Modelo de isquemia focal cerebral por oclusão Suture Endovascular da artéria cerebral média no Rat

Resumo

Indução cirúrgica de uma lesão cerebral isquêmico no rato é um modelo amplamente utilizado para a pesquisa acidente vascular cerebral. Aqui nós demonstram a indução de isquemia cerebral focal por oclusão da artéria cerebral média. Visualização do infarto resultantes de coloração histológica e ressonância magnética também é mostrada.

Resumo

AVC é a principal causa de incapacidade e terceira causa de morte em adultos no mundo inteiro ^1. Em tempos humanos, existe um estado altamente variáveis ​​clínicas; no desenvolvimento de modelos animais de isquemia focal, no entanto, conseguir reprodutibilidade de volume de infarto induzida experimentalmente é essencial. O rato é um modelo animal amplamente utilizado para acidente vascular cerebral devido a seus custos relativamente baixos criação de animais e à semelhança de sua circulação cranial ao dos humanos ^2,3. Em humanos, a artéria cerebral média (MCA) é mais comumente afetados em acidente vascular cerebral e síndromes múltiplos métodos de MCA oclusão (MCAO) têm sido descritos para imitar essa síndrome clínica em modelos animais. Porque recanalização comumente ocorre após um acidente vascular cerebral na reperfusão, humana depois de um período de oclusão foi incluído em muitos desses modelos. Neste vídeo, demonstramos o transitório endovascular de sutura modelo MCAO em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Um filamento com um revestimento de ponta de silicone é colocado na origem intraluminalmente MCA por 60 minutos, seguida de reperfusão. Note que o período de oclusão ideal pode variar em linhagens de ratos, tais como Wistar ou Sprague-Dawley. Vários indicadores comportamentais de acidente vascular cerebral em ratos são mostrados. Isquemia focal é confirmada usando T2 imagens de ressonância magnética e pela coloração seções cérebro com 2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) 24 horas após MCAO.

Protocolo

MCAO modelo Rat

Os preparativos pré-cirúrgica

Técnica asséptica deve ser usado para todos os procedimentos cirúrgicos de sobrevivência. Desinfetar a superfície de trabalho cirúrgico com desinfectante comercial e preparar pacotes cirúrgicos estéreis de instrumentos, cortinas, gazes, compressas, suturas, e lâminas de bisturi em autoclave. A máscara cirúrgica, gorro cabelo e luvas estéreis devem ser usados. A Germinator seca talão de esterilização também é usado para reesterilize instrumentos cirúrgicos entre os procedimentos de cirurgias de ratos se vários será feito durante uma sessão. Pré-aquecer um cobertor jaqueta de água homeotérmicos e colocar sob um pano absorvente para evitar a hipotermia do rato durante a cirurgia.

1. Lugar espontaneamente ratos hipertensos (ou tensão outro rato de escolha) em uma câmara de indução e induzir a anestesia com 5% de isoflurano (aparelho de anestesia deve ser ajustado para 1,0 L / min O ₂ e 1,0 L / min N ₂ O). Inferior a 1-2% de isoflurano para manter a anestesia.
2. Aplicar pomada lágrimas artificiais para ambos os olhos.
3. Raspar a garganta e região do pescoço esquerda, além do local da incisão prospectivos usando cortadores (Oster A5 com lâmina # 10).
4. Aplicar a Betadine uma gaze e desinfectar a pele a partir do centro da região cirúrgica, em espiral para fora. Enxágüe com gaze estéril, contendo etanol 70%, passando pad em um padrão similar. Repita os passos para um total de três ciclos.
5. Injetar 0,2 mL de bupivacaína a 0,5% por via subcutânea ao longo do local da incisão em perspectiva.
6. Rat lugar na meia estéril ou cobrir com uma cortina cirúrgica estéril.

