A estimulação mecânica de Células-Tronco Usando Strain Uniaxial Cíclico

Resumo

É amplamente entendido que forças mecânicas no corpo pode influenciar a diferenciação e proliferação celular. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo demonstrando o uso de um biorreator custom-built para a entrega de deformação de tração uniaxial cíclicos às células-tronco cultivadas em substratos flexíveis micropatterned.

Resumo

O papel das forças mecânicas no desenvolvimento e manutenção dos tecidos biológicos é bem documentado, incluindo vários fenômenos mecanicamente regulamentadas, tais como remodelação óssea, hipertrofia muscular, e da plasticidade das células musculares lisas. No entanto, as forças envolvidas são extremamente complexas e difíceis de monitorar e controlar in vivo. Para melhor investigar os efeitos de forças mecânicas sobre as células, nós desenvolvemos um método in vitro para a aplicação de deformação de tração uniaxial cíclicos de células aderentes cultivadas em membranas elásticas. Este método utiliza um biorreator personalizados com um sistema motorizado cam-rotor para aplicar a força desejada. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo passo-a-passo demonstrando como montar os vários componentes de cada "câmara de estiramento", incluindo, neste caso, uma membrana de silicone com micropatterned topografia para orientar as células com a direção da tensão. Descrevemos também procedimentos para a esterilização das câmaras, a semeadura em células da membrana, trancando a câmara para o biorreator, e ajustando os parâmetros mecânicos (ou seja, magnitude e taxa de deformação). Os procedimentos descritos neste protocolo particular, são específicos para a semeadura de células-tronco mesenquimais em membrana de silicone com 10 mM canais amplo orientado paralelamente à direção de tensão. No entanto, os métodos e materiais apresentados neste sistema são flexíveis o suficiente para acomodar uma série de variações sobre este tema: taxa de deformação, magnitude, duração, tipo de célula, topografia de membrana, revestimento de membrana, etc podem ser adaptados para a aplicação desejada ou resultado. Este é um método robusto para investigar os efeitos da deformação de tração uniaxial aplicada às células in vitro.

Protocolo

Dia 0 - Esterilização antes do dia de experimento

1. Colocar materiais em tubo de plástico e esterilizar com álcool 70% durante 2 horas:
   • Chambers
   • Tampas
   • Quadros (todos os 3 peças)
   • Parafusos
   • Juntas de borracha
   • Fórceps
   • Tesoura
   • Chaves Hex
2. Membranas limpo com Aquet sabão e água destilada.
3. Sonicate membranas em álcool 70% por 10 minutos.
4. Coloque as membranas limpa em plástico pratos quadrados. Se utilizando membranas padronizada, garantir que o lado padronizada é a face para cima (álcool de spray em um lado da membrana e prestar atenção para o líquido para executar as ranhuras).
5. Deixe membranas cobertas em álcool 70% por 2 horas.
6. Luvas de pacote em folha de alumínio para autoclave amanhã de manhã.
7. Faça 2% (peso / volume) de solução de gelatina (2g/100mL) em água destilada para autoclave amanhã.
8. Após a esterilização duas horas em álcool 70%, coloque todos os materiais de polímeros e membranas (não autoclavável materiais) na capa de UV durante a noite:
   • Chambers
   • Tampas
   • Quadros (todos os 3 peças)
   • Membranas
9. Pacote de materiais remanescentes na bolsa autoclavável:
   • Parafusos
   • Juntas de borracha
   • Fórceps
   • Tesoura
   • Chaves Hex

Dia 1 - Montagem das câmaras de estiramento

1. Forceps autoclave, tesouras, chaves hex, parafusos, juntas, luvas, e gelatina utilizando autoclave pequena a 240 ° F durante 20 minutos no total
2. Remova as membranas de UV e tratar com O ₂ plasma (lado modelado para cima) para ~ 1 minuto.
3. TC na capa, capa área padronizada de membranas de plasma tratado com gelatina. Casaco de 30 para minutos sob UV.
4. Lavar cada membrana com PBS 2X. Após a lavagem 2, deixar alguns PBS nas membranas para mantê-los escorregadios, para facilitar a montagem para as câmaras. (Deve também usar este PBS para lubrificar as juntas para facilitar a montagem).
5. Montar membranas em câmaras (usar luvas autoclavado durante a montagem)
   1. Ligar as duas principais peças do quadro usando um único parafuso.
   2. Virar o quadro e coloque uma membrana na parte superior de modo que as faces de gelatina revestido lateral em direção à estrutura (área padrão deve estar no centro).
   3. Assegurar a membrana para o quadro usando uma junta em cada lado.
   4. Pressione a juntas de, usando gentil, mesmo pressão, para não rasgar a membrana.
6. Anexar quadro montado para T-bar.
7. Virar o quadro e colocar em câmara de cabeça para baixo. Verso da moldura UV e membrana por 30 minutos
8. Vire a moldura novamente, e parafuso em câmaras (sem mudança para câmara de controle, mas para câmara de estiramento, precisa usar dois parafusos para fixar a peça final do quadro para o fundo da câmara, e precisa remover o único parafuso que é segurando as duas peças do quadro juntos). Frente UV por 30 min. Certifique-se que as membranas estejam completamente secas antes de prosseguir para a próxima etapa, ou então a solução da célula pode escapar durante a semeadura.
9. Células da semente. Área de 1 = Área da placa de 3 membranas, portanto, use 1 / 3 de uma placa confluentes por membrana. Use 1 mL de solução por célula de membrana. Mais do que 1,5 ml será difícil manter em solução. Coloque solução única célula na área de estampados, e usar a ponta da pipeta para espalhar a solução ao redor. Cubra e deixe câmaras anexar células por 30 minutos RT no capô.
10. Mover câmaras para incubadora e vamos anexar células por mais 1 hora. Ter muito cuidado movendo as câmaras de evitar que solução da célula escorregar! As células em que câmara será arruinado se a solução cai neste momento.
11. Retorno câmara para capô e adicionar 20 mL de mídia.
12. Câmaras lugar em álcool limpo banheira que é coberto com folha de alumínio (também pulverizadas com álcool). Mover câmaras para esticar incubadora (10% CO _2).
13. Câmaras de seguro para uma máquina de estiramento. Vamos anexar células mais durante a noite, e começar a esticar no dia seguinte. (Nota: quando colocar câmaras em máquina de esticar, lembre-se de bloquear a máquina na posição "zero" antes de colocar câmaras, e então aperte o elástico em volta das engrenagens Não se esqueça de desbloquear as engrenagens antes de iniciar a máquina.).

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Discussão

Banes et al. relatada pela primeira vez o uso de um sistema de estimulação mecânica das células in vitro, utilizando um substrato flexível elastomérica para entregar a força mecânica para as células ^1. Desde então, muitas variações sobre este projeto ter sido concebido e utilizado. Vários sistemas de estiramento mecânico estão disponíveis comercialmente sob o nome "Flexercell" (FlexCell International Corp), enquanto que alguns laboratórios usam custom-built dispositivos. Neste protocolo de vídeo que de...

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