Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Resumo

Este protocolo video demonstra o método de ensaio neurosphere para gerar e expandir as células-tronco neurais adultas da região periventricular do mouse, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível.

Resumo

Isolamento e expansão do suposto células-tronco neurais (NSCs) do cérebro adulto murino foi primeiramente descrita por Reynolds e Weiss, em 1992, empregando um sistema de cultura quimicamente definido sem soro conhecido como o ensaio neurosphere (NSA). Neste ensaio, a maioria dos tipos de células diferenciadas morrer dentro de alguns dias de cultura, mas uma pequena população de células precursoras do fator de crescimento sensível sofrem proliferação ativa na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF) e / fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Essas células formam colônias de células indiferenciadas chamada neurospheres, que por sua vez podem ser repicadas para expandir o pool de células-tronco neurais. Além disso, as células podem ser induzidas a se diferenciar, gerando os três principais tipos de células dos neurônios do SNC, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos. Este teste fornece uma ferramenta valiosa para fornecer uma fonte consistente e renováveis ​​de precursores indiferenciados CNS, que poderiam ser usados ​​para estudos in vitro e também para fins terapêuticos.

Este vídeo demonstra o método NSA para gerar e expandir NSCs da região do rato adulto periventricular, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível. O procedimento inclui a colheita do cérebro do rato adulto, micro-dissecção da região periventricular, preparação de tecidos e cultura na NSA. O tecido colhido é o primeiro quimicamente digerida com tripsina-EDTA e, em seguida mecanicamente dissociado em meio NSC para alcançar uma suspensão única célula e, finalmente, banhado na NSA. Após 7-10 dias de cultura, o resultado primário neurospheres estão prontos para a subcultura para alcançar a quantidade de células necessárias para futuros experimentos.

Protocolo

Parte 1: Basic criado antes de prosseguir para dissecção:

1. Volume apropriado de meio NSC completo é preparado pela mistura NeuroCult NSC Basal Medium e Suplementos NeuroCult NSC Proliferação na proporção 9:1, respectivamente. NSC médio também podem ser feitos em laboratório com base na composição do meio de crescimento NSC publicados na literatura ¹. Se o seu laboratório não tem muita experiência em fazer média, é altamente recomendável para uso médio comercialmente disponível que tem sido a qualidade controlada para NSCs crescimento antes de serem vendidos (que é o caso de NeuroCult, Technolgies Stem Cell).
2. O meio é aquecido em banho-maria a 37 ° C.
3. Cold HEPES-buffered meio mínimo essencial (HEM), com alta concentração de antibióticos (10%) está preparado para dissecção e propósito de lavar roupa. Alternativamente, NSC meio basal com a suplementação de antibióticos também pode ser utilizado para esta finalidade.
4. 30-40 ml de HEM frio contendo antibióticos é dispensada em tubos de 50 ml estéril para coleta de cérebro.
5. Vários pratos de plástico Petri 10 centímetros são necessários para manter o cérebro durante a dissecção e um vidro de 10 centímetros estéril placa de Petri para segurar o tecido dissecado.
6. Os instrumentos cirúrgicos necessários para remover o cérebro (tesouras grandes, pequenas tesouras pontudas, pinças grandes, pequenas pinças curvas e uma pequena espátula) ou para dissecção dos tecidos (pequeno fórceps, pinças curvas muito bem, e bisturi) são esterilizadas com conta de vidro esterilizador a 250 ° C ou outros métodos disponíveis autoclave.
7. Microscópio de dissecção é limpa com álcool 70% e configurar dentro do capô PC2.

Parte 2: cérebro de camundongo adulto e colheita micro-dissecção:

