Pintinho Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM Ensaio: como ele realmente funciona

Resumo

O filhote corioalantóicas membrana (CAM) é único, um ambiente de cultura naturalmente imunodeficientes apoio para estudar a angiogênese e tumorigênese. Este artigo vídeo demonstra as diferentes etapas no pinto Ex ovo, aplicação de substâncias potencialmente angiogênicos e inoculação bem-sucedida de células tumorais e tecidos na superfície do CAM.

Resumo

Ovos de galinha na fase inicial da criação de animais estão entre in vitro e em sistemas in vivo e proporcionar um ambiente de teste vascular não só para estudar a angiogênese, mas também para estudar tumorigênese. Depois que o pintinho membrana corioalantóide (CAM) tem desenvolvido, sua rede de vasos sanguíneos podem ser facilmente acessados, manipulados e observados e, portanto, oferece um cenário ideal para ensaios de angiogênese. Como o sistema linfático não está totalmente desenvolvido até os estágios finais de incubação, o embrião de galinha serve como hospedeiro natural imunodeficientes capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições espécie-específicos. Além de nutrir desenvolvimento allo e xenotransplantes, o CAM rede dos vasos sanguíneos fornece um ambiente único de apoio para intravasation célula tumoral, disseminação e prisão vascular e um repositório onde as células preso extravasar para formar micro focos de metástase.

Para fins experimentais, na maioria dos estudos recentes, a CAM foi exposta pelo corte de uma janela através da casca do ovo e experimentos foram realizados em ovo, resultando em limitações significativas na acessibilidade do CAM e possibilidades para a observação e documentação fotográfica de efeitos. Quando shell-less culturas do embrião de galinha foram usadas ^1-4, não foram fornecidos detalhes experimentais e, se publicado em tudo, as taxas de sobrevivência dessas culturas foram baixas. Nós refinou o método de cultura ovo ex de embriões de galinha significativamente através da introdução de uma extrusão racionalmente controlada do conteúdo do ovo. Estas culturas ex ovo aumentar a acessibilidade do embrião CAM e pinto, permitindo fácil na documentação vivo de efeitos e facilitar a manipulação experimental do embrião. Isso permite que a aplicação bem sucedida de um grande número de questões científicas: (1) Como um ensaio de angiogênese melhorou ^5,6, (2) um conjunto experimental para injectáveis ​​facilitado no vítreo do embrião olho pinto ^7-9, (3) como um ambiente de teste para a divulgação e intravasation dispersos de células tumorais de linhas celulares estabelecidas inoculados no CAM ^10-12, (4) como um sistema melhorado manutenção para o transplante bem sucedido e cultura de brotos de membros de frango e camundongos, bem como ¹³ (5 ) para enxertia, propagação e re-enxerto de tecido de tumores sólidos primários obtidos de biópsias na superfície do CAM ^14.

Neste artigo descrevemos o vídeo estabelecimento de uma cultura refinada pinto ex ovo e ensaio CAM com taxas de sobrevida em 50%. Além disso, fornecemos uma demonstração passo a passo da aplicação bem sucedida da cultura ex ovo para um grande número de aplicações científicas.

Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, e Sebastian Gustmann contribuíram igualmente para este estudo.

Protocolo

Todos os equipamentos e reagentes têm de ser comprados estéril ou deve ser de calor ou vapor esterilizado ou esterilizado com ETOH 70%.

Os autores afirmam que experiências em animais foram realizados de acordo com as Comunidades Europeias Directiva do Conselho (86/609/CEE), seguindo as orientações do NIH sobre o cuidado e uso de animais em procedimentos experimentais e os regulamentos estabelecidos pelo animal Institucional Cuidado e Uso Committee (IACUC) da Universidade de Duisburg-Essen (Alemanha).

Parte 1: Incubação de ovos

1. Ovos fertilizados podem ser armazenadas a 13 ° C por até uma semana.
2. Os ovos são incubados por 72 horas, encontrando-se horizontalmente em uma incubadora com uma bandeja de mover, girar os ovos 12 vezes por dia continuamente. Umidade é mantida em 60-62%, temperatura de incubação a 37,5 ° C.
   Nota: Antes de iniciar a incubação, sujeira, excrementos e penas são cuidadosamente removidas as cascas de ovo mecanicamente por limpeza a seco com comum, cinza zigzag toalhas de papel, que tem um áspero ao invés de uma estrutura de superfície macia. Limpando os ovos com etanol ou desinfetante, no entanto, reduziu significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões, independentemente do líquido usado.