Oclusão transitória da MCA

7. Sob um microscópio cirúrgico, uma incisão mediana ventral é realizada e da fáscia superficial é dissecado.
8. Abaixo da fáscia superficial, não há tecido glandular para a esquerda e três músculos que formam um triângulo: o esterno-hióideo, que se situa na linha média sobre a traquéia, o digástrico (facilmente identificada com sua porção tendinosa branco brilhante) e, por último, o músculo esternocleidomastóideo.
9. Dissecção cortante e contundente cuidado é realizado dentro do triângulo para identificar a artéria carótida (dissecção romba exclusiva pode ser preferido por alguns para minimizar os danos dos tecidos acidental). As artérias externa, interna e carótida comum (ECA, ICA, CCA) são expostos. A artéria carótida é grande e visivelmente pulsos. O nervo vago é visto correndo ao longo da face lateral de ambos comum e artérias carótidas internas e é fortemente dissecadas as artérias carótidas comum e interna.
10. Dois ramos ECA são, então, dissecados acentuadamente, o ramo medial e primeiro título do segundo ramo título lateralmente. Ambos os ramos são cauterizados e corte, que permite maior facilidade na mobilização dos navios de maior porte.
11. O ECA é agora dissecado mais rostralmente. O osso hióide pode ser encontrado e isso vai limitar a extensão da dissecção rostral. A artéria carótida externa é amarrado como distalmente possível com um fio de seda 6-0.
12. Outro fio de seda 6-0 é colocado frouxamente em torno do ECA, perto da bifurcação com a ICA. Certifique-se de não obstruir o vaso como a sutura intraluminal para ser usado para a oclusão estará passando por aqui em uma etapa posterior.
13. Clips microcirúrgicas são colocados em comum e artérias carótidas internas, perto da bifurcação.
14. Uma arteriotomia parcial inicial é criada entre os dois laços de seda de sutura na artéria carótida externa.
15. Introduzir um 2,2 cm de comprimento -3,0 de sutura 4-0 monofilamento nylon, com um centímetro de sua kink 2,0 arredondado, ponta de silício revestido, no lúmen ECA em direção ao CCA, onde o clipe está localizado microcirúrgica. Estes pontos são disponíveis comercialmente (Doccol Corp, Redlands, CA, EUA). Corte a porção restante da ECA (no local da arteriotomia parcial) para libertar o coto ea posição do tronco abaixo da bifurcação da ECA e ICA, o que irá permitir mais facilmente a sutura intraluminal para deslizar no ICA.
16. Aperte o fio de seda ao redor do coto ECA para proteger o fio de náilon intraluminal e prevenir o sangramento, e depois remover o clipe microvascular do ICA. Abra o clipe lentamente antes de removê-lo para verificar se há sangramento.
17. Continuar avançando a sutura de nylon do ECA para ICA lúmen da artéria cerebral média (MCA). Este comprimento é tipicamente 18-20 mm e é a razão para colocar uma torção na sutura antes da inserção. Depois de um comprimento variável de sutura nylon é inserido, a resistência pode ser sentida. Se isso ocorre com grande parte do fio de náilon ainda presente no exterior do navio, isso indica que a sutura é provável entrada da artéria pterigopalatina (ver nota abaixo). Puxar para trás e curva a sutura ligeiramente para continuar ao longo do ICA, que será executado mais medialmente. Além disso, a dissecção da origem do PPA pode ser feito para melhor visualizar o caminhodo filamento intraluminal. Continue a inserir o fio de náilon até sentir resistência durante e após a posição cm 2 torcida. Neste ponto, a sutura intraluminal bloqueou a origem do MCA. MCA oclusão pode ser confirmada através do monitoramento da redução do fluxo sanguíneo cerebral regional através de um laser fluxômetro Doppler (ver tabela Materiais para uma fonte de equipamento). Observe também que a origem da artéria pterigopalatina fora do ICA pode estar diretamente ligada off, se preferir, a fim de evitar a intubação acidental deste navio com o fio intraluminal.
18. Iniciar o cronômetro e registrar o tempo começar a oclusão.
19. Remover o microclip do CCA.
20. Fechar a incisão (derme, panículo carnosus, camadas de tecido subcutâneo) rapidamente com fio de seda 3-0 (um padrão simples contínuo irá facilitar a reabertura de reperfusão) e cuidadosamente coloque o rato em uma gaiola de recuperação. Verifique se o piso da gaiola em volta do nariz e da boca estão livres de material de cama e recuperação monitor da anestesia.

