De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Resumo

Em muitas situações biológicas e clínicas, é vantajoso para estudar os processos celulares como eles evoluem no seu microambiente nativa. Aqui, descrevemos a montagem e uso de um microscópio de baixo custo de fibra óptica que pode fornecer imagens em tempo real em cultura de células, estudos em animais e estudos clínicos do paciente.

Resumo

Muitos estudos biológicos e clínicos requerem o estudo longitudinal e análise da morfologia e função com resolução nível celular. Tradicionalmente, experiências múltiplas são executados em paralelo, com amostras individuais retirado do estudo em momentos sequenciais para avaliação por microscopia de luz. Várias técnicas foram desenvolvidas intravital, com confocal, multifotônica, e microscopia segundo harmônico todos demonstrando sua capacidade de ser usado para geração de imagens em ^uma situ. Com estes sistemas, no entanto, a infra-estrutura necessária é complexo e caro, envolvendo sistemas de varredura a laser e complexas fontes de luz. Aqui apresentamos um protocolo para a concepção e montagem de um microendoscope de alta resolução que pode ser construída em um dia utilizando off-the-shelf componentes para EUA em US $ 5.000. A plataforma oferece flexibilidade em termos de resolução de imagem, o campo de visão, operacional e comprimento de onda, e descrevemos como esses parâmetros podem ser facilmente modificados para atender às necessidades específicas do usuário final.

Nós e os outros têm explorado o uso do microendoscope de alta resolução (HRME) em cultura de células in vitro ^2-5, em ⁶ excisadas e tecidos de animais vivos ^2,5, e em tecidos humanos in vivo ^2,7. Usuários relataram o uso de diferentes agentes de contraste fluorescente, incluindo proflavina ^2-4, benzoporfirina derivados anel monoacid A ⁵ (BPD-MA), e fluoroscein ^6,7, os quais têm recebido total, ou aprovação de investigação do FDA para uso em seres humanos. De alta resolução microendoscopy, na forma descrita aqui, pode apelar para uma ampla gama de pesquisadores que trabalham nas ciências básicas e clínicas. A técnica oferece uma abordagem eficaz e econômica que complementa microscopia tradicional bancada, permitindo ao usuário realizar de alta resolução, imagem longitudinal in situ.

Protocolo

1. Assembléia Microendoscope

O microendoscope de alta resolução aqui descritas (figura 1) deve ser considerada como uma configuração de base com diversas variações possíveis na montagem e aplicação. Descrevemos em detalhes aqui uma encarnação da plataforma que é projetado para ser usado com proflavina como um agente de contraste fluorescente. Proflavina nuclear é uma brilhante mancha com pico de absorção e emissão de comprimentos de onda de 445 nm e 515 nm, respectivamente. O uso de agentes de contraste outras exigirá que o usuário selecione excitação, emissão e filtros dicróicos de forma adequada. Vários elementos da microendoscope de alta resolução são genéricos e podem ser obtidos de vários fornecedores. Por exemplo, componentes de posicionamento optomechanical estão disponíveis a partir Thorlabs, Newport, Linos, entre outros. CCD câmeras compactas estão disponíveis em empresas, incluindo Point Grey Research, Prosilica e Retiga; sensibilidade da câmera deve ser escolhido com a consideração do brilho do fluoróforo para ser utilizado, bem como a taxa de quadros desejado. De alta potência diodos emissores de luz (LEDs) podem ser obtidas Luxeon, Cree, e Nichia entre outros. Feixes de fibra óptica estão disponíveis a partir Sumitomo, Fujikura, e Schott. Na seleção de componentes para uma aplicação específica, o usuário deve considerar as relações inerentes envolvidos em microscopia de fluorescência entre a concentração de fluoróforo, fotodegradação, a intensidade da iluminação, a sensibilidade da câmera, ganho e tempo de exposição.

