Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

Resumo

Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para o vírus da dengue, deve ser avaliado para o seu papel na prevenção de infecções virais dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão das infecções por dengue de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas para crescer o vírus em cultura, alimentando-se membrana de sangue os mosquitos humanos e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.

Resumo

O objetivo deste procedimento é para infectar o mosquito Aedes com o vírus da dengue em uma condição de laboratório e examinar o nível de infecção e dinâmica do vírus nos tecidos do mosquito. Este protocolo é utilizado rotineiramente para o estudo de interações mosquito-vírus, especialmente para a identificação de novos fatores de host que são capazes de determinar a competência vetorial. Todo o experimento deve ser realizado em um laboratório BSL2. Semelhantes às infecções Plasmodium falciparum, traje apropriado, incluindo luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. Após o experimento, todos os materiais que entraram em contato com o vírus precisam ser tratados com etanol 75% e branqueadas antes de prosseguir com a lavagem normal. Todos os outros materiais devem ser autoclavados antes de descartá-los.

Protocolo

A. Propagar vírus na linhagem de células C6/36.

1. Células crescem a 80% confluência em 75 frasco cm ^2;
2. Remova a mídia com 3-4 ml que fica no frasco;
3. Tomar 0,5 ml do vírus estoque e adicionar na célula acima, com a multiplicidade de infecção de 1,5 partículas de vírus por célula. Agitar o frasco durante 15 minutos lentamente na temperatura ambiente.
4. Incubar por 45 minutos em 5% CO ₂ e 37 ° C
5. Adicionar 30 ml de mídia, e incubar por 5 dias.

B. Prepare a mistura de vírus e de sangue

1. Retire a célula com o raspador e transferir o celular e mídia para os 50 mL tubos cônicos;
2. Centrifugado a 800g por 10 minutos; coletar o sobrenadante, mas deixar 1ml do sobrenadante com o pellet celular;
3. Congelar o pellet celular acima das emissões de CO ₂ e, em seguida, secar descongelar em banho-maria 37 ° C, repita duas a três vezes;
4. Centrifugado a 800g por 10 minutos, retirar o sobrenadante, e combinam com o sobrenadante do passo 3;
5. Coletar sangue humano total com o mesmo procedimento (passo 3) para a preparação da cultura gametócitos para infectar mosquitos Anopheles com Plasmodium falciparum;
6. Combinar a quantidade igual de todo o sangue acima do humano com o vírus sobrenadante do passo 4, e adicionar soro humano (10% do volume total).
7. Incubar a mistura acima de sangue humano e vírus da dengue durante 30 minutos a 37 ° C banho de água

Alimentação mosquitos C.

Este procedimento é quase idêntico ao que foi descrito na seção de infecções Plasmodium falciparum em mosquitos. Nós ensaio a infecção do intestino médio no dia 7, ea infecção salivar em 14 dias após a sangue-feeding. Todo o material que entrou em contato com o vírus são tratados pela primeira vez com etanol 75% e depois com lixívia a 10%.

D. Ensaio o título do vírus no tecido mosquito

1. Dois ou três dias antes da dissecação de tecido mosquito, crescer C6/36 célula em uma placa de 24 poços de tal forma que a célula de chegar a 80% confluência no dia em que o ensaio é realizado;
2. Os mosquitos são anestesiados a 4 ° C, sacrificados e surgiu estéril, mergulhando-os em etanol 75% por 1 minuto. Em seguida, os mosquitos foram lavados com água estéril duas vezes antes de dissecção da glândula salivar do intestino médio ou sob o microscópio de dissecação. A partir deste passo, todo o procedimento a seguir deve ser conduzido em um ambiente estéril, como uma cabine de segurança biológica. Estes tecidos são transferidos para um tubo contendo 150 mL de mídia e homogeneizados com uma pelota Kontes pilão do motor por 90 segundos;
3. Fazer uma diluição de 1:100, adicionando 10 ml do homogenato em media 990 mL;
4. Fazer mais um: 10, 1:100 e 1:1000 de diluição com o meio na placa de 96 poços;
5. Remova a mídia na placa de 24 poços, e adicione 100 ml de cada uma das diluições acima de quatro em cada cavidade correspondente;
6. Agite a placa lentamente por 15 minutos na temperatura ambiente, em seguida, incubar por 45 minutos em 5% CO ₂ e 37 ° C;
7. Adicionar 1 ml de Metilcelulosa overlay (1%) a cada poço;
8. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 5 dias;
9. Os passos a partir daqui não requerem um ambiente estéril, mas como com qualquer outro cuidado deve ser tomado patógeno em todos os momentos. Descartar overlay Metilcelulosa de cada prato e blot para remover excesso de mídia
10. Adicionar 1 ml de metanol / acetona fixador (1:1) a cada poço. Manter a 4 ° C por 1 h;
11. Deitar fora o fixador, e lave uma vez com 1X PBS;
12. Faça 1:1000 diluição para o anticorpo primário contra o vírus com Blotto 5%;
13. Adicionar 200 mL de líquido hiperimune diluído a cada C bem, incubar a 37 ° para 1 hora;
14. Remover o líquido hiperimune e placa de lavagem com PBS 1 X
15. Prepare uma diluição 1:1000 do conjugado de cabra anti-rato (KPL Cat # 074-1806) em 5% dopada (5g de leite em pó desnatado em 100 ml de PBS 1 X), e depois adicionar 200 mL em cada poço e incubar a 37 ° C por 1 h;
16. Prepare substrato da seguinte forma: adicionar 1 comprimido de 3'-diaminobenzidina terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) em 20 ml de PBS 1 X, depois de dissolvido, e então adicionar 8 mL de peróxido de hidrogênio 30%
17. Adicionar 200 mL do substrato acima para cada poço. Deixe descansar em temperatura ambiente por 10 minutos
18. Remover substrato e parar a reação pela adição de 1ml de água destilada para cada poço
19. Despeje em pratos de água e secar para secar
20. Contar a partícula do vírus

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma-Aldrich	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito