Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Resumo

Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos. Este método compreende mecânico e dissociação enzimática do tecido pulmonar, bem como um processo de purificação passo 2, utilizando anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpos conjugados com esferas magnéticas, que produz uma população de células endoteliais pura de origem principalmente microvascular.

Resumo

Células endoteliais fornecer um modelo de pesquisa útil em muitas áreas da biologia vascular. Desde o seu primeiro isolamento ^1, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) têm se mostrado conveniente, fácil de obter e cultura, e, portanto, são as células mais amplamente estudada endoteliais. No entanto, para a pesquisa focada em processos como os outros permeabilidade a angiogênese, ou muitos, células endoteliais microvasculares (ECs) são um modelo muito mais fisiologicamente relevante para o estudo ^2. Além disso, a ECS isolados de camundongos knockout fornecer uma ferramenta útil para a análise de proteínas ex vivo função. Várias abordagens para isolar e microvascular cultura CEPs de origem diferentes foram relatados até agora ^3-7, mas o isolamento consistente e cultura de pura CEPs ainda é um grande problema técnico em muitos laboratórios. Aqui, nós fornecemos um protocolo passo a passo sobre um método confiável e relativamente simples de isolar e cultivar células endoteliais pulmonares do rato (MLECs). Nesta abordagem, o tecido pulmonar obtido a partir de 6 - a 8 dias de idade os filhotes é o primeiro corte em pedaços, digeridos com colagenase / dispase (C / D) de soluções e dispersas mecanicamente em uma única célula de suspensão. MLECS são purificados a partir de suspensão celular usando a seleção positiva com anti-PECAM-1 anticorpo conjugado a Dynabeads usando um concentrador de Partícula Magnética (MPC). Tais células purificadas são cultivadas em gelatina revestidos de cultura de tecidos (CT) pratos até que eles se tornam confluentes. Nesse ponto, as células são mais purificado utilizando Dynabeads acoplado a anti-ICAM-2 de anticorpos. MLECs obtidas com este protocolo exibem um fenótipo de paralelepípedos, como visualizado por contraste de fase microscopia de luz, e seu fenótipo endotelial foi confirmada através da análise FACS com anti-VE-caderina ⁸ e anti-VEGFR2 ⁹ anticorpos e coloração de imunofluorescência de VE caderina. Em nossas mãos, este procedimento de isolamento de duas etapas de forma consistente e confiável rende uma população pura de MLECs, que pode ser mais culta. Este método vai permitir aos investigadores para aproveitar o crescente número de knockout e camundongos transgênicos para correlacionar diretamente os estudos in vivo com os resultados de experimentos in vitro realizados em MLECs isolados e, assim, ajudar a revelar os mecanismos moleculares dos fenótipos vasculares observados in vivo.

Protocolo

1. Preparando-se anti-PECAM-1 anticorpo-conjugado esferas magnéticas (Dynabeads)

1. Prepare BSA 0,1% em PBS misturando 50 mg BSA em 50 ml de PBS usando um vortex até BSA dissolve. Esterilizar por filtração através de filtro de seringa de 0,22 mM. Armazenar a 4 ° C.
2. Na capa TC, a transferência de 200 mL de bem ressuspenso ovelhas Dynabeads anti-IgG de rato em um tubo Eppendorf 1,5 ml e lavar as contas: em tubo de Monte MPC e deixe descansar por cerca de 1 min para permitir que as contas de sedimentos. Aspirar o sobrenadante, remova o tubo do MPC e ressuspender as contas em 1 ml de estéril 0,1% BSA / PBS. Pipeta cima e para baixo para voltar a suspender contas.
3. Repita lavar mais três vezes, para um total de quatro lavagens.
4. Retire o tubo do MPC e ressuspender as contas em 500 mL de 0,1% BSA / PBS.
5. Adicionar 10 ml de rato anti-rato PECAM-1 anticorpos (CD-31) para o tubo.
6. Tombo durante a noite a 4 ° C na sala de frio ou 2 horas em temperatura ambiente.
7. Lave as contas com estéril 0,1% BSA / PBS, conforme descrito no passo 1,2 quatro vezes.
8. Retire o tubo do MPC e ressuspender as contas em 200 mL de 0,1% BSA / PBS. Loja anti-PECAM-1 anticorpo-conjugado Dynabeads a 4 ° C por até 1 mês.

