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Method Article
Neurexinas e neuroliginas são proteínas da membrana do neurônio-adesão que desempenham papéis essenciais na diferenciação e transmissão sináptica. Mutantes neuroligina deficiente de C. elegans Estão com defeito na detecção de resistência osmótica, mas quando eles contêm também uma mutação no gene que codifica neurexin, eles recuperar o fenótipo do tipo selvagem.
Neurexinas e neuroliginas são moléculas de adesão de células presentes nas sinapses excitatórios e inibitórios, e eles são necessários para o funcionamento correto da rede neurônio 1. Estas proteínas são encontradas nas membranas pré-sinápticas e pós-sinápticos 2. Estudos em ratos indicam que neurexinas e neurologins têm um papel essencial na transmissão sináptica 1. Relatórios recentes têm mostrado que alterou conexões neuronais durante o desenvolvimento do sistema nervoso humano pode constituir a base da etiologia da numerosos casos de distúrbios do espectro do autismo 3.
Caenorhabditis elegans pode ser usado como uma ferramenta experimental para facilitar o estudo do funcionamento dos componentes sináptica, devido à sua simplicidade para a experimentação de laboratório, e dado que seu sistema nervoso e fiação sináptica tem sido completamente caracterizado. Em C. Elegans NRX-1 e NLG-1 genes ortólogos são para humanos NRXN1 e NLGN1 genes que codificam a alfa-neurexin-1 e neuroligina-1 proteínas, respectivamente. Em humanos e nematóides, a organização de neurexinas e neuroliginas é semelhante no que respeita aos domínios funcionais.
O chefe do nematóide contém o amphid, um órgão sensorial do nemátodo, que medeia as respostas a diferentes estímulos, incluindo a força osmótica. O amphid é feito de 12 neurônios sensoriais bipolares com dendritos e um axônio ciliadas terminal pré-sináptico 4. Dois desses neurônios, chamado ASHR e ASHL são particularmente importantes em função sensorial osmótica, detectando solúvel em água repelentes com força osmótica elevada 5. Os dendritos destes dois neurônios alongar até a ponta da boca e os axônios estendem ao anel nervoso, onde fazem conexões sinápticas com outros neurônios determinar a resposta comportamental 6.
Para avaliar as implicações da neurexin e neuroligina em evitar alta resistência osmótica, mostramos a resposta diferente de mutantes C. elegans com defeito no NRX-1 e 1-NLG genes, usando um método baseado em um anel de frutose 4M 7. Os fenótipos comportamentais foram confirmados utilizando clones específicos RNAi 8. Em C. elegans, o dsRNA necessário para acionar RNAi pode ser administrado através da alimentação 9. A entrega de dsRNA através dos alimentos induz a interferência RNAi do gene de interesse permitindo assim a identificação dos componentes genéticos e caminhos de rede.
1: ensaio de evitar osmótica.
2: Geração de worms knockdown alimentando RNAi.
3: As cepas utilizadas.
O C. elegans cepas utilizadas neste trabalho são apresentados na Tabela 1. Cepas mutantes estavam cruzados contra N2 selvagens - tipo, pelo menos, quatro vezes para remover indesejados mutações aleatórias que poderia ter sido gerada durante o protocolo de mutagênese.
. OP50 E coli cepa foi suppliied por Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, EUA E.coli HT115 (DE3) com o plasmídeo carregando pL4440 NRX-1 (JA: C29A12.5). Florins e-1 (JA: C40C9.5 fragmentos de genes) foram fornecidos pelo Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo ('Abd), Universidad Pablo Olavide CSIC, Sevilla, Espanha.
4: Os resultados representativos.
Resultados ilustrativos são representados nas Figuras 1 e 2. Dez animais de cada cepa e um mínimo de três experimentos foram realizados réplica.
Figura 1. Experimentos de comportamento de evitação osmótica.
Estirpes de controlo e NRX-1 (ok1649 e tm1961) mutantworms V deficiente responder, invertendo para trás quando se deparam com uma barreira osmótica (4M frutose). NLG-1 (ok259 e tm474) X mutantes não conseguem detectar essa barreira. Mutantes duplos deficiente em NLG-1 e NRX-1, cepas CRR21 (ok1649; ok259) VX e CRR23 (tm1961; ok259) VX recuperou o fenótipo de tipo selvagem. O * indica diferenças significativas (P ≤ 0,001) pelo teste t-student, na resposta de cada cepa para a N2 Bristol tipo selvagem por t-student
Figura 2. Experimentos com worms knockdown alimentando RNAi.
E.coli HT115 (DE3) transformadas com o vetor pL4440 vazio ou contendo um fragmento correspondente aos genes alvo NRX-1 ou NLG-1 foram utilizados para cepas de vírus alimentados com diferentes. O * indica diferenças significativas (P ≤ 0,001) pelo teste t-student, na resposta da cepa N2 alimentados com bactérias carregando o vetor pL4440 com um fragmento do gene alvo NLG-1 em comparação com a cepa N2 alimentados com vector pL4440 vazia .
Neurexinas e neuroliginas desempenhar papéis essenciais na transmissão sináptica 11 e diferenciação das conexões sinápticas 12. Ambas as moléculas têm sido identificadas como genes candidatos para o autismo 13,14.
Neste vídeo mostramos um método simples que nos permite estudar o efeito de genes que afetam a resposta de esquiva osmótica em C. elegans. Neuroligina mutantes deficientes são defeituosos na detecção de resistência osmótica...
Gostaríamos de agradecer o Dr. Antonio Miranda-Vizuete para a sua valiosa ajuda. Nós também gostamos de expressar nossa gratidão a Salma Boulayoune e Isabel Caballero de assistência técnica valiosa. Este trabalho foi financiado por uma doação da Junta de Andalucía (BIO-272). Esta pesquisa foi realizada de acordo com as leis que regem a experimentação genética na Europa.
Tabela 1. C. cepas elegans.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tensão | Gene | Alelo | Fonte |
Bristol N2 | - | - | ACGC |
VC228 | NLG-1 | ok259 | CGC |
FX00474 | NLG-1 | tm474 | BNBP n-JAPAN |
VC1416 | NRX-1 | ok1649 | CGC |
FX1961 | NRX-1 | tm1961 | NBP-JAPAN |
NL2099 | RRF-3 | pk1436 | CGC |
CRR21 | NRX-1; NLG-1 | ok1649; ok259 | Este trabalho |
CRR22 | NRX-1; NLG-1 | tm1961; ok259 | Este trabalho |
a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, EUA.
b. Projeto Nacional para a Bioresource Experimental Animal "Nematóides C. elegans". Médica da Mulher de Tóquio University, no Japão.
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