1. Conecte o 6 "varas gaiola para o 1.5" hastes da gaiola, para formar um par de 7,5 "longos bastões. Screw essas varas em uma face da unidade de espelho fold. Parafuso de 0,5" varas na face oposta. Deslize o cubo gaiola para as hastes da gaiola, através dos dois mais baixas através de buracos. Parafuso a 2 "varas para a face lateral do cubo gaiola (Figura 1B).
2. Conectar a câmera a uma placa de gaiola usando um C-mount para adaptador SM1. Fixe a placa na gaiola 0,5 varas "gaiola, lave com o rosto da unidade de espelho fold.
3. Insira o "tubo" lente em um tubo de três lente "longa e segura a lente com um anel de retenção. A distância focal da lente devem ser tais que os núcleos do feixe de fibra ótica são recolhidos por meio de pelo menos dois pixels quando projetadas para a câmera. Gota o filtro de emissão para o tubo em cima do primeiro anel de retenção, e adicionar um outro anel para fixar o filtro no lugar. Observe a convenção orientação filtro indicado pelo fabricante do filtro. Screw o tubo de lente para o lado do gaiola cubo mais próximo à câmera CCD. Note que na figura 1c, esta lente e filtro são mostrados sem o tubo de lente 3 "para maior clareza.
4. Conectar a câmera a um computador e ver a imagem na tela. Dirigir o conjunto da gaiola de um objeto distante e deslize o cubo gaiola ao longo dos trilhos até que uma imagem aparece em foco. Bloquear o cubo gaiola neste local. (Este é um método simples de assegurar que a lente do tubo vai formar uma imagem focada, quando combinado com a lente objetiva corrigido ao infinito).
5. Insira o espelho dicróico para o titular e em 45 ° lugar no cubo gaiola.
6. Parafuso da lente objetiva, através de um RMS para SM1 adaptador de rosca e um tubo de lente ajustável, em face do cubo gaiola em frente à porta da lente do tubo. A z-tradutor pode ser usado no lugar do tubo da lente ajustável para facilitar a focagem. Parafuso de um conector SMA em uma placa de gaiola e montar este nas hastes, aproximadamente à distância de trabalho da lente objetiva.
7. Montar um LED em uma placa de gaiola e deslize para a final do 2 "hastes. Adicionar uma lente para um 0,5" tubo de lente de tal forma que quando esse tubo é parafusado no lado do cubo gaiola, ele irá formar uma imagem do LED que enche a abertura parte de trás da lente objetiva. Esta configuração (Kohler iluminação) irá garantir que a face proximal do feixe de fibra óptica é uniformemente iluminado. Adicionar o filtro de excitação para o tubo de lente de 0,5 "e fixe no lugar com um anel de retenção (figura 1c).
8. Anexar um conector SMA a um feixe de fibra óptica. Parafuso o pacote SMA conectorizada no receptáculo SMA montado nas hastes da gaiola. Direto da extremidade distal do feixe para uma fonte de luz de banda larga (iluminação fluorescente será suficiente) e observar a imagem da face proximal pacote na câmara CCD. Ajustar a posição da lente objetiva apertando dentro ou para fora do cubo gaiola até que a imagem feixe de fibras aparece em foco. Os núcleos individuais devem ser claramente visíveis (Figura 2).

2. Assembléia Lens GRIN

A resolução espacial do microendoscope pode ser aumentado por uma lente de micro ou montagem da lente até a ponta distal do feixe de fibras. Estas lentes estão configurado de modo que em vez de colocar a ponta pacote directamente para o tecido, a dica é fotografada na superfície do tecido com demagnification, aumentando assim a frequência de amostragem espacial imposta pela guid-luzing núcleos do feixe de fibras. O grau de demagnification corresponde ao aumento da resolução espacial, e ao mesmo tempo, a uma diminuição proporcional no campo de visão. Componentes lente gradiente de índice (GRIN) são compatíveis com fibra óptica e estão disponíveis a partir GrinTech, NSG, Schott, entre outros, e pode ser diretamente ligado a ponta distal de um feixe de fibras.

1. Selecione uma lente GRIN com a ampliação desejada e distância de trabalho para sua aplicação. Garantir que o diâmetro da lente excede o do feixe de fibras que você pretende trabalhar. Recomendamos que o feixe de fibras e lente GRIN ser montado em separado de 3 eixos estágios posicionamento manual sob um microscópio de baixa potência ou estereoscópio para um alinhamento preciso antes da colagem.
2. Colocar uma gota de cola óptico (por exemplo Norland adesivo de cura UV) em qualquer lente ou o rosto pacote. Traga os dois componentes em contato usando o posicionadores manual. Expor a interface à luz UV para a dose recomendada pelo fabricante.
3. Para proteger a lente GRIN ea interface ligado, um pequeno pedaço de tubo de alumínio capilar (Small Parts Inc.) pode ser usado para envolver o conjunto. Deslize o tubo sobre a articulação e seguro em lugar com epóxi. Tubulação do calor shrink pode ser usado para terminar a montagem.