2. Isolar do mouse em células endoteliais pulmonares de camundongos neonatal

Antes de prosseguir com o protocolo de purificação de tecido, IACUC aprovação do Comitê do procedimento é necessário.

1. Prepare o seguinte:
   • 15 ml de 1 mg / ml solução C / D em DMEM. Filtro com 0,22 mM filtro de seringa e quente a 37 ° C.
   • 50 ml com tubo de 15 ml DMEM, armazenar no gelo
   • Isolamento Media (IM), contendo 20% FBS e 1x penicilina / estreptomicina, em DMEM
   • 2% de gelatina. Mix 2 g de pele bovina de gelatina com 100 ml de água dd, 15 autoclave minutos e armazenar a 4 ° C. Quente a 37 ° C para liquefazer antes de frascos de revestimento TC.
2. Anestesiar três filhotes de 6-8 dia de idade usando uma injeção IP de ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Verificar a eficácia da anestesia e dissecar animais, um por um, como segue: filhotes Pin para embarcar, embeber a pele com álcool 70% e remover a pele da área do peito com uma tesoura de dissecção estéril. Gaiola do consumo de costela para expor os pulmões.
3. Assepticamente consumo lobos pulmonares individual, não tendo o cuidado de dissecar os brônquios e qualquer tecido conjuntivo visível em torno dos pulmões. Combine todos os pulmões em gelada DMEM. Euthanize os filhotes.
4. Trabalhando na capa TC, remova lobos pulmonares de DMEM, coloque em um prato de 100 milímetros TC e aspire DMEM excesso.
5. Com uma tesoura estéril, o tecido finamente picada cortando ~ 100 vezes. Transferência para 15 ml de solução C / D quentes para a digestão enzimática. Incubar 45 minutos a 37 ° C em um rotador.
6. Na capa TC, aspirar a suspensão tecido digerido em uma seringa de 20 ml com 14 g clumps cânula anexado e triturar em uma suspensão de células individuais, pelo menos 12 vezes.
7. Passe a suspensão do tecido através de um filtro de células 70 mm e lavar o filtro com 15 ml IM para parar a digestão.
8. Pellet suspensão de células por centrifugação a 400x g por 5 minutos.
9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender sedimento em 3 ml de 0,1% BSA / PBS.
10. Transferência de suspensão de células a 5 tubos de poliestireno ml de fundo redondo e adicionar 22,5 mL anti-PECAM-1 anticorpo-conjugado Dynabeads. Tombo em temperatura ambiente por 12 minutos.
11. Casaco um frasco T75 com 2 mL de 2% de gelatina e aspirado de excesso de gelatina. Permitir que a gelatina para secar dentro do capô TC por cerca de 30 minutos antes de as células de revestimento.
12. Após a incubação talão é completo (passo 2.10), divididos igualmente suspensão de células em três tubos de Eppendorf e montar no MPC.
13. Quando as contas tiverem sedimentado usando o MPC (~ min 1), recolher o sobrenadante, remova o tubo do MPC, lave contas com ~ 1 ml de 0,1% BSA / PBS e remontar no MPC.
14. Repita quatro vezes lavagem (total 5 lavagens)
15. Contas ressuspender em 1 ml de VascuLife com engs Mv-Vida e penicilina Fatores Kit 1x / estreptomicina (VL) por tubo, misturando bem.
16. Placa em um pré-revestido T75 frasco e trazer volume total em cada frasco de 10 ml com VL.
17. Mudança de mídia no dia seguinte, permita que um dia cheio de crescimento, e depois mudar metade dos media em dias alternados. Quando as células são> 70-80% confluentes ou mais (geralmente após 3-4 dias de cultura), eles podem ser classificados com anti-ICAM-2 Dynabeads.