1. Adulto 2-4 (5-8 semanas) os ratos são anestesiados de acordo com um protocolo de animais institucional aprovado com 3-4% de isoflurano ou por injeção intra-peritoneal de pentobarbital (120 mg / kg).
2. Deslocamento cervical é realizada para se certificar de que o animal não sofre dor e angústia.
3. O rato anestesiado é colocado sobre seu abdômen em um lenço de papel absorvente, ea cabeça é lavado com etanol 70% para esterilizar a área.
4. Tesouras grandes são usadas para decapitar o animal logo acima da região da medula espinhal cervical.
5. Pequenas tesouras apontou são usados ​​para fazer um corte de caudal-rostral mediana e para expor o crânio.
O corte da pele é usada para segurar a cabeça e, em seguida, cada lâmina de uma tesoura pequena é colocado em cada cavidade orbital para fazer um corte coronal entre as órbitas.
6. Usando o forame magno como ponto de entrada, um corte longitudinal é feita através do crânio ao longo da sutura sagital e dois cortes laterais também são feitos na junção das paredes laterais e na base do crânio. O cuidado deve ser tomado para não danificar o cérebro subjacente, fazendo pequenos cortes e assegurando que o ângulo das pás é tão superficial quanto possível.
7. O crânio que cobre cada hemisfério é agarrado e descascados para fora usando uma pinça curva para expor o cérebro, em seguida, usando uma pequena espátula molhada, o cérebro é escavada em um tubo de 50 ml contendo HEM.
8. Este procedimento é repetido até que todos os cérebros foram colhidas.
9. Os cérebros são transferidos para a capa PC2 e lavadas três vezes com volume suficiente de HEM estéril fria para remover possíveis contaminantes como o sangue e cabelo. Os cérebros são então transferidos para um prato de Petri contendo 10 centímetros HEM.
10. Para dissecar a região periventricular do prosencéfalo, o prato contendo o cérebro é colocado sob o microscópio de dissecação com baixa ampliação. Os cérebros são então posicionados horizontalmente em sua superfície ventral e realizado do lado caudal usando uma pinça fina curva. Outro conjunto de pinças curva é usada para remover os bulbos olfatórios.
11. Após a remoção do bulbo olfatório, os cérebros são girados para expor o aspecto ventral.
12. A 90 ° corte coronal é feita ao nível do quiasma óptico e os aspectos caudal do cérebro são descartados.
13. Este procedimento é repetido até que todos os cérebros são seccionados.
14. Em maior ampliação, os aspectos rostral do cérebro é girada de forma que a superfície de corte faces para cima. Primeiro, o septo é removido e descartado usando uma multa curvas micro-tesoura ou curvas, pinça pontiaguda, e depois a fina camada de tecido em torno da parede lateral dos ventrículos é cortado, excluindo o parênquima estriatal e do corpo caloso. Tecidos dissecados é agrupada em um prato de vidro estéril 10 centímetros Petri.
15. Este procedimento é repetido até que todos os cérebros são micro-dissecados.

Parte 3: preparação de tecidos e células de revestimento:

1. O tecido pooled é picada por cerca de 02/01 minutos, utilizando uma lâmina de bisturi, até que apenas pedaços muito pequenos permanecem.
2. Um volume total de 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA é utilizado e todo o tecido picada é transferido para um tubo de 15 ml. 3 ml de tripsina-EDTA é suficiente para uma boa digestão de tecidos colhidos até 8 camundongos.
3. O tubo é incubado por 7 min em um banho de água 37 ° C.
4. No final da incubação enzimática, o tubo é retornado para a capa e um volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionada para parar a atividade de tripsina.
5. A suspensão é pipetado cima e para baixo para assegurar a inactivação de tripsina e depois peletizada por centrifugação a 700 rpm (110 g) para 5min.
6. O sobrenadante é descartado, e os pedaços de tecido são suspensas em 150 mL de meio estéril basal NSC. Redefinindo a pipeta para 200 mL, os aglomerados são dissociados por pipetagem suavemente para cima e para baixo (3-7 vezes) até que uma suspensão de células lisas única leitosa é obtida. O número de passos pippetting depende diretamente do tamanho das partículas no tecido picada (é melhor mince o tecido em pedaços muito pequenos de modo a aumentar a área de superfície para a atividade de tripsina). Longa e vigorosa dissociação mecânica pode levar à formação de esfera reduzida devido ao tronco neurais e morte de células progenitoras.
7. Para remover escombros e não-dissociada peças, médio NSC basal é adicionado à suspensão de células dissociadas para chegar a um volume total de 10-15ml. A suspensão de células é passada através de um filtro de células 40μm em um tubo de tamanho apropriado, e depois peletizada por centrifugação a 700 rpm (110 g) para 5min.
8. Para mais remover os detritos, é recomendado para ressuspender o sedimento em 10-15 ml de meio de NSC e centrifugar a suspensão de células a 700 rpm (110 g) para 5min.
9. O sobrenadante é descartado. Em seguida, as células são ressuspendidas em volume apropriado de meio NSC completo suplementado com 20ng/mL EGF, bFGF e 10ng/ml 1μl/ml de heparina de 0,2%.
10. Tecido Dissociated de um cérebro é colocado em um frasco T25 (contendo 5 ml de meio completo). As células são então incubados a 37 ° CO C, 5% ₂ Por 7-10 dias pelo qual neurospheres tempo deve ter se formado. Tecidos colhidos de um cérebro geralmente pode gerar 400-600 neurospheres.

