Executar e Processamento de FNA Pad Fat Anterior para amilóide

Resumo

Aspiração gordura abdominal é um preferido, abordagem de custo minimamente invasivo e de baixo, em comparação com outros métodos para detectar amilóide para o diagnóstico de amiloidose sistêmica. Este artigo vídeo demonstra um esquema processual para a realização de aspiração de gordura pad com o processamento adequado da amostra para o resultado ideal de diagnóstico.

Resumo

Historicamente, as biópsias coração, fígado e rim foram realizados para demonstrar os depósitos de amilóide na amiloidose. Como a apresentação clínica da doença é muito variável e não-específicos, os riscos associados dessas biópsias são grandes demais para o rendimento diagnóstico. Outros sites que têm um menor risco de biópsia, como a pele ou gengival, também são relativamente invasivo e caro. Além disso, estas biópsias não pode ter sempre os depósitos de amilóide suficiente para estabelecer um diagnóstico. Aspiração almofada de gordura tem demonstrado boa correlação clínica com baixo custo e mínima morbidade. No entanto, não existem protocolos padronizados para realizar este procedimento ou o processamento do espécime aspirado, o que leva a resultados variáveis ​​e nonreproducible. A modalidade mais utilizada para a detecção de amilóide no tecido é uma birrefringência verde-maçã em seções Congo manchada de vermelho usando um microscópio de luz polarizada. Esta técnica requer a preparação de células bloco de material aspirado. Infelizmente, pacientes em fase inicial de amiloidose têm quantidades mínimas de amilóide que reduz a sensibilidade do vermelho Congo seções célula corada bloco de aspirados gordura abdominal. Portanto, a avaliação ultra-estrutural dos aspirados almofada de gordura por microscopia eletrônica deve ser utilizado, dada a sua maior sensibilidade para a detecção de amilóide. Este artigo demonstra um procedimento simples e reprodutível para a realização de aspiração de gordura pad anterior para a detecção de amilóide utilizando tanto Congo coloração vermelha das seções bloco de células e microscopia eletrônica para identificação ultra-estrutural.

Protocolo

Introdução

Amiloidose sistêmica é uma doença altamente variável que se refere à deposição extracelular de várias proteínas que são referidos coletivamente como amilóide. Deposição destas fibras de amilóide beta pregueada com configuração leva a várias apresentações clínicas dependendo dos órgãos envolvidos. As manifestações de maior relevância clínica de amiloidose sistêmica são observadas quando há envolvimento de órgãos importantes como coração, fígado e / ou renal. Historicamente, esses órgãos envolvidos seria biópsia para demonstrar a presença de amilóide. Estes procedimentos invasivos realizados moderadamente um risco significativo incluindo hemorragia. Aspiração almofada de gordura já foi mostrado para fornecer um método confiável e não-invasivos para a detecção de amilóide na amiloidose sistêmica ^1. Este procedimento é essencialmente comparável à lipoaspiração da gordura subcutânea na parede abdominal anterior, sob anestesia local para recuperar o tecido fibro para avaliar depósitos de amilóide escassa nas paredes de pequenos vasos sanguíneos ^2.

O método mais utilizado para a identificação de amilóide no tecido continua a ser o padrão de birrefringência característica verde-maçã visto quando seções Congo manchada de vermelho são visualizadas em um microscópio de luz polarizada ^3. Quando a aspiração almofada de gordura é realizada, manchas vermelho Congo pode ser feito em qualquer direta slides manchada ou preparação de um bloco de células do tecido adiposo aspirado. No entanto, pacientes em estágios iniciais de amiloidose têm depósitos de amilóide escassa, o que reduz a sensibilidade do vermelho Congo seções célula corada bloco ^4,5. Avaliação ultra-estrutural dos aspirados almofada de gordura por microscopia eletrônica tem melhor reprodutibilidade e sensibilidade melhorada ^4. Portanto, recomenda-se a submeter todas as aspira gordura abdominal para ambos preparação de um bloco de celas e para a realização de microscopia eletrônica de ^2.

