Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

Resumo

Decelularização perfusão é uma nova técnica para produzir scaffolds fígado inteiro que mantém a composição do órgão matriz extracelular e microarquitetura. Aqui, o método de preparação de andaimes órgão inteiro usando decelularização perfusão e repovoamento posterior com hepatócitos é descrito. Enxertos de fígado para transplante funcional e pode ser gerado usando esta técnica.

Resumo

O fígado é um órgão complexo que requer constante de perfusão para a entrega de nutrientes e oxigênio e remoção de resíduos, a fim de sobreviver ^1. Esforços para recriar ou imitar a microestrutura fígado com motivos de abordagem utilizando a engenharia de tecidos e técnicas de microfabricação não tenham sido bem sucedida até agora devido a este desafio do projeto. Além disso, biomateriais sintéticos usados ​​para criar andaimes para aplicações de engenharia de tecidos do fígado têm sido limitados em induzir a regeneração dos tecidos e reparação, em grande parte devido à falta de motivos de células específicas de ligação que induziria as funções das células adequada ^2. Tecidos decelularizados nativa vasos sanguíneos, tais ³ e ⁴ de pele, por outro lado têm encontrado muitas aplicações na engenharia de tecidos, e forneceram uma solução prática para alguns dos desafios. A vantagem de decelularizado matriz nativa é que ele mantém, até certo ponto, a composição original, a microestrutura e, conseqüentemente aumentando adesão celular ea reorganização ^5.

Neste trabalho, descrever os métodos para realizar a perfusão decelularização do fígado, de tal forma que um fígado intacto bioscaffold que mantém a estrutura dos principais vasos sanguíneos é obtido. Além disso, descrevemos métodos para recellularize esses bioscaffolds com adultos hepatócitos primários, a criação de um enxerto de fígado que é funcional in vitro, e tem o acesso dos navios necessários para o transplante em vivo.

Protocolo

1. Decelularização fígado

1. Colheita de um fígado de ratos com canulação da veia porta utilizando e 18 de calibre do cateter. Deixe o inferior e veia cava superior aberta. Manter o órgão hidratado em tampão fosfato salino (PBS) numa placa de Petri de 10 cm.
2. Criação de um sistema de perfusão, que consiste em reservatório de 8 litros, bomba peristáltica e um borbulhador.
3. Preencher o sistema de perfusão com tampão fosfato e mantê-lo funcionando por 10 minutos. Preencha PBS em uma placa de Petri de 10 cm e reduzir a taxa de fluxo de tampão fosfato salino a 1 mL / min.
4. Transferir cuidadosamente o fígado colhidas ao tampão fosfato salina preenchidos de 10 cm placa de Petri.
5. Continue com perfusão PBS durante a noite.
6. Iniciar a perfusão com 0,01% (w / v) dodecil sulfato de sódio (SDS) em água destilada por 5 minutos.
7. Perfundir com PBS por 1 hora.
8. Repita os passos 1.6 e 1.7 mais três vezes o aumento do tempo de perfusão SDS para minutos 10, 15 e 20 em cada tempo.
9. Continue a perfusão com 0,01% (w / v) SDS por 24 horas.
10. Continue a perfusão com 0,1% (w / v) SDS por 24 horas.
11. Perfundir com 0,2% (w / v) SDS por 3 horas.
12. Perfundir com 0,5% (w / v) SDS por 3 horas.
13. Perfundir com água destilada por 15 minutos.
14. Perfundir com 1% (w / v) de Triton X-100 em água destilada por 30 minutos para remover qualquer ácidos nucléicos ligado.
15. Para lavar o fígado decelularizado matriz (DLM), perfundir com PBS por 2 horas.
16. Opcional: ressecar todos os lobos, exceto o lobo mediano.
17. Armazenar o DLM numa placa de Petri limpa e selada embebido em PBS a 4 ^° C até que esteja pronto para uso (Figura 1).
18. Para esterilizar o DLM: 1) Lave o DLM com PBS estéril contendo 0,1% (v / v) de ácido peracético e 4% (v / v) de etanol e incubar durante 3 horas a 4 ^o C. 2) Lavar com PBS esterilizado duas vezes. 3) Lavar com PBS estéril contendo 2% de penicilina-estreptomicina, 10ug / mL de gentamicina e 2,5 ug / ml anfotericina B. loja o fígado decelularizado na mesma solução a 4 ^° C até ser utilizado para experimentos recellularization.

2. Recellularization de decelularizados Fígado Matrix

1. Criação de um sistema de perfusão, que consiste de uma câmara de perfusão, bomba peristáltica e um borbulhador em condições estéreis. Preencher o sistema de perfusão com 200 mL de meio de cultura, por exemplo, alta de glicose DMEM (Sigma), 10% soro fetal bovino (Hyclone), 100 U mL ^-1 de penicilina e 100 mg mL ^-1 de estreptomicina (Invitrogen).
2. Coloque a matriz fígado decelularizado na câmara de perfusão e conectar o DLM ao sistema de perfusão através da cânula da veia porta, enquanto a bomba está funcionando em 5 mL / min para evitar a formação de bolhas de ar.
3. Permitir a perfusão do meio através da DLM por 30 minutos.
4. Isolar hepatócitos primários de um rato adulto com viabilidade, pelo menos, 90%.
5. Interromper o fluxo no sistema de perfusão e injecte lentamente 50000000 hepatócitos (em mL 1-3 de meio de cultura) em sistema de perfusão através do borbulhador.
6. Iniciar o fluxo de 10 mL / min e recircular o meio por 10 minutos.
7. Repita os passos 2.5 e 2.6, até um total de 200 milhões de células são introduzidas no DLM (Figura 2) ^6.
8. Uma vez que todas as células são perfundidos para a DLM, coletar o perfusato em quatro tubos de 50 ml de centrífuga e centrifugar a 600 rpm por 10 minutos. Descartar o sobrenadante e recolher as bolinhas em um único tubo. Determinar o número de células e viabilidade através de exclusão do azul tripan para determinar a eficiência da semeadura.

