas MEF previamente preparado alimentador em meios de crescimento (MEM suplementado com Knockout KSR 15%, 4 mM L-glutamina, 0,1 mM não-aminoácidos essenciais e 1X BME) suplementado com SC1 na concentração desejada (usamos 100 nM, 300 nM e 1 mM). Nós também adicionamos um controle positivo bem que foi complementado com 1000 μ / ml de LIF. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Cultura das células a 37 ° C e 5% CO ₂ por 3-4 dias em cada passagem. Atualizar media a cada 48 horas.
3. Células passagem 1:10 - 01:15 com tripsina para manter uma densidade semelhante como a densidade de semeadura inicial. Depois de cinco passagens, as células podem ser examinados para a expressão de marcadores de pluripotência típico usando imunocitoquímica.

3. Exame imunocitoquímico de marcadores pluripotência

1. Lave suavemente as células três vezes com PBS.
2. Fixar as células com 500 mL de fixador por 20 minutos em temperatura ambiente.
3. Lave suavemente as células três vezes com PBS.
4. Bloco de ligação não específica com 500 mL de buffer de bloqueio para uma hora em temperatura ambiente.
5. Incubar as células com 250 mL do anticorpo primário específico (usamos Nanog, Sox2, SSEA1 e Oct4 nas seguintes diluições: 1:500, 1:2000, 1:500 e 1:500)
6. Lave suavemente as células três vezes com PBS.
7. Incubar as células com 250 mL de anticorpo secundário por duas horas à temperatura ambiente, mantendo-se longe da luz (usamos burro anti-rato conjugada com Alexa Fluor ® 555 a 1:2000 e anti-burro coelho conjugados com Alexa Fluor ® 488 em 1 : 2000).
8. Lave suavemente as células três vezes com PBS.
9. Adicionar DAPI (concentração final de 1 mg / ml) para a última lavagem e incubar 5 minutos para visualizar núcleos.
10. Analisar as células em um microscópio fluorescente.

4. Resultados representativos:

1. Morfologia resultados:

Células de camundongo ES (ESC R1) foram cultivadas em células alimentadoras MEF na presença de qualquer LIF ou SC1 para sustentar a auto-renovação em um estado indiferenciado. Após a segunda passagem, a diferenciação pode ser observada em células sem LIF ou SC1 (controle negativo) e depois de 5 passagens essencialmente nenhuma colônias indiferenciado foram observados. LIF (controle positivo) colónias tratadas permaneceu em um estado indiferenciado, durante o 5 passagens celular. Células tratadas com SC1 em concentrações de 300 nm ou 100 nM também permaneceu indiferenciado após 5 passagens, no entanto, as células tratadas com 1 mM morte celular SC1 experimentado após a quarta passagem. (Fig. 2 de nota app) A Tabela 1 resume as observações morfológicas.

2. Expressão de marcadores pluripotência

Células-tronco embrionárias de rato mantidos por 5 passagens foram fixados e analisados ​​por imunocitoquímica para SSEA1, Oct4, Sox2 e Nanog. Expressão do marcador foi semelhante às células mantidas em LIF. (Fig. 3 e 4 de nota app)

Figura 1: comparação Morfologia de células mantidas em LIF ou SC1. Nenhuma diferença na morfologia foi observada.

Figura 2 e Figura 3: Nanog, SSEA1, Sox2 e Oct4 coloração de células ES mantido com SC1 ou LIF (fig. 4 de nota app). Células mantidas em SC1 mostram expressão do marcador semelhante pluripotência das células mantidas em LIF.

Tabela 1

	Controle negativo	LIF Controle Positivo	SC1 1um	SC1 300 nM	SC1 100 nM
1 Passagem	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES
Passagem 2	Alguns morfologia diferenciada	E normaisS morfologia celular	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES
Passage 3	Maioria das células diferenciadas	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES
Passagem 4	Não colônias ESC	Morfologia das células normais ES	Morte celular observado	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES
Passagem 5	diferenciado	Morfologia das células normais ES	Morte celular observado	Morfologia das células normais ES	Morfologia das células normais ES

Discussão

O SC1 pequena molécula pode ser usada para manter a auto-renovação, com um estado indiferenciado em células ES mouse. Antes de usar em uma linhagem de células não testados, no entanto, deve ser titulada para determinar a concentração ideal. Por exemplo, testamos três concentrações no ES célula do rato linha ESC R1. 100 nM e 300 nM concentrações foram capazes de sustentar as células ES mouse, no entanto, uma concentração de 1 mM era tóxico.

SC1 também pode ser usado sob alimentação livre de condições.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279