Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

Resumo

O verme nematóide intensamente estudada Caenorhabditis elegans Pode ser transgenicamente projetadas para expressar o peptídeo β-amilóide humana (Aâ). Expressão induzida de Aâ em C. elegans leva a uma rápida paralisia fenótipo, reproduzível que pode ser usado para monitorar tratamentos que modulam a toxicidade Aâ.

Resumo

Acúmulo do peptídeo β-amilóide (Aâ) é acreditado geralmente para ser central para a indução da doença de Alzheimer, mas o mecanismo relevante (s) de toxicidade ainda não estão claros. Aâ também é depositado por via intramuscular em Miosite Inclusão Corpo, uma miopatia severa humana. A intensamente estudada nemátodo Caenorhabditis elegans worm pode ser projetado para expressar transgenicamente Aâ humana. Dependendo do tecido ou o momento de expressão Aâ, worms transgênicos podem ter fenótipos facilmente mensuráveis, que servem como uma leitura de toxicidade Aâ. Por exemplo, worms transgênicos com pan-neuronal expressão Aâ têm defeitos é aprendizagem associativa (Dosanjh et al 2009.), Enquanto worms transgênicos com constitutiva músculo-específicos expressão mostram uma progressiva, dependente da idade fenótipo paralisia (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Um C. particularmente útil elegans modelo emprega uma mutação sensível à temperatura no sistema de vigilância mRNA para engenheiro de temperatura induzida por expressão de um transgene muscular Aâ, resultando em um fenótipo paralisia reprodutíveis sobre upshift temperatura (Link et al. 2003). Tratamentos que a toxicidade Aâ contra neste modelo [por exemplo, a expressão de um transgene de proteção (Hassan et al. 2009) ou exposição a extratos de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproducibly alterar a taxa de paralisia induzida por upshift temperatura desses transgênicos worms. Aqui nós descrevemos nosso protocolo para medir a taxa de paralisia neste C. transgênicos elegans modelo, com particular atenção às variáveis ​​experimentais que podem influenciar esta medida.

Protocolo

1) Preparar os Suportes Nematóides placas de crescimento para ensaio de paralisia.

Os ensaios são realizados paralisia no padrão Nematóides Crescimento Media (NGM) placas de rotina usado em C. elegans propagação e genética (Stiernagle, 2006).

1. Autoclave a solução NGM contendo NaCl, Agar e peptona em um Erlenmeyer e adicionar as quantidades apropriadas de CaCl ₂ estéril, Uracila, Colesterol, MgSO ₄ e 1M 1M KPO _4. Alíquota de 10 mL de líquidos NGM em cada 60 mm x 15 mm placa de Petri. Permitir NGM para solidificar durante a noite a temperatura ambiente.
2. Se o teste para os efeitos de compostos / extratos, alíquota do extrato para cada placa e usar um difusor para distribuir uniformemente o extrato sobre a superfície do prato. Permitem extrair a secar durante a noite à temperatura ambiente. Volumes superiores a 1 mL vai exigir mais tempo para secar.
3. Ponto cada placa com 250 mL de E. coli OP5O cepa cultivadas em LB de mídia durante a noite para uma densidade óptica de 0,4-0,6. Permitir que as bactérias para secar durante a noite a temperatura ambiente.

Variáveis ​​relevantes

A idade de chapas tem um efeito significativo sobre o ensaio de paralisia, como placas mais velhas tendem a secar. Use placas derramado dentro de uma semana de ensaio de paralisia. Para resultados ideais, despeje placas 3-4 dias antes do início das populações verme síncrona [ver (2) abaixo]. Para qualquer experimento, apenas utilizar placas derramado a partir do mesmo lote.

Alterando o tamanho do gramado (ou seja, manchado vs spread) e / ou o tipo de bactéria também vai alterar o comportamento dos vermes. Ensaios de paralisia pode ser realizada usando alternativa E. coli como fonte de alimento (por exemplo, a cepa HT115 utilizados na alimentação de experimentos RNAi), mas isso pode mudar a cinética de paralisia, exigindo controles internos adequados.

