Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Resumo

Nós apresentamos um método para preparar fatias organotípicas de embriões meados de gestação do rato para a imagem de cultivo e de lapso de tempo de crescimento dos nervos periféricos.

Resumo

Para muitos propósitos, o cultivo de embriões de rato vivo ex como fatias organotípicas é desejável. Por exemplo, nós empregamos uma linha de camundongo transgênico (tauGFP) em que a versão melhorada da proteína verde fluorescente (EGFP) é exclusivamente expressa em todos os neurônios do desenvolvimento do sistema nervoso central e periférico ^1, permitindo a possibilidade de ambos os filmes a inervação o membro anterior e manipular esse processo com as técnicas farmacológicas e genéticas ^2. O parâmetro mais crítico de sucesso no cultivo de culturas fatia tal é o método pelo qual as fatias são preparadas. Após extensos testes de uma variedade de métodos, descobrimos que um vibratome é o dispositivo melhor possível para cortar os embriões de tal forma que eles rotineiramente resultar em uma cultura que demonstra a viabilidade ao longo de um período de vários dias, e mais importante, se desenvolve em uma época forma específica. Para meados de gestação de embriões, o que inclui a consequência normal de nervos espinhais da medula espinhal e os gânglios da raiz dorsal para as suas metas na periferia e na determinação adequada do tecido ósseo e muscular.

Neste trabalho, apresentamos um método para processamento de embriões de todo dia embrionário (E) E10 a E12 em 300-400 fatias micrômetro para o cultivo em um padrão de cultura de tecidos da incubadora, que pode ser estudado por até dois dias após a preparação fatia. Crítico para o sucesso desta abordagem é o uso de um vibratome a fatia cada embrião agarose-embedded. Isto é seguido pelo cultivo das fatias em cima insere cultura Millicell membrana colocada sobre um pequeno volume de meio, resultando em uma técnica de cultura de interface. Uma maca com uma média de 7 embriões rotineiramente produz pelo menos 14 fatias (2-3 fatias da região forelimb por embrião), que varia um pouco devido à idade dos embriões, bem como para a espessura das fatias. Cerca de 80% das fatias cultivadas mostram crescimento do nervo, que pode ser medido longo de todo o período de ² cultura. Resultados representativos usando a linha do mouse tauGFP são demonstradas.

Protocolo

Parte 1: Preparando-se para cortar e cultura.

1. Prepare 10 cm de placas de cultura de tecido com corte médio (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% de soro fetal bovino, a glicose 0,5%, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7.3) e 3 cm de Millicell-CM cultura 0,4 mícrons insere membrana e manter em estufa a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Aqueça 4% baixo ponto de fusão de agarose em PBS no microondas e mantê-lo na placa de aquecimento para que fique em aproximadamente 37 ° C.
3. Preencher 10 cm de pratos bacteriológica Petri com PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mm KH ₂ PO ₄₎ e colocar no gelo.
4. Configurar dispositivo de resfriamento micrótomo ou garantir que bandeja de tampão e de refrigeração elementos são armazenados no freezer para pré-cool-lo.

Parte 2: incorporação de embriões.

1. Dissecar os embriões do útero e examiná-las com um microscópio invertido fluorescente para verificar se há expressão GFP.
2. Embriões lugar em uma invertida de 10 cm Placa de Petri e orientá-los usando tiras de papel Whatman para remover PBS excessiva.
3. Aplicar agarose sobre o embrião para corrigi-lo nesta posição. Deixe agarose solidificar.
4. Limitar a área que circunda o embrião, cortando com uma lâmina de barbear.
5. Gire o embrião incorporado em seu outro lado.
6. Aplicar agarose adicionais sobre tecido embrionário para garantir que o embrião está completamente incorporado.
7. Prepare bloco agarose com bordas limpas e montagem em vibratome chuck usando Loctite 406, uma cola especial semelhante ao "Krazy Glue".

Parte 3: Slicing procedimento.

1. Configure a bandeja de tampão pré-resfriada eo elemento de refrigeração.
2. Insira o chuck com o tecido colado e adicione HBSS 1x (Ca ^{2 +-Mg 2 +} livre HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml de penicilina / estreptomicina) até coberta.
3. Inserir e fixar uma lâmina de micrótomo precleaned (70% etanol).
4. Prepare 350-450 fatias mm e transferi-los usando encurtado pipetas de vidro pasteur em placas de cultura de tecidos conservados no gelo.
5. Usando uma pinça, retire cuidadosamente cada fatia de agarose e transferência para membranas Millicell cultura. Cerca de 4 fatias podem ser cultivadas em uma membrana em uma placa de cultura de 10 cm de tecido preenchido com 6 mL de meio de cultura.
6. Incubar fatias a 37 ° C e 5% CO ₂ (médio Cultura: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% soro fetal bovino, a glicose 0,5%, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7.3). Se um time-lapse realiza série de imagens deve-se manter constante o volume de meio. No caso da série programada de imagem para um curto espaço de tempo é suficiente para deixar o meio como ela é. Para períodos de mudanças mais cultura após 12-20 horas são recomendados.

Parte 4: Imaging conseqüência do nervo espinhal ao microscópio.

1. Nervos espinhais colocar uma imagem de 10 cm placa de cultura de tecidos, contendo membranas cultura Millicell com fatias, sob um microscópio fluorescente na posição vertical.
2. Rótulo a orientação das membranas cultura Millicell no palco microscópio para posicionar corretamente durante o próximo ponto de imagem tempo.
3. Imagem conseqüência do nervo espinhal utilizando 4x (abertura numérica [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) ou 20x (NA 0.5) objetivos.

A Figura 1 mostra uma série de imagens retratando o crescimento do nervo espinhal, durante 20 horas de cultura com objectivos de 4x e 10x.

Figura série de imagens de uma conseqüência do nervo espinhal em uma fatia transversal de um embrião tauGPF homozigótica. * = Neurônios motores da medula espinhal ventral, seta = DRG. O dorsal (D)-ventral eixo (V) da fatia é indicado. Scalebars: 200 mM.

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Discussão

Em uma extensa comparação de métodos para preparar culturas fatia embrionárias de embriões meados de gestação mouse (E10 - E12), temos observado que um vibratome produz, sem dúvida, os resultados mais confiáveis ​​no que diz respeito a ambos os viabilidade global das culturas e da reprodutibilidade a conseqüência padrões nervosas. Em contraste, as fatias preparadas usando um helicóptero tecido McIlwain ³ mostrou-se completamente inviável. Nós originalmente empregado um método guilhotina

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS 10x	GIBCO, by Life Technologies	14180
Dissection tools	Fine Science Tools	various
L.M.P. agarose	Invitrogen	15517-022
Whatmann paper	Whatman, GE Healthcare	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, by Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-glutamine 100x	GIBCO, by Life Technologies	25030
Vibratome	Microm International	HM 650 V
Fluorescent microscope	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Millicell-CM inserts	EMD Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Razor blades	Thermo Fisher Scientific, Inc.	none
Dissecting microscope	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
x4 objective	Olympus Corporation	PL series
x10 objective	Olympus Corporation	UPLFL –PH series
Filter	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD camera	Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171