Expansão ex vivo de células tumorais T-reativa por Meios de 1/Ionomycin Bryostatin eo Common Gamma Cadeia Formulação Citocinas

Resumo

Um protocolo eficiente para a Ex vivo Expansão das células tumorais T-reativa a partir de nós tumor de drenagem linfáticos ou outros tecidos linfóides secundários de portadores de tumor hosts é descrito. Este protocolo seletivamente as células do tumor se expande T específicas para uso em imunoterapia adotiva de câncer de mama.

Resumo

Foi relatado que pacientes com câncer de mama têm pré-existentes respostas imunes contra os seus ^1,2 tumores. No entanto, tais respostas imunes não fornecem proteção completa contra o desenvolvimento ou a recorrência de câncer de mama. Para superar esse problema aumentando a freqüência de células tumorais T-reativa, a imunoterapia adotiva tem sido empregado. Uma variedade de protocolos têm sido utilizados para a expansão das células tumorais T específicas. Estes protocolos, no entanto, estão restritos ao uso de antígenos de tumor in vivo ex para a ativação de células T antígeno-específicos. Muito recentemente, citocinas gama comum cadeia, tais como IL-21 IL-2, IL-7, IL-15, e têm sido usados ​​sozinhos ou em combinação para o reforço da anti-tumor respostas imunes ^3. No entanto, não está claro o que a formulação seria melhor trabalhar para a expansão das células tumorais T-reativa. Aqui apresentamos um protocolo para a ativação seletiva e expansão de tumor reativa as células T a partir do modelo de camundongo transgênico FVBN202 de carcinoma de mama HER-2/neu positivo para uso em terapia adotiva de células T de câncer de mama. O protocolo inclui a ativação de células T com bryostatin-1/ionomycin (B / I) e IL-2, na ausência de antígenos tumorais durante 16 horas. B / I imita a ativação de sinais intracelulares que resultam na ativação de células T através do aumento da atividade da proteína quinase C e cálcio intracelular, respectivamente ^4. Este protocolo especificamente ativa as células tumorais T específicas ao matar células T irrelevante. As células B / I-T ativadas são cultivadas com IL-7 e IL-15 por 24 horas e, em seguida, pulsadas com IL-2. Após 24 horas, as células T são lavados, dividir e cultivados com IL-7 + IL-15 por mais 4 dias. Eficácia do tumor especificidade e anti-tumor do ex vivo células T expandida é determinada.

Protocolo

1. Isolamento de linfócitos ⁵

1. Nós isolar tumor de drenagem linfática ou baços de portadores de tumor FVBN202 camundongos transgênicos e preparar a suspensão única célula na gelada RPMI1640 suplementado com 10% de SFB. B / I ativação no resultado de polipropileno de 50 ml cônico tubos em um maior rendimento das células T em comparação com tubos de poliestireno. Quetamina e xilazina são injetados ip para anestesia. Deslocamento cervical é usada como um método de eutanásia.
2. Cultura das células (10 ⁶ células / mL) em meio completo contendo 15% FBS com bryostatin-1 (5 nM) e ionomicina (1 mM), juntamente com 80 U / mL de IL-2 (Peprotech) por 16 h.
3. Lave as células três vezes com meio quente (37 ° C) e cultura em 10 ⁶ células / mL em meio completo com IL-7 (10 ng / mL) e IL-15 (10 ng / mL) (Peprotech) por 24 h .
4. Pulso as células com IL-2 (40 U / mL) por 24 h.
5. Dividir as células e cultura-los com IL-7 e IL-15 (10 ng / mL) durante 4 dias. Alterar médio e dividir as células se necessário a cada 2 dias.

2. Determine Expansão de Células T Fold pela contagem de células e Análise de Citometria de Fluxo ⁵

1. Contagem de células por microscopia de luz
   1. Prepare a diluição célula apropriada (1:100) em azul de tripano e adicione alguns mL em hemocitômetro
   2. Contagem de 9 quadrados e determinar o número total de células contagem de células através da divisão do número de câmaras, multiplicado pelo fator de diluição. Os resultados apresentarão um número x 10 ⁴ células / mL.
2. Determine proporção de CD8 + e células T CD4 + nas células expandidas por citometria de fluxo
   1. Bloco de ligação não específica de anticorpos para receptores Fc através da cultura as células com anticorpos anti-CD16/CD32 (Biolegend) por 20 min em gelo e em seguida, lave as células duas vezes com 2 mL de PBS gelado suplementado com azida de sódio a 1% .
   2. Mancha as células através da cultura com FITC-CD4 e CD8-PE anticorpos por 20 min em gelo e em seguida, lave as células duas vezes com 2 mL de PBS gelado suplementado com 1% FBS e azida sódica a 0,1%.
   3. Fixar as células com paraformaldeído 1% e executar amostras em um Beckman Coulter FC 500 e analisar usando a versão Summit 4,3 software.