3. Imagem Microendoscope

1. Aplicar o agente de contraste para as células ou tecido a ser trabalhada. Com proflavina (0,01% w / v em PBS), in vitro de imagem de células em cultura pode ser realizada através da incubação de curta duração (<1 minuto) e lavagem completa. Imagens de amostras de tecido ex vivo ou in vivo tecidos é a aplicação tópica de possível após a tintura. Absorção de proflavina nestas condições foi encontrado para ser quase instantânea, com imagem possível dentro de alguns segundos e duradoura por vários minutos.
2. Coloque o pacote de fibra óptica em leve contato com a amostra a ser trabalhada. Células quando imagem na cultura ou amostras de tecido ex vivo, recomendamos a montagem da extremidade distal do feixe de fibras em um dispositivo seguro com estágios posicionamento manual em eixos XYZ para a estabilidade durante o exame.

4. Resultados representativos:

Quando montada corretamente, o microendoscope funcionará como um microscópio de epi-fluorescência, retransmitida através de um feixe de fibra ótica coerente. Para resultados de imagem ideal, a atenção deve ser dada para garantir que três condições essenciais são atendidas:

1. A face proximal do feixe de fibras deve ser fotografada para a câmera CCD, sem desfocar, a fim de conseguir a resolução completa do sistema. Figura 2a, b, c mostram uma parte de um feixe de fibras fotografada com foco pobres, defocus leve, e bom foco, respectivamente. A focagem é encontrado ajustando a posição axial da lente objetiva em relação à face pacote.
2. A face proximal do feixe de fibras deve ser uniformemente iluminado sobre seu diâmetro total (campo de visão). Como descrito no texto do protocolo (1,7), isso é conseguido através da configuração do sistema ótico de iluminação para iluminação Kohler. Figura 2d mostra uma imagem adquirida quando uma amostra uniforme fluorescente é iluminada nesta configuração preferida, com 2e Figura demonstrando o resultado correspondente sob iluminação crítica. Neste último caso, a estrutura do LED é fotografada para o rosto feixe de fibras, resultando no aparecimento deste padrão indesejados sobrepostos na estrutura de amostra real.
3. Ambas as faces proximal e distal do feixe de fibras devem ser limpos e livres de arranhões e chips. Figura 2f demonstra a presença de detritos conectado à face pacote, com danos na forma de um pequeno chip em cinco horas no perímetro de fibra. Detritos podem ser removidos do pacote de faces através da limpeza da mesma forma como convencionais ligações de fibras ópticas, com um papel de lente e isopropanol, ou ferramentas padrão de fibra óptica de limpeza. Se uma das extremidades do feixe de fibras está riscado ou quebrado, ou se o pacote de quebra ao longo de seu comprimento, o cara pode ser polida plana pelo manual padrão, ou técnicas de polimento mecânico. Recomendamos 12-15 mM lapping papel para um polonês inicial grosseira, com um polonês final sobre papel 0,5-1,0 mM.

Figura 3a mostra imagens de 1483 células in vitro, seguindo rotulagem com a colocação proflavina e luz do feixe de fibras nuas na amostra. Figura 3b mostra a melhora na resolução espacial e redução no campo de visão fornecida por uma lente GRIN 2.5x ligados à ponta pacote. Filme 1 demonstra na imagem in vivo da almofada de gordura mamária em um modelo de mouse. Aqui, um feixe de fibras com 0,5 mm de diâmetro externo (330 mM campo de visão) foi aprovada através de uma agulha calibre 21 e avançado para o tecido. Células de gordura são claramente visíveis, com o movimento, devido ao ciclo cardíaco aparente nesta aquisição de 15frames por segundo. Figura 3c mostra imagens da mucosa oral em voluntários saudáveis ​​humanos, desta vez usando um pacote maior de fibra com 1,5 mm de diâmetro externo (1,4 mm de campo de visão). Em todos os exemplos mostrados, proflavina foi usado como um agente de contraste nuclear rotulagem fluorescente.

Figura 1. Montagem do microendoscope de alta resolução (HRME). (A) Diagrama esquemático do sistema HRME. (B) Assembleia da estrutura de suporte principal optomechanical. (C) A adição de elementos de óptica, iluminação LED, e uma câmera CCD. (D) Fotografia do sistema HRME, embalados em um "x 8" 10 x 2,5 caixa ".

