Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Resumo

Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo espinhal esquelético. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP segmentar do neurônio motor e células do músculo-alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula.

Resumo

Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo da coluna vertebral. Esta é uma conseqüência direta da acessibilidade para os dois tipos de células ea capacidade de distinguir visualmente o CaP única segmentar motor-neurônio com base na morfologia e localização. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP motor-neurônio e células musculares alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula. A identificação do tipo CaP motor-neurônio é confirmado por um ou outro recheio corante ou pelas características biofísicas, como forma de onda do potencial de ação e resistência de entrada da célula. Motor-neurônio gravações rotineiramente durar uma hora permitindo gravações a longo prazo a partir de várias células musculares diferentes alvo. Controle sobre o padrão de disparo dos neurônios motor permite medições da freqüência de dependência da transmissão sináptica na junção neuromuscular. Devido a um tamanho grande quântica eo baixo nível de ruído fornecida pelo clamp toda célula de tensão, todos os eventos unitária podem ser resolvidos no músculo. Este recurso permite estudo de propriedades básicas sináptica, como propriedades de liberação, a reciclagem de vesícula, bem como a depressão sináptica e facilitação. As vantagens oferecidas por este in vivo preparação eclipse anterior modelo de sistemas neuromuscular onde estudou os neurônios motores são geralmente estimuladas por eletrodos extracelulares e os músculos são grandes demais para grampo toda célula patch. A preparação do peixe-zebra é passível de análise eletrofisiológica combinando com uma grande variedade de abordagens, incluindo linhagens transgênicas, knockdown morfolino, intervenção farmacológica e in vivo de imagens. Estas abordagens, juntamente com o crescente número de modelos de doenças neuromusculares fornecidos por linhas mutantes de peixe-zebra, abrir a porta para uma nova compreensão do ser humano doenças neuromusculares.

Protocolo

1. Preparação de peixes para Recordings emparelhados

1. Antes de iniciar o procedimento, preparar cinco soluções-chave, que incluem: Solução de Bath, Bath Solution com tricaina (MS222), Solução Banheira com Formamida, Solução Neuron Interno e Solução Muscle Interna.
2. Em seguida, recolher uma única zebrafish larval entre as idades de 72 a 96 horas e coloque em banho com solução tricaina. Dentro de um minuto de exposição ao anestésico, os peixes não irá responder ao toque.
3. Coloque o peixe em cima de um prato de plástico e, em um estereomicroscópio para decapitar com uma lâmina de duplo fio de navalha.
4. Transfira o peixe para uma câmara de gravação de vidro revestidas com Sylgard e preenchido com solução de Bath. Aperte em cada extremidade, inserindo os pinos de tungstênio eletroliticamente afiada através da notocorda.
5. Criar um retalho de pele perto da extremidade rostral dos peixes com um pino que irá proporcionar uma aderência adequada para um par de fórceps bem. Retire a pele sobrejacente segurando-o perto do pino rostral com um par de fórceps bem. Descasque lentamente na direção caudal para remover a pele.
6. Tratar os peixes com 3 ml de solução Banheira com Formamida por 3-5 minutos para bloquear as contrações musculares que possam interferir com as gravações. Lavar 5 vezes com Solução de Bath normal. Remover parte da camada superficial do músculo mais de 5-6 segmentos suavemente a demolição com o lado de um pino de tungstênio.
7. Transfira o peixe para um microscópio vertical localizado em uma gaiola de Faraday para proteger ruído elétrico. O microscópio é equipado com um palco fixo, longa distância de trabalho objetiva de 40x e zoom de 4x para 0,5. O microscópio é montado em um palco motorizado tradução XY, a fim de mover a preparação entre nervo e músculo sob alta potência. O uso de contraste de interferência diferencial óptica ajuda a visualizar os neurônios.
8. Abaixo de 0,5 x de zoom, use um furo de largura de 15 micron pipeta para remover muscular sobrejacente e expor a medula espinhal. Pressão negativa é aplicada através de uma seringa descartável e cc 3 células musculares são removidos um a um. Este procedimento é repetido para 5-6 segmentos dorsal do músculo esquelético. O mesmo largo furo pipeta é usado também para remover a parte superior duas camadas de músculo ventral para obter músculo alvo rápida do esqueleto.
9. Isso completa a preparação para as gravações emparelhado eo zoom microscópio é aumentada para cerca de 1.6x.