3. Preparando-se anti-ICAM-2-anticorpo conjugado Dynabeads

1. Dynabeads anti-ICAM-2-anticorpo conjugado são usados ​​para purificar as células que foram selecionados com anti-PECAM-1 anticorpo-conjugado Dynabeads e cultivadas até confluentes. Este procedimento é realizado conforme descrito para Dynabeads anti-PECAM-1 anticorpo-conjugado (1, acima), exceto que anti-mouse ICAM-2 (CD-102) anticorpo é usado em vez de anti-PECAM-1 anticorpos.
2. Dynabeads anti-ICAM-2-anticorpo conjugado pode ser armazenado a 4 ° C por atéa 1 mês.

4. Classificação células de camundongo Lung endotelial com anti-ICAM-2 Dynabeads

1. Brasão T75 frasco de cultura de tecido com 2% de gelatina.
2. Aspirar a mídia do frasco T75 confluente com células e lave com 8 ml PBS.
3. Aspirar PBS, adicionar 2 ml de tripsina 0,05% / EDTA e deixe células detach (cerca de 5 minutos). Toque levemente frascos para ajudar destacando.
4. Quando as células têm destacado, adicionar 2 ml IM para inibir células de tripsina e raspar para separar as células restantes aderentes. Transferência de suspensão de células para um tubo de 15 ml e spin down por 5 min a 400x g.
5. Aspirar a mídia e celulares ressuspender sedimento em 2 ml de 0,1% BSA / PBS.
6. Transferir para um tubo de poliestireno 5 ml de fundo redondo e adicionar 10 ml anti-ICAM-2 Dynabeads. Tumble por 12 minutos em temperatura ambiente.
7. Dividido em duas células em suspensão de 1,5 ml tubos Eppendorf e montar no MPC.
8. Aspirar o sobrenadante após a contas tenham aderido por um minuto. Remova os tubos de MPC e ressuspender cada tubo 1 ml em 0,1% BSA / PBS. Remontar na MPC.
9. Repita quatro vezes lavagem (total de 5 lavagens).
10. Ressuspender cada tubo com 1 ml VL e realizar uma contagem de células.
11. Células em placas a 250-350K células por frasco T25 e / ou 750K-1 milhão de células por frasco T75.
12. Traga o volume para 5 ml em T25 VL frascos, e 10 ml em frascos T75.
13. Mudança de mídia todos os dias. Células podem ser usadas para experimentos em que a cultura atinge cerca de 80% confluência, geralmente em 2-3 dias.

5. Resultados representante

Normalmente, após 6-7 dias desde o preparo inicial das células, somos capazes de obter cerca de 1,2-1,5 x 10 ⁶ células endoteliais pulmonares de três filhotes de 6-8 dias de idade. Células normais de exposição "paralelepípedos" morfologia em microscopia de luz e mostrar VE-caderina (CD144) coloração em junções célula-célula, que é característica de células endoteliais (Figura 1). Maioria dos MLECs expressar VE-caderina e VEGFR2 como demonstrado por FACS análise (Figura 2). Geralmente, nós usá-los para experimentos dentro de duas semanas após o isolamento MLEC inicial.

Figura 1. Análise microscópica de monocamada MLEC confluentes. (A) imagem de microscopia de luz mostra a morfologia das células em cultura de paralelepípedos típico de células endoteliais. Uniforme estruturas redondas localizada na área perinuclear das células são muitas as esferas magnéticas utilizado para o isolamento MLEC. (B) endotelial específico VE caderina-se localizada nas junções célula-célula, como mostrado por microscopia confocal. Bar é representante da 20Hm.