2) Preparação das Populações Idade-síncrona Worm

Strain CL4176 (smg-1 (cc546 ^ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aâ minigene + rol-6 gene marcador (su1006)] X é mais comumente usado para a dosagem Aâ induzida paralisia Esta estirpe e outros modelos transgênicos estão disponíveis. para pesquisadores acadêmicos para uma taxa nominal do Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Para maximizar a sincronia etária da população teste é preferível começar com uma geração sincronizado dos pais. Uma semana antes do início do ensaio paralisia da população teste, use um seletor de vermes de platina para transferir 20-30 adultos gravid para várias placas de 10 centímetros NGM espalhar com OP50 para um ovo de duas horas estava em 16 ° C (a temperatura permissivo para CL4176 ). Remove os adultos gravid e permitir que a progênie de crescer por 7 dias, época em que eles serão "segundo dia" adultos gravídico.
2. (Dia 1) Os adultos segundo dia gravid são usados ​​para preparar as populações em idade síncrona teste. Para cada condição experimental o objetivo é gerar placas triplicado contendo 50-75 idade síncrona worms. Usando um seletor de verme de platina, a transferência do dia 12/10 2 adultos gravid em 60 mm (10 mL de volume) placas NGM manchado com OP50. Permitirá que as minhocas para botar ovos a 16 ° C por 2 horas, em seguida, apanhar os adultos e permitir que os ovos para chocar e fazer crescer a 16 ° C. Neste ponto, é melhor ter alguém que não será marcar as placas para codificá-las, de modo que o artilheiro será cego às condições experimentais.

Variáveis ​​relevantes

O estágio de desenvolvimento embrionário, quando os ovos são colocados (~ o ​​estágio de 26 células para vermes tipo selvagem em condições ideais) é uma função da idade adulta e nutrição. Se os adultos gravid usado para a preparação da população de teste são mais velhas ou fome, ovos fase posterior serão estabelecidas, reduzindo a sincronia etária da população e da reprodutibilidade da cinética de paralisia. É essencial que mono-axênicas (ou seja, somente OP50 bactérias) culturas são utilizados (contaminantes microbianos podem afetar gravemente neste ensaio), e reprodutibilidade é maior se as placas têm triplicado número semelhante de worms.

3) Indução Transgene e Ensaio Paralisia

1. (Dia 3) placas upshift a 25 ° C 48 horas após o término do ovo síncrona leigos; worms devem estar no terceiro estágio larval (L3). As placas devem ser organizados, sem empilhamento de uma incubadora de 25 ° C para permitir que todas as placas para chegar a 25 ° C, ao mesmo tempo.
2. (Dia 4) Comece a marcar a paralisação de worms (linhagem CL4176) entre 18-20 horas após o início da troca de marcha. Neste ponto, todos os worms na população deve ter alcançado o quarto larval (L4) palco. Continuar a marcar em duas horas até que todos os incrementos de worms em cada uma das placas estão paralisados. Por razões desconhecidas, a paralisia não é nem mesmo todo o comprimento do corpo: a região da cabeça é a última parte do worm para cessar em movimento. Assim, wORMs que recentemente iniciou a paralisia não pode traduzir através da placa, mas pode mover a cabeça, abrindo assim as bactérias em torno de seu anterior e deixando um "halo" de bactérias limpo. Estes worms invariavelmente tornam-se completamente paralisado e, portanto, worms com halos são categorizados como paralisado. Alguns worms não terá halos, mas também não mostram movimento espontâneo, que são testados pela insistência com o selecionador de worm. Se um verme prodded não pode sofrer uma propagação de ondas de corpo inteiro em cima prodding, é também classificada como paralisado. Para marcar eficiente, é mais fácil para mover o worms paralisado para um sector sem mácula da placa de modo que não serão involuntariamente recodificados o período de pontuação próxima. (Isso também permite que mis-categorizado worms para demonstrar movimento, permitindo uma correção de pontuação).
3. Para gerar uma curva de paralisia, em cada momento a fração de worms em cada prato que não tenham sido paralisado é convertido em um percentual, ea média percentual "unparalyzed" é plotado contra o tempo desde o início upshift. (A justificativa para traçar desta forma é que a curva resultante é formalmente análogo a uma curva de sobrevivência e, portanto, podem ser analisados ​​usando estatísticas padrão não-paramétricos de sobrevivência.)

Variáveis ​​relevantes

O upshift de vermes myo-3/Aβ transgênicos deve ocorrer antes que eles atinjam o estágio L4 meados de paralisia para ser iniciada, como o mio-3 promotor é developmentally regulamentada, e reduziu significativamente a expressão em L4 tarde ou vermes adultos. Da mesma forma, a expressão deste transgene é bloqueado se tornar worms fome, por isso é essencial que os vermes estão bem alimentados durante o experimento. Nós nunca observamos um verme paralisado para recuperar sob quaisquer condições, e depois de 12-16 horas de troca de marcha, todos os vermes vão paralisar CL4176, mesmo que sejam downshifted a 16 ° C. Na linhagem CL4176, upregulation suficiente de expressão do transgene para causar paralisia pode ocorrer a temperaturas mais baixas (ie, 20-25 ° C), embora o tempo de paralisia será alterado. A taxa de paralisia depende da cepa específica transgénicos utilizados (temos construído com as duas cepas myo-3/Aβ taxas mais rápidas e mais lentas do que CL4176), assim com cepas alternativa a janela de pontuação pode precisar de ser ajustada.