2. Gravações pareadas de CaP Motor-neurônio e células musculares Alvo

1. Os segmentos de limpeza são digitalizados para localizar os neurônios CaP. Cada hemi-segmento da medula espinhal contém uma grande diâmetro micron 10, CaP motor-neurônio. Esta soma teardrop forma está localizado superficialmente sob a dura-máter espinhal perto do final mais caudal do limite segmentar. Um neurônio CaP é escolhido para a gravação e do músculo alvo ventral no segmento adjacente caudal é verificado para verificar a integridade.
2. Dois eletrodos patch são posicionados para a gravação, um para o neurônio e um segundo para o músculo. O eletrodo superior tem uma vela rasa para a penetração da dura espinhal dura e abertura de ponta de cerca de 2 microns. Quanto menor eletrodo tem uma íngreme taper de baixa resistência de gravação braçadeira de tensão do músculo esquelético
3. Posição do eletrodo de neurônio em um ângulo de aproximadamente 30 graus para penetrar na dura espinhal, cerca da metade do segmento rostral à neurônio CaP selecionado. Avançar o eletrodo usando um manipulador disco axial ao aplicar uma pressão contínua suave positivo de aproximadamente 60 milímetros de mercúrio. Como eletrodo rompe a dura-máter, a PAC neurônio pode ser deslocada pela perfusão do eletrodo, exigindo um reajuste de foco.
4. Quando o eletrodo toca o CaP neurônio pressão soma positiva é liberado e, geralmente, resulta na formação imediata de um selo gigaohm. Porém, em alguns casos em que um selo não se forma, torna-se necessário aplicar uma leve pressão negativa. Após a formação selo, o potencial de eletrodo é ajustada para 80mV-e aplicação de pressão negativa rupturas da membrana celular. O neurônio CaP é caracterizada por uma resistência de entrada de 140-180 Mega-ohms e um potencial de ação que ultrapassa 40 milivolts. Este é testada injetando gradativamente aumentando passos despolarizantes em pinça de corrente até que o potencial de ação é eliciada.
5. Em seguida, o microscópio é transferida para o músculo ventral usando o tradutor XY motorizada, sob alta potência. A célula muscular rápido é escolhido a partir do campo de destino.
6. O eletrodo é avançado na direção do músculo na célula muscular alvo sob pressão positiva, que quando liberado, forma um selo gigaohm. O potencial de eletrodo é ajustado a -50 milivolts para inativar os canais de sódio e sob sugar suave a membrana da célula é rompido. A queda na resistência à 100-200 Mega-ohms eo súbito aparecimento dos transientes de entrada capacitiva grandes sinais.
7. Para testarpara a gravação emparelhado, o motor-neurônio é despolarizada por injeções de forma incremental maior de corrente até um potencial de ação é eliciada. Neste ponto, uma placa terminal atual deve ser atingida em músculo. Estimulação continuada do motorneuron a 1 Hertz resultados em correntes de placa terminal sem falhas. Como a frequência de estímulo é aumentada para 100 Hertz as correntes placa terminal flutuar em amplitude e passar pelo esgotamento funcional dentro de 10 segundos de estimulação.

3. Resultados representante

Normalmente, o neurônio é a gravação estável por até uma hora, mas as células musculares se deteriorar conforme refletido como um aumento na resistência série. Quando isso ocorre o experimento é terminado ou outra célula muscular é remendo preso. Todas as gravações devem ser concluídas dentro de uma hora.

Figura 1. Recordings do potencial de ação motorneuron (AP, em cima) e placa terminal muscular associada atual (EPC, baixo). O potencial de ação de um neurônio PAC deve ultrapassar 40 mV eo EPC deve subir a 300 ms e decadência ao longo de um curso de tempo exponencial com uma constante de tempo inferior a 1 ms.

Nome	Receita
Solução de banho (em mM)	134 NaCl, 2,9 KCl, CaCl 2 2,1, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7.8
Solução de banho com tricaina	Solução banho contendo tricaina 0,02%
Solução de banho com Formamida	Solução banho contendo formamida 2M
Neurônio solução interna (em mM)	115 K-gluconato, 15 de KCl, MgCl 2 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2
Solução muscular interna (em mM)	120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4

Tabela 1. Solutions.

Discussão

Temos vindo a utilizar zebrafish gravações emparelhados (Wen e Brehm, 2005), principalmente para estudar os processos de liberação de vesículas e reciclagem durante a estimulação de alta freqüência. Este processo é interrompido em mutantes motilidade em que a transmissão sináptica normal é comprometida devido a mutações pontuais nos principais componentes sináptica. Por exemplo, mutações que perturbam agregados receptor pós-sináptico (Ono et al., 2001, 2002, 2004) e de síntese do transmissor pré-sináptico (Wang et al., 2008) resultar em não-coordenada de natação. Gravações emparelhado fornecer as informações que possam identificar a origem do defeito funcional, que liga comportamento, genética e fisiologia. Agora deve ser possível dissecar ainda mais os processos subjacentes a transmissão sináptica por meio da expressão transitória do CaP motor neurônios utilizando promotores criteriosa. Desta forma dominante genes mutados negativa ou pode ser especificamente expressas nestes neurônios e suas conseqüências comportamentais e eletrofisiológicos determinado. A vantagem adicional oferecida pela configuração da célula permite que toda a diálise da soma CaP com agentes que podem potencialmente alterar a reciclagem das vesículas, como toxinas clostridial e buffers de cálcio. Devido à curta distância entre o soma eo músculo, a difusão deve ocorrer bem dentro do prazo de gravações. O potencial desta preparação só começou a ser aproveitado. A transparência dos peixes neste local idade e superficial de sinapses também facilita a utilização de instrumentos ópticos (Fetcho e O'Malley, 1997; Fetcho e Higashijima, 2004). Temos sido muito bem sucedida na medição de endo e exocitose nos peixes que vivem usando corantes FM e indicadores genéticos, tais como Synaptophluorin (Li et al., 2003). Além disso, as toxinas conjugado fluorescente pode ser usado para rotular proteínas sinápticas para geração de imagens de peixes vivos (Ibanez-Tallon et al., 2004). Dada a simplicidade desta preparação, é uma grande promessa para futuros estudos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pneumatic transducer tester	Fluke Biomedical	DPM1B
0.002 x 3 inch tungsten rod	A-M Systems	715000
Sylgard 184 Elastomer	Dow Corning		The thickness of application will affect the DIC optics