Parte 2: Ex cultura ovo

1. Após a incubação por 72 horas, os ovos são retirados da incubadora.
   Nota: Os ovos são incubados por 72 horas porque - de acordo com nossas experiências - por razões desconhecidas, mas de acordo com Auerbach et al.1 fases de desenvolvimento anteriores tinham taxas de sobrevivência significativamente menor. Em fases posteriores de 72 horas do saco vitelino, que ainda não está coberto pelo CAM torna-se mais fina e tende a aderir à casca do ovo líder (i) a pequenas hemorragias na área de adesão e (ii) a ruptura da gema saco- membrana. Portanto, o método apresentado não é aplicável aos embriões com mais de 72 horas.
2. A parte superior dos ovos, onde reside o embrião, é marcado por lápis desde o embrião resiste a rotação até certo ponto.
3. O ovo está na horizontal com a marca de lápis em cima e rachada na borda de uma barra de agitação 80 milímetros triangular magnética perpendicular postura orientada ao longo eixo do ovo.
   Nota: Para um melhor sentimento, sem luvas devem ser utilizadas, mas as mãos devem ser desinfectadas com EtOH 70%. É importante que a casca do ovo, bem como a membrana de ovo são abertos. Vazamento de clara de ovo é um sinal seguro de que a membrana do ovo tem sido perfurado.
4. O ovo é mantida perto do fundo da placa de Petri para evitar vazamento de mais de clara de ovo.
   Nota: Durante o procedimento de abertura inicial, é importante que a clara de ovo no fundo da placa de Petri ainda está conectado com o resto dentro do ovo, pois isso resulta em um vácuo dentro do ovo que detém a gema com o embrião em cima dentro o ovo. O vácuo pode ser regulada tanto por pressão do dedo que controla a entrada de ar para dentro do ovo ou levantando o ovo que aumenta a coluna de conectado clara de ovo ou seja, o vácuo.
5. Suavemente aplicar pressão ao meridiano que atravessa o crack e equador do ovo com o polegar eo dedo médio, é possível regular o vácuo. O conteúdo do ovo pode então ser transferido para a placa de Petri sem danos, se o ovo com a gema é suavemente levantado e ambas as metades da casca são cuidadosamente separados. O embrião e os vasos gema deve ficar no topo de uma gema intacta.
   Nota: Se a marca de lápis não é mantido no topo, o embrião pode ser ferido quando quebra a casca. Se os ovos não estão rachados com cuidado suficiente, ou os embriões são mais de 72 horas (veja acima), o saco vitelino adere ao shell e freqüentemente rupturas. O mesmo acontece quando a umidade da incubadora é inferior a 60% ou ovos não são rodados durante a incubação.
6. Ex culturas ovo são retornados para uma incubadora e mantidos a 37,5 ° 38,2 ° C e umidade de 60%. CO ₂ ou O fornecimento de ₂ não é necessário se a incubadora não é fechado hermeticamente (grade de ventilação parcialmente aberta!) E pratos especiais Petri com espaçadores entre tampa e prato são usados.
   Nota: Mudança de os embriões devem ser mantidos a um mínimo durante os primeiros dias de incubação. Demais resultados agitação em altas taxas de mortalidade. De incubação dia 9 em diante, os embriões são menos sensíveis à agitação.
   Embriões mortos devem ser removidos imediatamente para evitar infecções.
   Se incubadoras de cultura de células são usadas, que são fechados hermeticamente, O fornecimento de ₂ é obrigatório para os embriões não morrer. A umidade é essencial para não o CAM a secar e se a temperatura de incubação é inferior a 37 ° C, os embriões se desenvolvem muito lentamente.