3. Cultivo in vitro do Enxerto Fígado Recellularized

1. Criação de um sistema de perfusão, que consiste de uma câmara de perfusão, bomba peristáltica, oxigenador e um borbulhador em condições estéreis (Figura 3). Preencher o sistema de perfusão com 50 mL de meio de cultura, por exemplo, E Williams (Sigma), 5% soro fetal bovino (Hyclone), 0,5 mL de insulina U ^-1 (Eli Lilly), 20 ng mL ^-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng mL ^-1 glucagon (Bedford Laboratories), 7,5 mg mL ^-1 hidrocortisona (Pharmacia), 100 U mL ^-1 de penicilina e estreptomicina 100 mg mL ^-1 (Invitrogen).
2. Coloque o enxerto de fígado recellularized na câmara de perfusão e conectar o DLM ao sistema de perfusão através da cânula da veia porta, enquanto a bomba está funcionando em 5 mL / min para evitar a formação de bolhas de ar.
3. Assepticamente fechar a câmara de perfusão e lacre firmemente para evitar qualquer vazamento durante a cultura.
4. Transferir o sistema de perfusão de uma incubadora que é de 37 ^º C e tem 10% de CO ₂ e aumentar a taxa de fluxo de perfusão a 15 mL / min.
5. Conecte o oxigenador a um 95% O ₂ e 5% CO ₂ tanque de mistura de gás e definir a taxa de fluxo de gás para 0,5 litros / min. Isto deve atingir uma pressão parcial de oxigênio de aproximaçãotely mmHg 400.
6. A cultura pode continuar até 10 dias, com variações diárias de meio de cultura. O meio de cultura podem ser amostrados diariamente para monitoramento das funções hepática do enxerto, tais como uréia, albumina e secreção de ácido total de bile. No final do período de cultura, o enxerto de fígado recellularized podem ser amostrados para análise molecular e histológica.

4. Resultados representativos:

A decelularização completa de um fígado de rato leva cerca de 72 horas usando o protocolo descrito. A matriz resultante mantém 100% do colágeno fibrilar, 50% dos glicosaminoglicanos e apenas 5% do DNA do fígado nativo (Tabela 1) ^6. A estrutura vascular da matriz é preservada como evidenciado pela corrosão de fundição e digitalização análise de microscopia eletrônica (Figura 4) ^6. A presença da microarquitetura vascular dentro da DLM facilita o seu repovoamento com células com uma eficiência de 96% e sua subseqüente perfusão de cultura in vitro. O enxerto de fígado recellularized podem ser cultivadas até 10 dias in vitro e exibe as funções do fígado adequada como foi confirmado através de uréia, albumina e secreção de bile ácida total (Figura 5) ^6.

Figura 1. Decelularizados matriz de fígado no final do processo de decelularização. (A) todo o fígado (b) a mediana do lobo após a ressecção.

Figura 2. Representação esquemática do recellularization da DLM.

Figura 3. Perfusão configuração do sistema para a cultura in vitro do enxerto hepático recellularized.

Figura 4. A estrutura microvascular é retida na matriz do fígado descelularizados. Corrosão imagens elenco de a) b) um fígado decelularizado um fígado normal, portal (vermelho) e venosa vasculatura (azul). Digitalização de imagens de microscopia eletrônica do c DLM) um navio, d) apresentando uma seção do ducto biliar, como pequenos vasos (setas), barras de escala (a, b) 5 mm (c, d) 20 mM.

Figura 5. Liver funções específicas do enxerto hepático recellularized durante o cultivo in vitro de perfusão. uma secreção) de albumina (p = 0,5249), b) produção de uréia (p = 0,5271) e c) a secreção de bile ácida total (p = 0,0114). Análise estatística da diferença entre a experiência eo controle foi feito durante o período de 10 d cultura pelo teste de Friedman em a = 0,01. Barras de erro representam sem (n = 3).

	Livera fresco	Decelularizado fígado uma matriz	p-valores	% De fígado fresco
	n = 4	n = 8
Colágeno	0,07 ± 0,01	0,08 ± 0,03	0,56	114%
(Mg por fígado g)
Glicosaminoglicanos	73,1 ± 6,7	34,2 ± 2,9	0,004	47%
(Mg por fígado g)
DNA	14,9 ± 5,6	0,44 ± 0,08	3.3 10 -5	2,9%
(Mg por fígado g)

Tabela 1. A composição bioquímica da matriz fígado decelularizado em comparação com o fígado nativo.
^uma Os valores são representados como média ± epm

Discussão

O método descrito aqui decelularização perfusão produz um todo fígado andaime que tem a mesma estrutura bruta ea microarquitetura vascular do fígado nativo. O andaime tem uma composição da matriz extracelular semelhante ao fígado nativo. O método recellularization atinge repovoamento do andaime com células de alta eficiência e as células permanecem viáveis ​​e funcionais durante o período de cultivo in vitro testados. Com a adição de células não parenquimatosos para o enxerto de fígado r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149