Electroeluting fragmentos de DNA

Resumo

Este procedimento permite a purificação de fragmentos de DNA com alto rendimento.

Resumo

Fragmentos de DNA purificado são utilizados para fins diferentes em Biologia Molecular e eles podem ser preparados por vários procedimentos. A maioria deles requer uma eletroforese anteriores dos fragmentos de DNA a fim de separar a banda de interesse. Então, esta banda é retirado a partir de um gel de agarose ou acrilamida e purificado usando: ligação e eluição de vidro ou sílica partículas, DEAE-celulose membranas, "esmagar e mergulhe método", eletroeluição ou muito frequentemente caros kits de purificação de comerciais. Assim, a seleção de um método vai depender principalmente do que está disponível no laboratório. O procedimento eletroeluição permite purificar DNA muito limpo para ser usado em um grande número de aplicações (seqüenciamento, marcação radioactiva, restrição enzimática, alteração enzimática, etc clonagem). Este procedimento consiste na colocação de banda DNA contendo fatias de agarose ou acrilamida em poços amostra do electroeluter, então corrente aplicação fará com que o fragmento de DNA para deixar a agarose e, portanto, ser preso em uma almofada de sal a ser recuperado mais tarde, por precipitação de etanol.

Protocolo

1. A fim de selecionar fragmentos de DNA de interesse para ser purificado, estes devem ser resolvidos em gel de acrilamida ou agarose gel corado com brometo de etídio por eletroforese usando tampão TBE 0.5X (Tris Borato, EDTA) a 120 volts por 1 hora. Para isso, ~ 700 ng de plasmídeo pProEx-GdMre11S (6000 pb) previamente digerido com HindIII NdeI e foi usado para liberar um fragmento de 900 bp (560 ng de plasmídeo e 84 ng de fragmento).
2. O tanque electroeluter (Figura 1) deve ser preenchido com TBE 0.5X igualmente distribuídos em cada lado do planalto médio, tendo o cuidado de não derramar-lo para o planalto médio.
3. A banda selecionada (ou bandas) é cortada do gel, e colocados em câmara de amostra o mais próximo possível ao canal V (uma fatia por poço). Tampão de corrida deve ser adicionado a cada câmara, apenas o suficiente para cobrir a fatia de gel.
4. Cada canal V usada deve ser lavada com uma pipeta Pasteur para eliminar qualquer bolha de ar aprisionado.
5. Em seguida, 100 ul de 10 M NH ₄ acetato (para facilitar a visualização de uma pequena quantidade de azul de bromofenol é adicionado, apenas o suficiente para colorir) são delicadamente adicionada dentro do canal V.
6. A tampa deve ser fechado com cuidado para evitar qualquer ressuspensão da almofada de sal.
7. Eletroeluição é iniciada a 100 volts por 25 minutos.
8. Quando estiver concluído electrolution, 400 ul são removidos do V-channel, e colocado em um tubo de microcentrífuga para ser precipitado com 2 volumes de etanol frio e glicogênio (recomendado para melhorar a recuperação do DNA) a 4 ° C por 1 hora ou durante a noite.
9. Centrifugar por 20 minutos, remova o sobrenadante e lavar com etanol 70%.
10. Tubo seco e quantificar DNA na OD 260 nm.
11. A recuperação obtida foi de 75% (63 ng recuperado quando 84 ng foram colocados no V-channel).

Figura 1. Diagrama Electroeluter. Anod um cátodo são indicados em cada lado do tanque de DNA, contido no gel cortado (ilustrado como um quadrado preto) vai migrar para o catodo, devido à sua carga negativa. Então ele vai ser preso na almofada de sal (representado como um triângulo invertido preto) localizado no V-canal.

Discussão

A duração da corrida vai depender muito do tamanho dos fragmentos, normalmente por fragmentos até 20 kb 50 minutos a 1 hora é suficiente, enquanto que para pequenos fragmentos de luz UV monitoramento a cada 10 minutos é necessário para evitar que o fragmento de passar pelo almofada de sal e, conseqüentemente, para a câmara de tampão anódica diminuindo recuperação. É importante certificar-se que quando você definir a fonte de alimentação de 100 volts, há uma mAmp atual, pelo menos, de 10. A banda DNA pode ser monitorado usando uma lâmpada UV-mão e detectar quando este abandona a fatia de gel. O sal almofada também pode ser feita com 3 M acetato de sódio.

Este procedimento permite a purificação do DNA ou RNA fragmentos de tamanhos diferentes, com boa recuperação (~ 80%) a ser marcado radioactivamente, digeridos por enzimas de restrição, processado por enzimas modificando, etc

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NdeI	New England Biolabs	R0111L
HindIII	New England Biolabs	R0104L
NH4 acetate	JT Baker	0596
agarose	Invitrogen	15510-027
Biophotometer	Eppendorf	6131 000 020
Electr–luter	IBI	UEA CAT 46000