Parte 3: Aplicação de substâncias para ensaios de angiogênese

1. Autoclavado dobrado papéis de filtro (50,5 milímetros de diâmetro) são perfurados por um furador e usado como material de apoio (transporte) para substâncias líquidas aplicadas ao CAM.
   Nota: Quase material de cada operadora (veja tabela abaixo) causou irritação do CAM, especialmente quando aplicado antes do dia de incubação 10, como ele mudou a arquitetura navio desenvolvimento CAM. Isso também incluiu substâncias potencialmente inerte como a folha de hidroxietilcelulose, esponjas Teflon (PTFE-pledgets), esponjas de colágeno, folha de colágeno, gaze estéril (cotonetes), lamínulas redondas, e anéis de silicone, o que causou todos os resultados falso-positivos. Papel de filtro parecia causar o mínimo de irritação e, portanto, foi utilizado em nossos ensaios.
2. Quando o CAM está totalmente desenvolvido, até 6 amostras diferentes podem ser aplicadas e seus efeitos podem ser comparados em uma única CAM.
3. Para evitar a secagem filtros doses adicionais (3 mg angiotropin nativo) ou tampão (5 mL PBS) deve ser reaplicado a cada dia.
4. A partir de dia 3 após a aplicação, os vasos sanguíneos se orientar em direção a substâncias angiogênicas nos filtros, enquanto que o padrão de vasos sanguíneos ao redor controles é inalterada.
   Nota: O CAM não deve ser confundida com a gema saco. O CAM é uma estrutura dinâmica de desenvolvimento, enquanto o saco vitelino é estática com variações pouco durante o desenvolvimento. No dia três, o desenvolvimento CAM em desenvolvimento podem ser reconhecidos, pela primeira vez na extremidade caudal do embrião como uma pequena vesícula. Entre os dias três e dez dias da vesícula inicial se expande, criando uma membrana de duas camadas dobradas overgrowing o saco vitelino em uma taxa crescente. O local de aplicação deve ser meio caminho entre embrião e da dobra do CAM (fronteira) conforme o embrião dificulta a observação microscópica de efeitos de luz transmitida. Alternativamente, o filtro com a substância angiogênico é internalizado quando o CAM continua crescendo.

Parte 4: A inoculação de células para o CAM

4.1.Preparation de células

1. Células confluentes são transferidos da garrafa de cultura para tubos FALCON pelo uso de uma pipeta estéril, 25 ml usando uma ajuda da pipeta.
2. Para estimar o número de células, 15 mL da suspensão de células é transferido para uma câmara de Neubauer e as células são contadas manualmente sob um microscópio.
3. Tubos Falcon são centrifugadas por 3 min a 1000 rpm em temperatura ambiente eo sobrenadante é descartado.
4. Para rastreamento de células vivas, as células são diluídos com PBS para a concentração desejada (aqui: 2x10 ⁷ células / ml) e corados com, por exemplo PKH26 (Sigma), um vermelho fluorescente de células vivas kit rotulagem de membrana, de acordo com os fabricantes de "protocolo.
   Células são re-suspensas em meio de cultura celular (preferencialmente meio modificado Dulbecco águia; DMEM) para a concentração desejada para injeção (10 ⁷ células / ml) ou a inoculação (3x10 ⁶ células / ml). Concentrações de células diferentes são aplicadas para injectáveis ​​x inoculação de acordo com as concentrações já publicados na literatura ^15-17 e nossa experiência.

4,2 inoculação de células para o CAM

1. Anéis (~ espessura 1mm) são cortadas a partir de uma ponta da pipeta de 1ml ou um cateter venoso periférico (PVL) do tubo pelo uso de um bisturi afiado e aplicada à CAM de um E6-E14 pinto embrião ovo ex cultivadas.
   Nota: Tente não "viu" várias vezes, mas para cortar a ponta da pipeta ou tubo de cateter com um corte com um bisturi novo, muito afiada para evitar bordas afiadas sobre os anéis resultantes. Verifique os anéis sob o microscópio para arestas resultantes de micro-rachaduras.
2. Dependendo do tamanho dos anéis 20 l de 3x10 ⁶ células / ml células são pipetados no total em um anel ou como volumes dividido em vários anéis.
   Nota: Em alguns casos, traumatismos do CAM por raspagem gentil é um pré-requisito, por exemplo, para facilitar a inoculação das células ¹⁷ e capillarisation de enxertos (veja abaixo). Se, no entanto, traumatismos do CAM não é intencional ou contra-indica, por exemplo, para estudos do potencial de invasão das células tumorais, os anéis não devem ser usadas para a inoculação, mas as células devem ser aplicados diretamente como aplicação de anéis ou anéis se pode induzir lesão micro . Se os anéis são usados, estes devem ser cortados o mais fino possível para minimizar o peso e evitar o recuo do CAM.

Parte 5: injeção intravítrea de células

1. A seringa de microlitro Hamilton é lavado várias vezes com EtOH 70% e, finalmente, com PBS estéril.
2. A seringa micro é preenchido com a suspensão de células preparadas manchados ou imaculada (ver parte 4.1).
   Nota: O local da injeção tem que ser cuidadosamente escolhidas, para não ferir os vasos sanguíneos das estruturas adjacentes CAM ou do embrião (brain!) por mais de penetração com a agulha. A injeção deve ser feita sob um binóculo dissecção.
3. Sob controle de microscópio, Com cuidado, mas rapidamente penetrar no CAM e camadas de olho com a agulha da seringa e continuamente injetar 10 a máxima suspensão de células 20 l (preferencialmente diluído em PBS) no vítreo do pinto embrião ovo ex cultivadas.
   Nota: Se o CAM não pode ser penetrada com a agulha, ele pode ser removido em um local com poucos vasos sangüíneos ou nenhuma suavemente desmanchá-lo com duas pinças.
4. A agulha deve permanecer 1-2 segundos dentro do olho para evitar uma perda da suspensão de células injetadas pelo vazamento.

Parte 6: A dissecção de brotos de membros de frango

1. Os ovos são retirados da incubadora após 3 a 4 dias de incubação (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
2. Ovos são rachados na borda de uma barra de agitação magnética triangular e transferido para uma placa de Petri (detalhes: consulte a Parte 2) eo embrião é dissecado dos vasos gema conectado cortando um círculo usando uma tesoura primavera.
3. O embrião é transferido para uma placa de Petri fresco cheio de frio, PBS estéril pelo uso de uma colher pequena de drenagem e lavada por agitação tipo.
4. O embrião é transferido para uma placa de Petri pequena cheia de PBS estéril e livre de membranas que envolvem, cuidadosamente as destroçar com uma pinça fina.
5. Brotos dos membros são destacados por pinças microcirúrgicas o mais próximo do corpo possível, apreendido e transferido para o CAM de 8-10 dias de idade anfitrião ovo de galinha ex cultivados (ver procedimento de enxerto).

Parte 7: Preparação dos brotos dos membros do mouse

1. Acasalamentos tempo grávidas são criados e na manhã do dia em que um plug vaginal é detectado em acasalar fêmeas é designada 0 dias de gestação.
2. A fêmea grávida, foi sacrificado por deslocamento cervical quando o desenvolvimento dos embriões chegou dia embrionário (E) 10 a 13 e fixo em uma placa de cera.
3. A parede abdominal é umedecido com ETOH 70%, corte ao longo da linha média e os retalhos cutâneos são fixados lateralmente por pinos.
4. Ambos os cornos do útero são removidos do abdômen, individual e transferidos para um copo com PBS frio.
5. Os embriões são separados, transferidos para uma placa de Petri e parede do útero e as membranas embrionárias são removidos cuidadosamente pelo uso de fórceps.
6. Brotos dos membros são cortados pelo uso de tesouras primavera ou separada por uma pinça bem como junto ao corpo possível, apreendido e transferido para o CAM de 8-10 dias de idade anfitrião ovo de galinha ex cultivados (ver procedimento de enxerto).

Parte 8: Coleta de amostras de tumor

1. Biópsias de tumores são coletados em dois tubos Eppendorf ml preenchido com meio de cultura de células tumorais específicas (aqui: médio Leibovitz) e mantidas à temperatura ambiente.
2. Biópsias de tumores são cortados em pedaços por 1-2 mm3 bisturis esterilizados.
   Nota: Se as amostras de tumor eram muito pequenos, eles podem não anexar ao CAM, se eles eram grandes demais, o CAM pode ser ferido e que o embrião pode morrer.
3. Um pedaço do núcleo da amostra da biópsia é enxertado na CAM de 8-10 dias de idade anfitrião ovo de galinha ex cultivados (ver procedimento de enxerto).
   Nota: Levando material da superfície da biópsia aumenta o risco de contaminação com músculo ou tecido conjuntivo.

Parte 9: procedimento de enxerto

1. Para enxertia de gemas membro ou tecido tumoral, o CAM totalmente desenvolvido de 8-10 dias de idade embriões de galinha cultivadas ex ovo é usado.
2. Os enxertos são idealmente colocado no CAM perto de uma bifurcação Y de um vaso sanguíneo.
3. No local da aplicação desejada, o CAM é seletivamente traumatizado por off de raspagem suave (fórceps) a parte superior peridermal da dupla camada epitelial, deixando a camada basal intacta.
   Nota: É essencial para evitar sangramento ou ruptura de capilares visíveis.
4. O enxerto é transferido para o CAM com PBS mínima anexado. Dependendo do enxerto, pode ser colocada uma ou duas vezes em um site do CAM, onde não há finais de enxerto é destinado para remover excesso de PBS e, finalmente, enxertado no local CAM preparado traumatizados.
5. O enxerto é agarrado por uma pinça fina e em camadas sobre a CAM. Dependendo da sensibilidade do enxerto, uma leve pressão pode ser aplicada (não é adequado para brotos dos membros) para manobrar o enxerto em um recuo resultante do CAM (adequado para amostras de tumor).
   Nota: Como o sistema imunológico desenvolve pinto no dia embrionário (E) 18, ex culturas xenoenxertos ovo não deve ser prolongada para além E17 como o anfitrião embriões de galinha morrem.
   É importante ter CAMs anfitrião disponíveis, respectivamente embriões de galinha ovo ex cultivadas, para coincidir com uma fonte de tecidos de uma doadora de sua escolha.