Restauração do fluxo sanguíneo MCA (reperfusão)

21. Pouco antes do período de oclusão deve terminar, re-anestesiar o rato, desinfectar o local da incisão com Betadine e etanol a 70% (3 ciclos, como antes) e reabrir a incisão através da remoção das suturas de fechamento.
22. Coloque um microclip no CCA, como antes.
23. Retirar a sutura parcialmente a oclusão da ACI até o final de sutura é visível através do ICA. NÃO remover completamente a sutura do ICA / ECA!
24. Coloque um microclip na ICA acima da extremidade do fio intraluminal.
25. Remover completamente a sutura oclusão e amarrar firmemente o coto ECA. Fim registro de oclusão (start reperfusão) tempo.
26. Remover o microclip do ICA.
27. Remover o microclip do CCA.
28. Umedecer a região com algumas gotas de solução salina estéril e fechar a incisão camadas (derme, panículo carnosus, tecido subcutâneo) com fio de seda 3-0 com um padrão simples interrompido.
29. Administrar a buprenorfina 0,05 mg / kg (ou outro analgésico pós-operatório adequado na sequência de suas diretrizes institucionais) para o espaço peritoneal.
30. Injetar 5cc de solução salina intraperitoneal pré-aquecido. Isto irá fornecer a hidratação durante a fase de recuperação.
31. Monitorar a recuperação de ratos da anestesia.
32. Depois de o rato se recuperou, teste comportamental para indicação de infarto mantendo o rato pelo rabo e observando se o rato pode girar para ambos os lados. Curling para um lado só é esperado. Escalas de classificação simples pode ser usado para gravar funcionamento pós-infarto inicial Behavorial (ver Discussão).
33. Injeções adicionais de buprenorfina (mesma dosagem acima) deve ser administrada a cada 6 a 8 horas para 24 horas de alívio da dor. Estender analgesia se o animal está mostrando sinais de desconforto.

Resultados representante

Figura 1. Oclusão da artéria cerebral média por sutura endovascular. Um diagrama simplificado do sistema circulatório do crânio do rato é mostrado com uma sutura de silício revestido intraluminal ocluindo a origem da MCA. A OA e ramos ST fora do ECA esquerda têm sido ligada e uma gravata de sutura ao redor do coto ECA detém a sutura intraluminal no lugar. ACA, artéria cerebral anterior; BA, artéria basilar; CCA, artéria carótida comum; ECA, da artéria carótida externa; ICA, artéria carótida interna; MCA, artéria cerebral média; OA, artéria occipital; PCA, artéria cerebral posterior; PComA, comunicante posterior artéria; PPA artéria, pterigopalatina; ST, artéria tireóidea superior. Figura adaptada de Sasaki et al. ⁴ e Lee ^3.

Figura 2. Ressonância magnética representante de cortes coronais de cérebro de rato, 24 horas após uma hora MCAO transitória. Edema cerebral que acompanha a isquemia focal é visualizado em T2 de ressonância magnética. A zona de infarto aparece hiperintenso (claro) em imagens de T2. Padrões de infarto semelhante pode ser visto com mais avançadas técnicas de ressonância magnética, como imagem ponderada em difusão e coeficiente de difusão aparente mapeamento ^5.

Figura 3. Representante cortes coronais do cérebro de ratos corados com TTC 24 horas após uma hora MCAO transitória. Coloração TTC revela branco (sem manchas) regiões de infarto do córtex cerebral e estriado em ratos mesmo que é mostrado na Figura 2. Note-se que o padrão geral de lesões isquêmicas focais é semelhante à observada na ressonância magnética T2, embora a área de infarto final determinado histologicamente pode ser ligeiramente menor do que a lesão T2.

