In vivo Near Infrared fluorescência de imagem intravascular (NIRF) Molecular da placa inflamatória, uma Abordagem Multimodal para imagem da Aterosclerose

Resumo

Detalhamos um novo infravermelho próximo de fluorescência cateter (NIRF) para 2-dimensional imagem intravascular molecular da biologia placa In vivo. O cateter NIRF pode visualizar os principais processos biológicos, tais como inflamação, informando sobre a presença de placa-avid fluorocromos ativável e orientada NIR. O cateter utiliza requisitos clínicos de engenharia e energia e é direcionada para aplicação em artérias coronárias humanas. A pesquisa a seguir descreve uma estratégia de imagem multimodal que utiliza um romance In vivo Cateter intravascular NIRF para a imagem e quantificar placa inflamatória no ateromatosas coelho proteoliticamente ativa inflamado.

Resumo

A resposta vascular a lesão é uma resposta bem orquestrada inflamatório desencadeado pelo acúmulo de macrófagos na parede dos vasos, levando a um acúmulo de lipídios-laden placa intra-luminal, a proliferação de células musculares lisas e estreitamento progressivo da luz do vaso. A formação de tais placas vulneráveis ​​propensos a ruptura subjacente à maioria dos casos de infarto agudo do miocárdio. A cascata molecular e celular inflamatória complexa é orquestrado pelo recrutamento de linfócitos T e macrófagos e seus efeitos parácrinos em células endoteliais e musculares lisas ^1.

A imagem molecular na aterosclerose tem evoluído para uma importante ferramenta clínica e de pesquisa que permite visualização em vivo de inflamação e outros processos biológicos. Diversos exemplos recentes demonstram a capacidade de detectar placas de alto risco nos pacientes e avaliar os efeitos da farmacoterapia na aterosclerose. ⁴ Enquanto uma série de abordagens de imagem molecular (em especial de ressonância magnética e PET) podem aspectos biológicos imagem de grandes vasos como a carótida artérias, existem opções escassas para geração de imagens das artérias coronárias. ² O advento de alta resolução estratégias de imagem óptica, de fluorescência do infravermelho próximo particular (NIRF), juntamente com ativável sondas fluorescentes, têm maior sensibilidade e levou ao desenvolvimento de novas estratégias intravascular para melhorar a imagem biológica de aterosclerose coronária humana.

Infravermelho próximo de fluorescência (NIRF) imagem molecular utiliza luz de excitação com uma largura de banda definida (650-900 nm) como fonte de fótons que, quando entregues a um agente de contraste óptico ou sonda fluorescente, emite fluorescência na janela NIR que pode ser detectado utilizando um filtro de emissão adequadas e uma alta sensibilidade da câmera charge-coupled. Em oposição à luz visível, luz NIR penetra profundamente no tecido, é marcadamente menos atenuada pela absorção de fótons de lipídeos endógenos como a hemoglobina, e água, e permite alta-alvo para background-razões, devido à reduzida autofluorescência na janela NIR. Imagem dentro de "janela" do NIR pode melhorar substancialmente o potencial de imagem em vivo. ^2,5

Cisteína proteases inflamatórios têm sido bem estudada usando sondas ativável NIRF ^10, e desempenham um papel importante na aterogênese. Via degradação da matriz extracelular, proteases de cisteína contribuem de forma importante para a progressão e as complicações da aterosclerose ^8. Em particular, a protease cisteína, catepsina B, é altamente expressa e colocalizes com macrófagos em camundongos experimental, coelho, e ateromatosas humana. ^3,6,7 Além disso, a atividade catepsina B em placas podem ser detectados in vivo utilizando um descrito anteriormente um -D intravascular tecnologia do infravermelho próximo de fluorescência ^6, em conjunto com um agente injetável nanosensor que consiste de uma espinha dorsal do polímero poli-lisina derivatizado com fluorocromos múltiplas NIR (VM110/Prosense750, ex / em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) que resulta na extinção intramolecular forte no início. ¹⁰ Após alvo clivagem enzimática de proteases de cisteína, como catepsina B (conhecido por colocalize com os macrófagos da placa), a fluorocromos distintos, resultando em amplificação substancial do sinal NIRF. Detecção intravascular de NIR sinal de fluorescência pelo romance 2D utilizado cateter intravascular NIRF agora permite alta resolução, geometricamente precisos na detecção in vivo de atividade catepsina B na placa inflamado.