4) Resultados Representante

Mostrado na Figura 1 é um gráfico de uma curva de paralisia por CL4176, ambos não tratada e exposta a 6,27 mM cafeína (concentração final na placa NGM). Este tratamento resulta em um atraso altamente significante na paralisia de aproximadamente 4 horas, o que nós interpretamos como indicativo de supressão de toxicidade Aâ neste modelo. Mostrado na Figura 2 é um experimento independente assaying os efeitos da cafestol, um outro composto encontrado no café. Este enredo é típico para os tratamentos que não têm impacto toxicidade Aâ. Note que em ambos os experimentos cerca de metade dos tratados CL4176 populações estão paralisados ​​às 24 horas, e paralisia é completa por 28 hr. Estes são os prazos típicos para a paralisia do controle CL4176 populações. Desvios significativos deste momento são indicativos de alteração das condições ambientais ou de eliminação espontânea de cópias do transgene. (CL4176 contém uma matriz cromossomicamente integrado transgênica com várias cópias do transgene myo-3/Aβ. Embora esta matriz transgênicos é normalmente bastante estável, a propagação da estirpe a temperaturas> 16 ° C irá selecionar para worms raro que sofreram uma eliminação espontânea de transgenes, resultando em variantes que terão reduzida expressão Aâ e resultados mais lento paralisia.)

Figura 1. Curva de paralisia para a cepa CL4176 worms não tratada ou expostos à cafeína 6,27 mM (Sigma). Os tempos indicados são do início do upshift temperatura. Barras de erro = SEM

Figura 2. Bares curva de paralisia por CL4176 worms expostos a 0,48 mM cafestol (Sigma). Error = SEM

Discussão

O protocolo que temos descrito pode ser efetivamente usado para ensaio dos efeitos de compostos de toxicidade Aâ. Exemplos publicados incluem os efeitos dos constituintes Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) e reserpina (Arya et al. 2009). Compostos que têm sido de proteção contra a toxicidade Aâ em outros sistemas também foram mostrados para ser protetor neste modelo (por exemplo, a memantina, nossos resultados não publicados). Uma lógica importante para o estabelecimento deste modelo é que as ferramentas bem desenvolvidas genética e molecular disponíveis em C. elegans pode ser usado para investigar os mecanismos de toxicidade Aâ. Assim, as mutações efeitos específicos sobre a toxicidade Aâ puderem ser analisadas (por exemplo, o efeito de reduzir insulin-like de sinalização através da introdução de uma daf-2 mutação de perda de função, Florez-McClure et al. 2007), e este modelo também pode ser usado para examinar os efeitos da sobre-expressão transgenes (Fonte et al. 2008). Recentemente, fez uso extensivo desse modelo para examinar os efeitos sobre a toxicidade de uma única substituições de aminoácidos na Aâ (dados não publicados).

O modelo aqui descrito transgênicos ensaios o efeito de expressão Aâ aguda sobre a função das células musculares. No momento de células paralisia muscular e seus sarcômero estão intactos; o fenótipo paralisia não é o resultado de morte celular do músculo. No entanto, após a paralisia (~ 48 hr após upshift inicial) há uma ruptura da integridade muscular e eventual morte dos vermes. Nós não investigamos o efeito a jusante de expressão Aâ ou usado como um marcador de toxicidade.

O modelo de expressão induzível Aâ descrito aqui não é apropriado para a investigação de tratamentos que modulam a β-amilóide formação de per se. Embora vermes transgênicos com forma constitutiva Aâ expressão depósitos de amilóide facilmente detectável (Fay et al 1998;.. Ligação et al 2001), worms transgênicos com a expressão induzível Aâ raramente têm depósitos de amilóide eo fenótipo paralisia aparece independente de amilóide (Drake et al. 2003). Nossos resultados são consistentes com a visão de que a toxicidade aguda de resultados Aâ induzida expressão da acumulação de Aâ oligomérico solúvel, não amilóide.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentes	Quantity/2L	Empresa / Catálogo #	Comentários
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Agar	40g	Sigma-Aldrich / A7002
Peptona	5g	Sigma-Aldrich / P0556
2 O DDH	2L
CaCl 2 1M	2mL		147.02mg/mL em DDH 2 O
Uracil	2mL		2mg/ml em DDH 2 O
Colesterol	2mL		5mg/mL em etanol (não autoclave)
1M MgSO 4	2mL		246.5mg/mL em DDH 2 O
1M KPO 4	50mL		98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL em DDH 2 O, pH
Erlenmeyer		VWR