Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação

Resumo

Neste artigo iremos descrever o procedimento para medir coeficientes de difusão usando multi-fotão de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Vamos começar pelo alinhamento do laser ao longo do caminho óptico para a amostra e determinar os parâmetros adequados experimental, em seguida, continuar gerando e, finalmente, ajuste de curvas de recuperação de fluorescência.

Resumo

Multi-fluorescência de recuperação após fotodegradação é uma técnica de microscopia utilizadas para medir o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análogos) de macromoléculas, e pode ser aplicado tanto

Protocolo

1. Alinhe as ópticas.

O equipamento fundamental para um experimento MP-FRAP incluem: um mode-locked fonte de laser, Cell Pockels (por feixe de modulação), gerador de pulso, dicróicas, lente objetiva, emissão de fluorescência de filtro, tubo fotomultiplicador fechado, e um sistema de gravação de dados (fóton counter e multicanal scaler).

2. Determine poderes monitorar segura.

1. Atenuar o laser a um ponto baixo, mas razoável de energia, para a geração de fluorescência da amostra.
2. Foco dentro da amostra.
3. Definir um contador de fótons para integrar mais de uma escala de tempo muito mais do que a recuperação de fluorescência esperado. Com o volume focal realizada parado dentro da amostra (em nosso software microscópio isso é conseguido por um scan ponto), gravar um número razoável de dados de contagem de fótons.
4. Aumentar o poder e tomar outra série de dados de contagem de fótons. Repita até que o aumento na contagem de fóton parece diminuir significativamente em relação ao aumento de potência.
5. Log plot (contagem de fóton) como uma função de log (potência). Um desvio de uma pista de dois indica branqueamento durante o monitor. Escolher como seu poder monitorar um poder que está abaixo desse corte, mas que permite um sinal-ruído razoável.

3. Determinar parâmetros de entrada para o gerador de pulso e multicanal scaler.

1. Determine back-of-the-envelope estimativas do coeficiente de difusão eo tempo de recuperação com base na literatura e / ou a equação de Stokes-Einstein ea equação de difusão.
2. Definir os valores dos parâmetros necessários no gerador de pulsos eo scaler.
   1. No gerador de pulso, definir os tempos de pré-alvejante e água sanitária. Um bom conjunto de regras de ouro é que o pré-lixívia deve ser 1-2 vezes maior do que o tempo esperado de recuperação meia, eo tempo de lixívia deve ser um décimo do tempo de recuperação esperado meia.
   2. Sobre o scaler, definir a largura bin para aproximadamente metade da água sanitária, duração e definir o número de caixas por registro de tal forma que o produto de sua largura bin selecionados e caixas por registro for maior ou igual a cerca de sua recuperação que se espera cheio mais pre -lixívia e os tempos de lixívia.
   3. Retornar para o gerador de pulso e definir a freqüência da seqüência pre-bleach/bleach/monitor igual a um valor apenas menor do que o inverso do produto dos tempos bin largura do número de caixas por registro. *
   4. Por fim, defina o número de registros / scan no scaler com base na intensidade do sinal em sua alimentação do monitor escolhido.
      
      * É muito importante que o tempo para uma seqüência pre-bleach/bleach/monitor completa (1/frequency) definido no gerador de pulso é maior do que o tempo de coleta de dados (bin largura x caixas / registro) set no scaler. Se este critério não for cumprido, triggers lixívia múltiplos podem aparecer dentro de um único registro no scaler.
3. Definir a energia do monitor para um nível aceitável, determinado anteriormente. Definir o poder de lixívia para 200 mW ou mais acima do limite de branqueamento determinada durante o teste de monitor de branqueamento. Esses poderes são definidos como voltagens diferentes em todo o cristal PC.
4. Seal ao microscópio, desligue as luzes, ligar a PMT, começam uma varredura ponto no software microscópio, em seguida, iniciar o gerador de pulso e scaler.
5. Analisar a curva de recuperação resultante traçando a curva e marcando três pontos importantes: 1) o pré-fluorescência lixívia, 2) a fluorescência imediatamente pós-lixívia, e 3) de fluorescência no final do conjunto de dados. Use os valores de fluorescência pré e imediatamente pós-lixívia para melhor estimar o tempo de meia-recuperação.
6. Com essa estimativa do tempo de recuperação de meia, use as regras de ouro descritos anteriormente para determinar novos valores para o pré-bleach bleach, e durações largura bin. Além disso, use a fluorescência pré-sanitária e de fluorescência no final do conjunto de dados para melhor estimar o tempo necessário para conseguir a recuperação completa. Como regra geral, os dados devem ser recolhidos para um período de tempo que permite a recuperação total serão comunicados para a segunda metade dos dados.
7. Ajustar os parâmetros do gerador de pulso e scaler, dê uma nova curva, e continuar ajustando os parâmetros até a curva apresenta um alvejante forte e suave recuperação. Tenha em mente que a duração lixívia pode, e deve, ser reduzida abaixo da regra de ouro, se possível. O poder lixívia também pode ser ajustado se muito superficial ou muito profunda, um alvejante é alcançado.