Aspiração gordura abdominal é um custo relativamente baixo e método não invasivo para a obtenção de tecido para diagnosticar amiloidose sistêmica. Este artigo descreve procedimento de aspiração de gordura pad, juntamente com detalhes sobre o processamento da amostra para enviar amostra para ambos os coloração vermelho Congo e avaliação ultra-estrutural por microscopia eletrônica. Neste vídeo, demonstramos este procedimento reprodutível e simples para recuperar material de diagnóstico ideal.

1. Realizar a FNA de Pad Fat Anterior

A. anestesiados da área local (Figura 1 e 2)

1. Usando compressas de álcool ou o agente de limpeza de pele preferido por uma instituição particular, limpar a pele na área quadrante inferior do abdômen lateral à linha média e abaixo do umbigo (Figura 1).
2. Marca uma área em forma rombóide cerca de 2 x 2 polegadas, como mostrado na Figura 1 com uma caneta de marcação.
3. Aspirar cerca de 10 mL de lidocaína a 1% com agulha 18G. Anexar a 1 25G ½ polegadas de agulha para a seringa. Remover o ar tocando a seringa na posição vertical, enquanto pressiona o êmbolo até que o líquido é dispensado e não há bolhas de ar estão presentes.
4. Anestesiar ao longo das fronteiras da área rombóide já está marcado como mostrado na Figura 2. Comece por inserir a agulha 25G logo abaixo da pele no ponto A e empurre cuidadosamente a agulha por via subcutânea a ponto X. Puxe o êmbolo da seringa para garantir que você não está dentro de um vaso. Em seguida, empurre lentamente o êmbolo para se infiltrar até 2,5 mL de lidocaína (cerca de ¼ da lidocaína em seringa de 10 mL) ao retirar a agulha para o ponto A, sem deixar que a agulha sair da pele no ponto A (Figura 2A3). Com a agulha ainda sob a pele mudar a direção para o ponto Y (Figura 2A4) e empurre a agulha por via subcutânea a ponto Y (Figura 2b1). Como antes, confirmar que a agulha não está em um navio e dispensar cerca de 2,5 mL de lidocaína, enquanto lentamente retirar a agulha através do ponto A. (Figura 2b3 através 2B4) Repita os passos similares a partir do ponto B e lidocaína distribuição subcutânea a partir de pontos para B X e B para Y (Figura 2c1 através 2d4). Prevenir o sangramento do pica A e B pela aplicação firme da parte calibre estéril.
5. Você pode agora verificar que a área é anestesiada pelo tocando levemente a pele dentro do rombóide anestesiados por uma dica / canto de pedaço de gaze de algodão, comparando com a pele não anestesiados adjacentes.

B. Realizar aspiração almofada de gordura (Figura 3)

(Aplicação de anestesia local antes da realização de aspiração almofada de gordura pode ser ignorada, dependendo das preferências regionais e individuais. Corretamente realizada PAAF procedimento de aspiração de gordura pad anterior pode ser completado em uma picada. No entanto, dependendo do limiar de dor de cada paciente , manobras de agulha 18G e voltando para o tecido adiposo subcutâneo é relativamente distrescantar. O método descrito aqui anestesiados alcança o efeito em apenas duas picadas com agulha 25G e evita a dor com maior tolerância ao procedimento.)