Parte 4: Passaging e expansão da NSCs:

1. Quando o neurospheres estão prontos para a subcultura (150-200 m de diâmetro), o meio com esferas de suspensão é removido dos frascos, colocado em um tubo de cultura apropriada estéril tamanho do tecido, e centrifugado a 700 rpm (110 g) por 5 min à temperatura ambiente.
2. O sobrenadante é descartado e as esferas são ressuspendidos em 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Alternativamente, também pode ser neurospheres várias passagens utilizando métodos mecânicos ou químicos dissociação descritos na literatura ^2,3.
3. A suspensão de células é incubada a 37 ° C em banho-maria por 2-3 min, em seguida, um volume igual de inibidor de tripsina de soja é usado para interromper a atividade de tripsina.
4. A suspensão de células é suavemente pipetado cima e para baixo para garantir que a tripsina foi completamente inativada.
5. A suspensão celular é centrifugado a 700 rpm por 5 min. Então, o sobrenadante é removido e as células são ressuspendidas em 1 ml de meio de NSC.
6. 10μl da suspensão de células é misturado com 90μl de azul de tripano para realizar uma contagem de células.
7. As células são banhados em uma concentração de 5x10 ⁴ Células / ml em meio NSC completo suplementado com 20ng/mL EGF, bFGF e 10ng/ml 1μl/ml de heparina 0,2% em um frasco apropriado cultura dimensão do tecido. Uso médio de 5 ml para T25, T75 para 20 ml e 40 ml para frascos T175.
8. Neurospheres secundário são formados em 5-7 dias, quando incubados a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO ₂.

Parte 5: Resultados Representante:

Na principal cultura adulta NSC, a maioria das células morre após 2-3 dias, mas precursor do fator de crescimento de resposta (incluindo células-tronco e progenitoras), as células irão proliferar (Figura 1) e gerar colônias de células indiferenciadas após 6-8 dias. Nessas culturas uma quantidade significativa de detritos está normalmente presente que pode adquirir uma forma esférica, e pode ser confundido com neurospheres. A quantidade de detritos é diretamente dependente da dissecção de micro e técnicas de preparação do tecido. Neurospheres verdadeiros são os fase de claro (luminoso) e tornar-se mais esférico à medida que aumenta de tamanho (ver vídeo). Após 7-10 dias, as esferas devem ser arredondados, mas não compactado, e deve medir entre 150 e 200 mm e também deveriam ter rígida micro-estacas na periferia em grande aumento (Figura 2). Se o neurospheres são permitidos a crescer muito grande, eles se tornam de cor escura, devido à morte celular no centro das esferas. O neurospheres grandes são difíceis de dissociar e eventualmente começar a anexar ao substrato e se diferenciar.

Figura 1. Primária adulto cultura NSC três dias após o plaqueamento. Setas mostram pequenas colónias de NSCs proliferativa. Ampliação original; 20x.

Figura 2. Passagem neurosphere um adulto 7 dias após o plaqueamento. Observe a picos de micro-na periferia da esfera. Ampliação original; 20x.

Discussão

O ensaio neurosphere ² ganhou ampla atenção na comunidade de pesquisa não só para o isolamento e estudo de NSCs do CNS ^05/04, mas também para o isolamento de outros tipos de células-tronco a partir de tecidos putativa numerosos, como os de mama ⁶ e ⁷ e coração para a identificação de câncer de mama, cérebro e células-tronco tumor de cólon ^09/08 sugerindo que este sistema de cultura pode ser aplicado a um número de somáticas e populações precursor t...

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