Discussão

Modelos de roedores de isquemia cerebral pode ser classificado como global ou focal e como reversível ou irreversível. Nós usamos um modelo de isquemia focal reversível, a fim de imitar a lesão de reperfusão, que pode ocorrer em humanos após recanalização pacientes com AVC. Enquanto as ações de ratos a vantagem de circulação cranial semelhante ao humano, a extensa circulação colateral intracraniana devido ao Círculo de Willis e os resultados leptomeníngea anastomoses em volumes incompatíveis infarto ^6. Nós usamos o rato espontaneamente hipertensos (SHR) tensão por causa do tamanho do infarto é maior em SHRs expostos a isquemia cerebral focal em comparação com ratos normotensos ^70-10. Indução de acidente vascular cerebral em SHRs também é mais consistente e pode gerar menor mortalidade do que em outras cepas comumente usados ^​​11. Além disso, parâmetros fisiológicos devem ser monitorados durante toda a cirurgia, porque as flutuações pode adicionar à variabilidade nos volumes de infarto; estes parâmetros incluem pressão arterial O ₂ e CO ₂ níveis, hipotermia e hiperglicemia, que pode agravar a lesão isquêmica ^2,12 . A hipotermia é particularmente preocupante, pois pode diminuir o grau de lesão neuronal isquêmica e, portanto, colocando o rato sobre uma almofada de aquecimento de termorregulação durante a cirurgia é essencial.

Nós empregamos comercialmente preparado de silício revestido suturas neste procedimento, na tentativa de aumentar a consistência no tamanho do infarto ^13-15. Tradicionalmente, suturas intraluminal usado para ocluir o MCA foram preparados pelo fogo-de arredondamento uma ponta de sutura 3-0 nylon ou usando uma pistola de cola quente para cobrir a ponta de sutura com uma cola pequena pérola ^16. Tais procedimentos produzem suturas com diâmetros variando ponta e, assim, pode exigir várias tentativas de oclusão antes de encontrar uma sutura que coincide com o diâmetro do vaso de um rato dado. Variações adicionais sobre o método MCAO descritos neste vídeo incluem oclusão mais distal, poupando os ramos lenticulostriate a fim de ter um infarto puro cortical ^17, e oclusão simultânea do MCA e artéria carótida comum ipsilateral para reduzir o fluxo de sangue colateral ^6,9.

Os efeitos funcionais de acidente vascular cerebral pode ser avaliado usando uma variedade de testes comportamentais, em que os déficits em tarefas específicas se refletem em uma escala de pontuação simples. Por exemplo, Bederson et al. ¹⁸ desenvolveu uma classificação neurológica ratos pontuação do grau de flexão do membro anterior em uma posição corporal elevada, resistência assimétrica para um empurrão lateral, e comportamento em campo aberto circulando. Ratos estendendo ambos os membros anteriores para o chão quando elevado e que não apresentam déficits de outras foram classificadas "Normal (0)", enquanto os ratos com a flexão do membro anterior contralateral só foram classificados com "déficits moderados (1)". "Grave grau 2" ratos diminuiu a resistência exibida no lado contralateral a uma força lateral e "grave grau 3" ratos circulando adicionalmente envolvidos em comportamentos. Menor grau de déficits comportamentais foram sempre observadas no grau imediatamente superior (por exemplo, grau 2 e 3 os animais também exibido flexão forelimb) e os escores foram preditivos de diferenças no tamanho do infarto ^18. Assim, como um sistema de pontuação simples permite uma rápida avaliação semi-quantitativa consistente dos déficits funcionais de acidente vascular cerebral.

A medida da extensão do infarto cerebral é comumente realizada por coloração histológica de dano tecidual utilizando TTC, violeta cresil (Nissl mancha) ou hematoxilina e eosina. Técnicas de ressonância magnética, incluindo a difusão ponderada MRI para visualizar o infarto em momentos iniciais após a oclusão, permitem a determinação de um volume de infarto em cada rato individuais sem a necessidade de colheita de tecidos. Isto é especialmente valioso em estudos destinados a determinar a eficácia de um tratamento neuroprotetor após o AVC; imagem do rato após administração do tratamento MCAO mas antes dá a confiança investigador que todos os animais experimentais e controle experientes cursos semelhantes para começar, reduzindo os efeitos de confusão de variabilidade na indução de acidente vascular cerebral.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture	Doccol Corporation		2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter
Spontaneously hypertensive rats	Charles River Laboratories		290-300 g, male
Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads	Gaymar Industries
Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit	Summit Hill Laboratories
Germinator 500 glass bead sterilizer	CellPoint Scientific
Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor	TSI Inc.