1. Montar 18G 1 ½ polegadas de agulha em uma seringa de 10 mL. Monte o conjunto da seringa de agulha nas garras seringa ("grip PAAF / pistola") para a aplicação adequada e liberação de vácuo.
2. Insira a ponta da agulha para a gordura subcutânea dentro da área limpa e anestesiados rombóide (Figura 3a).
3. Retrair completamente o êmbolo da seringa com a agulha inserida no tecido subcutâneo para gerar vácuo (Figura 3b).
4. Manter o vácuo e manobrar a agulha e para trás em várias direções para a gordura subcutânea (Figura 3c através 3i). Cada curso deve ser tão longo quanto possível, com o comprimento da agulha selecionadas, sem deixar que a agulha sair da pele. Máxima de amostragem é conseguido através da mudança de direção com cada curso (Figura 3i). É importante manter a direção da agulha tangente ao serosa e paralelo à superfície da pele para evitar a perfuração da cavidade peritoneal.
5. O tecido fibro-adiposo se acumula na seringa. Fragmentos de tecido fibro uma vez o suficiente (até 1 mL de amostra de sangue rico fragmentos mistos) são recuperados, a liberação do vácuo completamente e retire a agulha (Figura 3k).
6. Que o paciente ou o assistente aplicar pressão firme sobre a área de processo com uma almofada de gaze para evitar o extravasamento de sangue.

2. Processamento de amostras

1. Coloque pelo menos 5-6 fragmentos de tecido fibro-adiposo na solução de glutaraldeído para microscopia eletrônica (Figura 4B).
2. Dependendo do protocolo institucional, um esfregaço alguns dos fragmentos de tecido fibro-adiposo podem ser preparadas por espalhá-las entre dois slides (Figura 4A).
3. O restante do material é permitida a coagular na seringa (isso pode demorar 5-7 minutos, dependendo do tempo de coagulação) (Figura 4C).
4. Aspirar formalina a 10% dentro da seringa para que o material de tecido coagulado fibroadiposo é desalojado da parede da seringa e flutuantes livres (Figura 4C2). Retire o êmbolo da seringa (Figura 4C3) e transferir o tecido fibro-adiposo coagulado no recipiente formalina a 10% da extremidade aberta da seringa em frente à extremidade do bico (Figura 4C4).
5. Rotular os recipientes de forma adequada e submeter o glutaraldeído para microscopia eletrônica e do formol para a H & E seção e coloração vermelho Congo para avaliação sob microscopia de polarização. Se esfregaços são preparados, eles podem ser processados ​​de acordo com o protocolo do laboratório individual.

Figura 1. Área a ser anestesiada para a PAAF de gordura abdominal anterior.

Figura 2. Anestesiados da área local.

Figura 3. Realizar PAAF de gordura abdominal anterior.

Figura 4. Processamento de gordura abdominal anterior aspirar a ser submetida ao laboratório para detectar depósitos de amilóide.

3. Resultados representante

Figura 5. Amilóide na parede dos pequenos vasos sanguíneos em fragmentos de tecido fibro-adiposo. Tecido fibro-adiposo foi formalina processados ​​parafina, incorporado, corados com vermelho Congo, e examinadas por microscopia de luz polarizante. Amilóide na parede dos pequenos vasos sanguíneos mostra birrefringência verde-maçã (seta branca).

Figura 6. Tecido falta amiloidose. A maçã birrefringência verde é ausente em tecidos de um paciente diferente sem amiloidose. Birrefringência azul (seta branca) de fibras colágenas, geralmente estão presentes em quase todos os espécimes.

Figura 7. Fibrilas amilóides consistente com na parede dos vasos sanguíneos. Micrografia eletrônica da reta, não-ramificadas, aleatoriamente espalhadas 80-10 nm de diâmetro fibrilas amilóides formado por na parede dos vasos sanguíneos.

Discussão

Diagnóstico de amiloidose é geralmente obtida com uma biópsia do tecido dos órgãos afetados, como o rim, fígado e / ou coração. Esta abordagem tem rendimento diagnóstico de alta, no entanto, é invasivo e pode estar associada a complicações, incluindo hemorragia ^2. Retal, gengival e biópsias de medula óssea foram preferidas para o diagnóstico como abordagem relativamente menos invasivo em 1960 ^6,7,8. Pad aspiração de gordura abdominal foi relatada em 1973 como um cofre, procedimento minimamente invasivo, simples e menos dispendiosa para o diagnóstico do tecido de amiloidose sistêmica ^1. No entanto, os detalhes do procedimento e abordagem ao processamento da amostra recuperada não é coerente relatados. Este vídeo eo artigo descrever o procedimento passo a passo.