In vivo de imagem molecular da aterosclerose utilizando cateter-baseado 2D NIRF de imagem, em oposição a uma prévia 1 D-abordagem espectroscópicas, ⁶ é um romance e promissora ferramenta que utiliza a atividade protease aumentada em macrófagos ricos em placa para detectar a inflamação vascular ^11,12. O protocolo de pesquisa a seguir descreve o uso de um cateter intravascular NIRF 2-dimensional para a imagem e caracterizar a estrutura da placa utilizando os principais aspectos da biologia placa. É uma plataforma traduzíveis que, quando integradas com as actuais tecnologias de imagem clínica, incluindo angiografia e ultra-som intravascular (IVUS), oferece uma única e nova técnica de imagem molecular multimodal integrado que distingue ateromatosas inflamatórias, e permite a detecção de sinais intravascular NIRF em humanos porte artérias coronárias .

Protocolo

In vivo Modelo Animal: Geração da Aterosclerose Experimental aortoilíaca

1) Linha de Base e Angiografia Denudation Balloon

1. Antes da obtenção de linha de base angiografia e desnudação do balão, uma Nova Zelândia coelho branco é alimentado um colesterol elevado (1%) dieta por uma semana. Este animal é utilizado para a relevância de translação como: 1) os vasos aorto-ilíacas de coelhos são mesmo calibre de artérias coronárias humanas (2,5 3,5 mm) e 2) a hiperlipidemia, o modelo de balão de lesão gera aterosclerose inflamado tendo similares células inflamatórias (macrófagos ) e moléculas (catepsinas) como na aterosclerose humana.
2. Após a alimentação de colesterol, o animal é anestesiado com propofol e cetamina. A one-inch incisão cervical mediana ventral é feita usando usando um tamanho de 15 lâmina de bisturi. Usando técnicas de dissecção romba, os músculos debaixo da fáscia no lado direito da traquéia está exposto. O músculo sternocephalicus esquerdo é separado ao longo de sua junção do tecido conjuntivo, ea artéria carótida comum direita é exposta. A artéria é separado do nervo vago. Loops de sutura proximal e distal são colocados sobre a artéria para permitir a retração e oclusão. A 1 a 2mm chanfrado arteriotomia é feita através das quais a 5 (diâmetro externo 1,67 milímetros) Francês bainha vascular é inserido e heparina (1000μ/mL, ~ 150units/kg) é administrado via intra-arterial da bainha.
3. Corante de contraste (Ultravist) é então injetada (1 a 2 mL) durante um período de 2 segundos para obter um angiograma controle da aorta distal e ambas as artérias ilíacas.
4. As artérias femoral e aorta são, então, ferido por desnudação endotelial. Usando métodos padrão fluoroscopia, um cateter de embolectomia 3FR Fogarty é colocado na artéria femoral distal e inflado com 0,3 a 0,5 cc de contraste (50% contrast/50% salina) ou ar. O cateter é então retirado proximalmente em seu estado inflado uma distância ao longo da ilíaca direita e aorta distal até o take-off da artéria renal. Após a desnudação do balão, a angiografia é repetido para documentar a permeabilidade do vaso. Após a angiografia, todos os cateteres e bainhas são removidos ea artéria carótida proximal direito comum é ligada, o músculo e fáscia são suturada com fio de 4 / 0 absorvível, ea incisão na pele fechada com um 4 / 0 de sutura não absorvível.
5. O animal é então autorizado a recuperar com a administração de um antibiótico de dose (cefazolina, 0,5 gramas IM). Medicamentos para a dor, incluindo 0,01 mg / kg IM de buprenorfina (duas vezes por dia, conforme necessário). Os animais são então continuou sobre o colesterol 1% para 4 semanas desnudação pós-balão. Na semana 5, os animais são a transição para dieta de colesterol 0,3%.