3. Determine Tumor especificidade da Vivo ex Expanded Células T

1. Cultura da expandidas ex vivo de linfócitos em meio completo em uma razão de 10:1 com irradiados neu células tumorais positivas MMC (15.000 rad) por 24 h. ⁵
2. Sobrenadantes colher e armazenar a -80 ° C até sua utilização. ^5,6
3. IFN-γ detectar usando um mouse IFN-γ ELISA Set (BD PharMingen) de acordo com protocolo do fabricante. ^5,6

4. Determine Anti-tumor Função do ex Vivo Células expandidas T ^5,6

1. Células T incube com células tumorais em um efetor 10:01: rácios-alvo por 48 horas em meio completo, 3 ml de meio completo (RPMI-1640 suplementado com 100U / mL de penicilina, 100μg / mL estreptomicina, 10% FBS, glutamina e β - mercaptoetanol) e 20U / mL de IL-2 (Peprotech) em 6 placas de cultura de bem 37 CO ° C / 5% _2.
2. Realizar três manchas de cor para anticorpos neu (anti-c-Erb2/c-neu, clone-4, Calbiochem), seguido de IgG anti-rato PE, anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI), de acordo com o protocolo do fabricante (BD PharMingen)
3. Portão em células tumorais neu positiva e analisar a viabilidade (anexina V-/PI-) das células tumorais

5. Modelo do rato do cancro da mama

FVBN202 transgênicos camundongos fêmeas (Charles River Laboratories) pode ser usado para a fonte de células tumorais T-reativa. Estes ratos superexpressam uma unactivated rato neu transgene sob a regulação do promotor MMTV e como resultado o desenvolvimento espontâneo carcinoma mamário entre 40-10 meses de idade ^7. Estes ratos desenvolvem hiperplasia mamária pré-malignas semelhante ao carcinoma ductal in situ (DCIS) antes do desenvolvimento de carcinoma8 espontânea. Espontânea camundongos portadores de tumor são usados ​​como doadores de células T.

6. Resultados representativos:

Ativação de células T com B / I para 16 horas, resulta em morte de células T ingênuo que não estão sensibilizados com o tumor in vivo. Após a seletividade B / I de células tumorais T-reativa que se expandem até 2,8 vezes dentro de uma cultura de 6 dias com as citocinas cadeia gama (Figura 1). Ambos os CD8 + e células T CD4 + são igualmente expandida com as citocinas cadeia gama (Figura 2). O ex-vivo de células T expandida mostrar a capacidade de resposta elevada contra os tumores que ratos doadores foram sensibilizados para, avaliada pela produção de IFN-γ na presença de neu carcinoma mamário positivo do mouse (MMC) de células tumorais (Figura 3). O ex vivo células T expandida pode induzir a apoptose no tumor neu cel positiva MMCls que tal viabilidade das células tumorais cai de 92% para 61% dentro de 48 horas (Figura 4).

Figura 1. Expansão Fold de linfócitos em diferentes momentos seguintes B / I ativação (dia 1) e expansão ex vivo com as citocinas cadeia gama (dias 3, 5 e 7)

Figura 2. Percentual total de CD4 + e CD8 + T antes e depois de uma expansão de 7 dias com a cadeia gama citocinas.

Figura 3. Tumor-IFN-γ estimulada a produção de células T isolados de camundongos portadores de tumor antes e depois de uma expansão de 7 dias com a cadeia gama citocinas, IFN-γ utilizando ELISA

Figura 4. Citotóxicos função da expandidas ex vivo células T com as citocinas cadeia gama contra neu carcinoma mamário positivo do mouse (MMC) de células tumorais

Discussão

Expansão seletiva das células tumorais reativa T com função anti-tumor efetoras pode ser alcançado através do protocolo proposto utilizando B / I ativação e expansão ex vivo com a cadeia gama citocinas IL-2, IL-7 e IL-15. Enquanto IL-2 é um fator de crescimento de células T que podem apoiar a diferenciação e expansão de células T antígeno-específicos, IL-7 pode inibir a apoptose das células T e apoiar a sua viabilidade durante a expansão. IL-15 pode suportar células T de memória que são im...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bryostatin 1	Sigma-Aldrich	B7431-10ug
Ionomycin	Calbiochem	407950
Mouse IL-7	PeproTech Inc	217-17
Mouse IL-15	PeproTech Inc	210-15
Human IL-2	PeproTech Inc	200-02
RPMI1640	Invitrogen	11875
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
L- glutamine	Invitrogen	25030081
β- mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
anti-CD16/32 antibody	Biolegend	101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	556547
FITC-CD4	Biolegend	100406
PE-CD8	Biolegend	100708
anti-c-Erb2/c–Neu	Calbiochem	OP16
PE- anti mouse IgG	Biolegend	405307
formaldehyde	Polysciences, Inc.	04018
Hemocytometer	Hycor	87144
Light microscope	VWR international	V200073
Mouse IFN-γ ELISA set	BD Biosciences	555138
Cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175