A abordagem para a detecção de amilóide na aspiração almofada de gordura, da mesma forma, também não é bem padronizado, com poucos estudos comparando e avaliando várias abordagens ^1,5,6,7,8. Avaliação do anterior aspira gordura abdominal com coloração vermelho congo é menos sensível com reprodutibilidade menor interobservador especialmente nos casos iniciais de amiloidose com depósitos de amilóide escassos ^5. Imuno-histoquímica realizada em formol fixa parafina bloco de celas seções e Congo fluorescência vermelha realizado em esfregaços citológicos têm sido relatadas para melhorar a sensibilidade diagnóstica ^9,10. Microscopia eletrônica melhora a detecção e identificação de fibrilas amilóides escassa nas paredes de pequenos vasos sanguíneos no tecido fibro-adiposo em gordura pad aspirados ^{4, 5.} Com base nessas informações, este artigo descreve o processamento da amostra para preparar blocos de células (para avaliação de vermelho Congo seções célula corada bloco sob microscópio de luz polarizada para o diagnóstico birrefringência verde maçã e também para imuno-histoquímica como indicado) e para microscopia eletrônica. No entanto, dependendo da abordagem escolhida para a avaliação da amostra para amilóide, que pode ser submetido a citologia preparação de esfregaço, a preparação de blocos de células, e processamento para microscopia eletrônica. Alguns laboratórios realizam os testes nos esfregaços preparados a partir dos fragmentos de tecido fibro aspirado e corados com vermelho Congo para estudar a ¹⁰ de fluorescência.

Geralmente em uma amiloidose tarde, a microscopia óptica com vermelho Congo microscopia de polarização pode ser suficiente, no entanto, nos estágios iniciais da doença coloração vermelho Congo com microscopia de polarização em seções bloco de células é menos sensível e confiável para a gordura pad aspirados ^4,5,11 . Outras colorações especiais incluindo Thioflavin T pode ser usado com limitações semelhantes. Outras abordagens para detectar amilóide incluir a avaliação do esfregaço de aspirado de amilóide com vermelho Congo microscopia de polarização e fluorescência ^10. Em nossa experiência este método é menos reprodutíveis. Avaliação dos vasos sanguíneos na almofada de gordura para amilóide por microscopia eletrônica supera estas limitações ^4,11. Caracterização mais de amilóide foi relatado pela imunomicroscopia ^12, no entanto, estes métodos podem não ser amplamente disponível em um ambiente de cuidados não-superior.

Agulhas usadas para a realização de procedimentos de aspiração podem ser classificados de acordo com seus tamanhos de bitola em multa (21-25G), intermediária (18-20G) e grandes (por exemplo-14G) ^11. Anterior aspirações gordura abdominal foram relatados para ser executada usando calibres variáveis ​​que vão desde intermediária (18 a 20G) de multa (21 a 22G) ^2,10. A maioria das lesões de massa são aspirados com agulhas mais finas calibre (como 25G) para obter boa esfregaços citológicos, juntamente com passagens adicionais com agulha maior calibre (como 18G) para recuperar amostra adicional para os blocos de células.

Durante a aspiração almofada anterior de gordura, o tecido fibro coesa não aspirar bem com agulhas mais finas. Preparação celular bloco e microscopia eletrônica são importantes para a avaliação de paredes de pequenos vasos sanguíneos em fragmentos de tecido fibro no aspirado de gordura. Agulhas bitola mais larga (como 18G) são recomendados para produzir material adequado de diagnóstico ^2,10. Como o procedimento é comparável com a PAAF convencional, a aspiração de gordura abdominal é referida como PAAF, embora agulhas bitola mais larga pode ser usado para executá-lo ^5.

Materiais