Imagens Multi-modal integrado de coelho ateromatosas

2 Labeling) de proteoliticamente ativa placa inflamado usando nanosensor injetável; angiografia, ultra-som intravascular (IVUS), e in vivo intravascular NIRF imagem do coelho ateroma

1. Oito semanas após a lesão por balão e 24 horas antes da imagem, o coelho é injetado com intravenosa 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) pela veia da orelha.
2. Vinte e quatro horas após a injeção, os animais são anestesiados e acesso arterial é obtida através da artéria carótida comum esquerda (veja o passo 1.2). Intra-arterial de heparina é administrada (150 unidades / kg). Linha de base é obtida como a angiografia acima.
3. Um cateter ultra-som intravascular é carregado em um clínica da artéria coronária 0.014 capaz polegadas e inserido na bainha. Usando orientação fluoroscópica, a ponta do fio radiopaco está posicionado distalmente na artéria ilíaca direita. O cateter ultra-som intravascular é então avançado para a artéria ilíaca proximal usando um padrão de técnica monorail clínico.
4. A retirada de 100 mm é iniciado e as imagens são gravadas. Reconstrução longitudinal da embarcação é obtida e placa luminal é identificado.
5. O cateter NIRF ^11,12 é carregado no fio de 0,014 polegadas (monorail do sistema), eo cateter é cuidadosamente inserido na bainha e cabeça de imagens está posicionado distalmente em artéria ilíaca direita.
6. Múltiplas pullbacks automatizado (1 mm / seg pullback longitudinal, 30 tiros por minuto) são realizadas e os sinais de fluorescência dentro das zonas de aterosclerose são anotados. As imagens são gravadas e posterior processamento, com escala adequada e janelas com o alcance do sinal é alcançado.

Eutanásia 3) e isolamento de ex vivo de tecido aorto-ilíaca

1. A eutanásia é realizada com 1cc de agente de eutanásia (390mg de sódio solução de pentobarbital sódico fenitoína e 50 mg), injeção, intravenosa única.
2. A árvore arterial é perfundido com solução salina 0,9% até a veia cava inferior é claro de sangue. As artérias aorta e ilíaca aterosclerótica são identificadas e dissecadas livre dos tecidos circundantes. Além disso, pequenos pedaços 2 x 2 cm de liver, rins, baço e coração também são obtidos.
3. Ex vivo NIRF imagem com o cateter intravascular imagem NIRF pode ser feito nesta fase. O navio é alongado eo cateter NIRF é re-inserido na aorta proximal até que a cabeça de imagem é posicionada na artéria ilíaca direita ou bifurcação. Múltiplas pullbacks automatizados são realizados como descrito acima (ver 2.6).

4) Ex vivo de fluorescência Reflectância Imaging (FRI) da aorta dissecada e artérias ilíacas

1. Tecidos dissecados é colocado em 10-20 cc de soro fisiológico e transportados para análises sex (Imagem Kodak Estação 4000mm Pro, Carestream Health, Inc.).
2. Vasos aorta, ilíacas são alongadas para aproximar tempo real comprimentos e as imagens são obtidas em vários comprimentos de onda [luz branca, o canal verde fluorescente (ex 495 nm, empregando 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, empregando 670 nm) e Cy7 (ex 650 nm, empregando 760 nm)] canais. Uma série de tempos de exposição são utilizados para cada comprimento de onda (0.1-30s) e imagens adquiridas são exportados como DICOM ou 16 bits TIFF arquivos fora de escala para análises posteriores. Como controles positivos e negativos, os órgãos (fígado, baço, rim e coração) são gravadas em canais similares e tempos de exposição.
3. Áreas de sinal aumentado no canal infravermelho próximo (780nm +) são anotadas nas artérias ateroscleróticas.

5) Incorporação de tecido para análise de corte e imuno-histoquímico

1. Áreas de normal (sem lesão tecidual; artéria ilíaca ou seja, à esquerda) e áreas de placa são identificados e pequenos anéis de 5-10 mm de tecido são incorporados em outubro (Temperatura ideal de corte) de mídia. Blocos são armazenadas a -80 C até o corte.
2. Técnicas padronizadas para análises de corte e imuno-histoquímica são executadas. Hematoxilina e eosina, Ram-11 e catepsina B coloração são executadas.