Figura 2 FACS análise de MLECs cultivadas marcado com anticorpos específicos para marcadores endoteliais específicos:. VE-caderina (CD144) ou VEGFR2, como indiciado, seguido por ficoeritrina conjugada anticorpo secundário, confirma a identidade de MLECs endoteliais isoladas. Linha vermelha indica isotipo específico de controle, linha verde indica anti-VE caderina-ou anti-VEGFR2 --IgG específicos.

Discussão

Microvascular ECs têm provado ser um modelo útil em muitas áreas da biologia vascular e acredita-se ser mais fisiologicamente relevante para o estudo (angiogênese, por exemplo) do que HUVECs amplamente estudada ^3. Anteriormente, foi relatado que microvascular ECs podem ser obtidas no rim, coração de tecido adiposo, pele, retina, cérebro, gliomas, e também de pulmão ^{2, 4-7, 10, 11.} No entanto, um método consistente e confiável para isolamento de microvascular CEPs ainda é necessária. O procedimento apresentado aqui é uma modificação de um protocolo previamente publicado ^2, que difere da maioria dos procedimentos publicados na medida em que usa filhotes ao invés de animais adultos. Isso é crucial para o sucesso de isolamento, como células de animais jovens têm um maior potencial de proliferação e culturas derivadas de seus tecidos tendem a produzir maior número de células. Uma semana de idade os animais parecem ser o ideal, mas os ratos mais jovens (4 dias de idade) também pode ser usado. Além disso, os números mais altos ou mais baixos de filhotes pode ser usado se for necessário, como temos sido bem sucedidos em isolar MLECs de um filhote de cachorro. No entanto, enquanto scaling cima ou para baixo o processo de isolamento, a densidade de células de revestimento deve permanecer inalterada, já que esta é também crítico para a proliferação celular. O processo de purificação passo 2 de MLECs usando esferas magnéticas conjugadas primeiro a anti-PECAM-1 e do anti-ICAM-2 anticorpos é muito mais eficiente para a obtenção de culturas puras CE que o descrito anteriormente procedimentos única etapa de purificação. Este protocolo elimina a necessidade de usar técnicas manuais muito trabalhoso, a centrifugação de gradiente e FACS menos eficiente de classificação para as células descartando a contaminação, como fibroblastos, células do sangue e células musculares lisas. A população resultando MLEC pode ser usado para análise in vitro de respostas angiogênico, permeabilidade vascular e transmigração de leucócitos, cicatrização de feridas, bem como análise bioquímica de vias de sinalização. Se necessário, pode ser MLECs semeadas em diferentes superfícies, como lamínulas fibronectina ou gelatina revestido de imunofluorescência ou eletrodo matrizes de trans-endotelial resistência (TER) medições. Resultados obtidos podem ser diretamente comparado com os fenótipos observados in vivo, que é especialmente importante no contexto do crescente número de knockout e linhas de ratinhos transgénicos. Implementação bem sucedida deste método para análise in vitro de mecanismos celulares subjacentes defeitos observados in vivo, já foi apresentada ^12.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors	Fine Science Tools	15032-13
forceps	Fine Science Tools	11223-20
14G cannula	Fisher Scientific	1482516N
20 ml syringe	BD Biosciences	309661
BSA	Sigma-Aldrich	A7030-100G
anti-rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110.35
Magnetic Particle Concentrator (MPC)	Invitrogen	123-21D
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31)	BD Biosciences	553369
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102)	BD Biosciences	553326
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche Group	11097113001	100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Bovine Skin Gelatin	Sigma-Aldrich	#G9391-100G
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL)	Lifeline Cell Technology	LL0004
0.05% Trypsin/EDTA	Mediatech, Inc.	25-052-CI
Cell strainer 70 μm nylon	Falcon BD	352350
tissue culture flask 75 cm2	Techno Plastic Products	90076