4. Teste para a saturação de excitação.

1. Usando monitor apropriado e poderes lixívia, determinado previamente, tomar uma série de MP-FRAP curvas. Analisar cada recuperação, normalizada para a fluorescência pré-lixívia, utilizando o formulário apropriado matemática e uma mínimos quadrados não-linear algoritmo de montagem (ver "Análise de Dados" abaixo). Registrar o valor do parâmetro equipado profundidade lixívia.
2. Continue a tomar e analisar série sucessiva de MP-FRAP curvas de aumentar os valores de poder alvejante.
3. Log plot (parâmetro de profundidade lixívia) como uma função de log (potência). Qualquer desvio de uma pista de dois indica a saturação de excitação. Escolha um poder alvejante que gera um lixívia forte, mas não causa saturação.

5. Continue a tomar MP-FRAP curvas.

1. Continuar a tomar as curvas, como acima, vai todos os parâmetros devidamente definidos.

6. Análise de Dados.

1. Remove os dados pré-alvejante e água sanitária a partir dos dados de fluorescência definir e ajustar os dados de tempo tal que t = 0 corresponde ao valor de fluorescência imediatamente pós-lixívia.
2. Normalizar a recuperação de fluorescência resultante no que diz respeito à fluorescência pré-bleach média.
3. O traçado da curva normalizada usando o modelo matemático apropriado e de um algoritmo não-linear, pelo menos, praças de montagem, como a função lsqcurvefit em MATLAB. O modelo apresentado aqui é responsável por recuperações de fluorescência influenciado por ambos difusão e fluxo de convecção:
   
   onde F é a fluorescência _o pré-bleach média, β é o parâmetro de profundidade de água sanitária, τ _D é o tempo de recuperação característica difusivo, R é a razão entre o quadrado da axial (w _z) e radial (w _r) larguras das dois fótons de volume focal, τ _vx = w _r / v _x, τ _vy = w _r / v _y, τ _vz = w _z / v _z e v ² = v _x ² + v _y ² + v _z ² é o velocidade do fluxo convectivo. Para o fluxo confinado ao plano de imagem, τ _vz → ∞ e 1 / τ _vx + 1 / τ _vy pode ser substituído com 1 / τ _vr. Na ausência de fluxo de convecção, dois exponenciais no numerador vai para 1 ea expressão é muito reduzida, a apenas dois parâmetros de ajuste, β e τ _D. O coeficiente de difusão é facilmente calculada como D = w _r ² / 8τ _D.

7. Resultados representante.

Figura 1. Lixívia Representante ea curva de recuperação para FITC-BSA. A curva de boa recuperação exibe uma lixívia forte e suave recuperação, com a fluorescência em plena recuperação que está sendo relatado para a segunda metade dos dados.

Figura 2. Curva de recuperação Normalizado para FITC-BSA (vermelho) eo ajuste dos mínimos quadrados associados (preto). Este ajuste produz um coeficiente de difusão de 52,9 UM2 / s, de acordo com a literatura.

Discussão

O poder da multi-fotão de recuperação de fluorescência após a fotodegradação reside na sua capacidade de sondar as amostras de espessura, com resolução em 3D. Desde seu desenvolvimento na década de 1990, MP-FRAP foi usado para determinar o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análoga) nos corpos celulares, ex vivo fatias grossas de tecido, e no tecido vivo e interstício. Neste artigo, apresentamos os equipamentos necessários para executar uma experiência MP-FRAP,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ti:sapphire laser	Newport Corp.	Mai Tai
Pockels Cell	Conoptics	350-80
Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	Fluoview
Short pass dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	670 DCSX-2P
Photomultiplier tube	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Photon counter	Stanford Research Systems	SR 400
Multi-channel scaler/averager	Stanford Research Systems	SR 430
Pulse Generator	Stanford Research Systems	DG 535
FITC-BSA	Invitrogen	--