Análise e Integração de multi-modal Imagens (angiografia, IVUS, NIRF e sex.)

6) Processamento de imagens NIRF e sex.

1. Arquivos DICOM que contém dados de imagem de NIRF e sex (tomadas no canal infravermelho próximo nm 780) pullbacks são processados ​​usando MATLAB e software OsiriX, respectivamente. Janelas adequado para mostrar gama completa de intensidade do sinal é alcançado. Imagens finais são exportados como arquivos TIFF.
2. Os arquivos são importados para o software de processamento de imagem padrão (Keynote pode ser usado). As imagens são alinhadas com base em pontos de referência (ou seja, vértebras na angiografia, bifurcação ilíaca, e da artéria renal). Áreas de navio normal e placa são identificados.
3. Regiões de interesse (ROI) são manualmente traçado (para tecido normal e áreas de placa) e média intensidades de sinal são adquiridos por meio OsiriX e MATLAB, respectivamente, para ambos os sex e imagens NIRF. Para orientar o rastreio adequado, a imagem longitudinal IVUS do navio é usado e identificação da embarcação normal e placa são facilmente identificados.
4. Alvo de fundo (TBR) rácios são calculados para as zonas de placa.

Resultados representativos:

Após a conclusão do protocolo acima, podemos identificar e caracterizar as áreas de atividade aumentada protease catepsina na placa inflamatória dentro da aorta e vasos ilíacos. Injeção de um nanosensor ativável (Prosense/VM110) nos permite identificar a placa proteoliticamente ativo. Estes aparecem como sinal luminoso ou zonas de intenso quando fotografada usando sex no canal infravermelho próximo (750 nm). O pullbacks NIRF se correlacionam com a intensidade de sinal aumentado em sex e alinhamentos com IVUS que permitem o registo de sinais anatômicos NIRF. TBR placa calculados, obtidos a partir de sex e NIRF foram semelhantes (ver Figura 3: média NIRF TBR 4.2, significa sex TBR 2.9). Análise imuno-histoquímica de placa luminosa confirma presença intensa de RAM-11 e atividade catepsina B em áreas de placa (dados não mostrados).

Figura 1. Esquemática de 2D Cateter NIRF Para ampliar o potencial clínico de uma abordagem 1D sensoriamento NIRF ^6, construímos um romance 2-D NIRF cateter para imagens intravascular. ^11,12 cateter A custom-built consiste em uma fibra óptica (125 mícron de diâmetro alojada em tubos de polietileno: 2.9F) que ilumina usando uma fonte de excitação 750 nm laser. Luz laser é emitido em um ângulo de 90 graus em relação ao eixo da fibra. O sistema utiliza dois motores automatizados (rotação e translação) para permitir a imagem grau concomitante 360 ​​e recuo longitudinal para a obtenção de imagens 2D verdade. Imagens usadas com permissão da referência 11.

Figura 2. Esquemático demonstrando a ativação da protease mediada do nanosensor, Prosense/VM110. Imagem usada com permissão da referência 10.

Figura 3. In vivo e ex vivo TBRs placa (alvo de relações de fundo)

Discussão

Inflamado placas de alto risco ou vulneráveis ​​são provavelmente responsáveis ​​para a maioria dos infartos do miocárdio. A identificação das placas, antes da aparecimento dos sintomas tem importantes implicações clínicas tanto na previsão de resultados e orientar a terapia médica. Convencionais coronária arterial modalidades de imagem, como raio-x angiografia geralmente se concentram na caracterização dos estreitamentos luminais ao invés de iluminar os perfis biológicos subjacentes de alto risc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prosense 750	Visen Medical	VM110	500 nmol/kg IV injection
Heparin Sodium	APP Pharmaceuticals	401586D
Cephazolin	NovaPlus	46015683
Lidocaine HCL 2%	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01
Buprenorphine	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10
Ketamine	Hospira Inc.	NDC 0409-2051-05
High Cholesterol Diet 1%	Research Diets	C30293
HIgh Cholesterol Diet 0.3%	Research Diets	C30255