Parte 10: Re-enxerto

1. O embrião de galinha hospedeiro é morto por decapitação.
2. A CAM comenxerto em anexo é removido por um corte circular com uma tesoura apontada e transferidos para uma placa de Petri cheia de PBS.
3. CAM excessiva é cortado a partir do enxerto com tesoura de primavera, exceto para o local de ligação anterior.
4. Em caso de amostras maiores de tumores, o enxerto é cortado em metades ou vários pedaços menores e re-enxertados com o gume de frente para o CAM nova do anfitrião segundo.

Parte 11: Resultados Representante

Figura 1. Shell-less cultura de frango
Embriões de galinha de diferentes estágios de desenvolvimento cultivadas ex ovo em placas de Petri.

Figura 2. Angiogênese ensaio Ex ovo CAM
Ovos de galinha fertilizados foram incubadas horizontalmente a 37 ° C e umidade de 60-62% e rachada em placas de Petri no dia embrionárias 4 (E4). De incubação foi mantido nas mesmas condições. No E10 estéril papéis de filtro (5,5 mm de diâmetro) foram mergulhadas em cima do CAM e encharcado ou com 5 mL de PBS ou 3 mg angiotropin6 nativa. Capilares mostraram alinhamento óbvia para o papel embebido angiotropin filtro em E14.

Figura 3. Ovo Ex enxerto de brotos dos membros
Brotos dos membros do pinto (E3/E4) e mouse (E13) foram enxertados na CAM de culturas shell-less frango. Vasos sanguíneos do CAM entrou no brotos dos membros após dois dias. O desenvolvimento de brotos dos membros continuaram nestas culturas ex ovo alcançando um estágio falange dois no pinto e exibindo redução da teias interdigital em brotos dos membros murino.

Figura 4. Inoculação in ovo Ex de amostra de tumor
Uma amostra de biópsia de carcinoma da bexiga foi inoculado para o CAM de 10 dias de idade pinto embrião ovo ex cultivadas. Depois de dois dias em cultura, o espécime do tumor foi conectado à vasculatura CAM e após 7 dias, os vasos sangüíneos múltiplos entrar no enxerto foi observada.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Inovador ou apenas um outro protocolo cultura pinto?

Protocolos com o ex-shell-less cultura ^04/01 as taxas de sobrevivência total da embriões de galinha eram baixos, por exemplo, ca. 30% ^1. O requintado ex protocolo cultura ovo descrito neste artigo de vídeo, por outro lado, permite taxas de sobrevivência superiores a 50%. Comparado ao clássico em culturas ovo cultura ovo ex de embriões de galinha significativamente fac...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Eggs	Animal	Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice	Animal	Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray	Tools	Siemens AG	9503	Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160	Tools	Grumbach, Germany	8101	Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS	Reagent	Sigma-Aldrich		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium	Reagent	Sigma-Aldrich	D 6429	DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium	Reagent	Invitrogen	31415-029	here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium	Reagent	Sigma-Aldrich		each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH	Reagent	Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm	Tool	VWR international	442-0391	A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight	Tool	Fine Science Tools	14094-11	Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl	Tool	Hamilton Co	80222	Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm)	Tool	Fine Science Tools	18073-15	Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels	Tool			Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon	Tool	Geuder	15758	Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins	Tool	Home made		Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm	Tool	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes 92 x 16 mm	Tool	Sarstedt Ltd	82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm	Tool	Greiner Bio-One	664160	extra deep, with spacers for ventilation
Beaker	Tool			300-600 ml
FALCON tubes	Tool	Falcon BD		15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips	Tool			Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL)	Tool	Viggo®		Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips	Tool	Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter	Tool	Schleicher Schuell	311643	Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm	Tool	santec-medical	REF 277, LOT 832/511-1	Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000	Reagent			Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF	Reagent	BASF	S30200	mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura	Tool	Baxter Internationl Inc.	REF B2246000999999	Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm	Tool	Assistent Germany	1001/0011	Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge	Tool	Wyeth Animal Health		Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane	Tool	Resorba Woundcare Germany	LOT 280303	Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs	Tool	Fink Walter GmbH	REF 328132	Carrier; caused false positive results