Figura 2. Configurando o HRME. Exemplos de imagens com o pacote de fibra óptica no (a) foco pobres, (b) perto de bom foco, (c) o foco ideal. Em (d), um alvo uniforme fluorescente na ponta distal do feixe é imaginada sob iluminação Kohler (uniforme). (E) Um objectivo uniforme fluorescente sob iluminação com imagens crítica, com a estrutura aparente fonte sobre o objeto. (F) tecido conjuntivo frouxo e células podem ficar com o rosto feixe de fibras, que também é propensa a danos menores em sua periferia.

Figura 3. Imagens com a HRME. (A) 1483 células in vitro, fotografada com um feixe de fibras nuas (IGN-08/30), após marcação com proflavina 0,01% (w / v). (B) A cultura de células mesmo 1483 como mostrado em (a), fotografada com um feixe de fibras com lente GRIN 2.5x anexado. (C) Imagem da mucosa oral normal humana in vivo, após aplicação tópica de proflavina 0,01% (w / v).

Filme 1. Imagem a almofada de gordura mamária de um rato através da inserção de um feixe de fibras 450 mM diâmetro externo dentro do lúmen de uma agulha calibre 21 passou para o tecido. Proflavina 0,01% (w / v) foi entregue ao site de imagens através da mesma agulha antes da inserção da fibra de imagem. Clique aqui para assistir ao vídeo

Discussão

A alta resolução técnica microendoscopy aqui descrito fornece aos pesquisadores em áreas básicas da pesquisa biomédica e clínica com um método flexível, robusto e de baixo custo para a visualização de detalhes celulares in situ. Nós descrevemos um protocolo para a montagem do sistema de imagem e demonstrou a sua utilização em cultura de células in vitro e em animais e tecidos humanos in vivo. Embora os resultados aqui apresentados imagem usada proflavina como um agente de contraste fluorescente, outros grupos têm demonstrado versões do sistema com comprimentos de onda de iluminação LED e filtros escolhida para coincidir com excitação / emissão de espectros de outros corantes ^5-7.

Resolução e campo de visão são inicialmente determinado pelo espaçamento core-to-core e diâmetro de imagem do feixe de fibra óptica. Temos usado pacotes com aproximadamente 4 mm de espaçamento central-core, e diâmetros de imagem de 330 mM (filme 1), 720 mM (Figura 2, Figura 3a, b), e 1400 mM (Figura 3c). Os feixes menores podem ser passadas através de agulhas bitola estreita e são significativamente mais flexível do que as fibras maiores. Nós e outros ^oito têm, em alguns casos, notou o aparecimento de emissões de autofluorescência da fibra pacote em si. Ao tentar excitar fluoróforos em comprimentos de onda ultravioleta, ou recolher as emissões na faixa vermelha do espectro, a atenção deve ser dada ao nível de autofluorescência de fibra pacote contribuindo para o sinal total medido.

Enquanto a maioria do trabalho microendoscopy alta resolução relatada até o momento, tem utilizado um feixe de fibras nuas, ampliação adicional pode ser fornecida pelo uso de lentes GRIN ligados à ponta distal. Lentes GRIN oferecem uma maneira simples e econômica para aumentar a resolução espacial, embora a sua suscetibilidade a aberrações ópticas e NA limitada é bem reconhecida. Se o desempenho da lente GRIN é inadequado para uma determinada aplicação, GRIN híbrido / objectivos lente esférica ⁹ ou conjuntos de lentes objetivas ^11/10 miniatura podem ser empregadas.

O microendoscope de alta resolução aqui descrito opera essencialmente como um grande campo do microscópio epi-fluorescência, portanto não seccionamento óptico (como em microscopia confocal ou não linear) é de se esperar. Em nossa experiência, utilizando 455 nm e luz de excitação proflavina tópica como agente de contraste, a luz é coletada principalmente a partir de uma profundidade correspondente a algumas camadas de células.

Este protocolo deve permitir que o leitor a montar o microendoscope de alta resolução sobre a bancada, com um tamanho compacto de 10 "x 8". Se desejar, o sistema pode ser colocado em uma caixa e os componentes elétricos (LED e uma câmera) alimentado por uma bateria (Figura 1d). Muitas câmeras compactas pode ser alimentado pelo IEEE-1394 (Firewire) e portas USB do computador host.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)