Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

Resumo

Identificação dos mecanismos subjacentes à lesão muscular é crucial. Aqui apresentamos a técnica histológica para preparar parafina e congeladas seções do Drosophila músculos do tórax. Isto permite a análise da morfologia do músculo e localização de proteínas e outros componentes celulares do músculo.

Resumo

A caracterização molecular das distrofias musculares e miopatias em humanos revelou a complexidade da doença muscular e análise genética de especificação muscular, formação e função em sistemas modelo tem fornecido informações valiosas sobre a fisiologia muscular. Portanto, identificar e caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes lesão muscular é fundamental. A estrutura do adulto Drosophila multi-fibras de músculos de vertebrados se assemelham músculos estriados ¹ e a rastreabilidade genética de Drosophila tornou um grande sistema para analisar a morfologia muscular distrófica e caracterizar os processos que afetam a função muscular em adultos envelhecimento moscas ^2. Aqui apresentamos a técnica histológica para preparar parafina e congeladas seções do Drosophila músculos do tórax. Estes preparativos para permitir o tecido a ser marcadas com manchas histológica clássica e rotulado com corantes detectar proteínas, e especificamente criosecções são ideais para a detecção imunohistoquímica de proteínas nos músculos intactos. Isto permite uma análise da estrutura do tecido muscular, a identificação de defeitos morfológicos, e detecção do padrão de expressão para o músculo / neurônio-específica de proteínas nos músculos adulto Drosophila. Essas técnicas também podem ser ligeiramente modificada para o seccionamento de outras partes do corpo.

Protocolo

1. Preparação

1. Recém preparar fixador de Carnoy, combinando etanol absoluto, clorofórmio e ácido acético glacial na proporção 6:03:01 respectivamente. ³ Esta, assim como todas as soluções para colarinhos submergindo devem ser mantidos em tinas de coloração de vidro (veja a seção de reagentes para a recomendação).
2. Prepare uma folha de alumínio bolsos o tamanho correto para os colares.
3. Prepare as seguintes soluções na coloração frascos: 2 X 40% de etanol, o etanol 70%, 2% de etanol X 100, metilbenzoato (MB), 50/50 v / v MB e parafina, parafina X 2. Coloque o MB e recipientes de parafina em um conjunto de incubadora para 60-65 ° C.
4. Parafina quente para derramar nos bolsos folha de 60-65 ° C.

2. Fixação Flies em Colares

1. Anexar os ⁴ colarinho sob a binocular usando a fita na posição vertical, onde você pode ver o ponto de entrada para a mosca.
2. Anestesiar voa usando dióxido de carbono ou por meio de hipotermia usando um bloco de gelo. Tenha cuidado para não congelar as moscas.
3. Utilizando uma pinça, pegar moscas individuais, agarrando suas asas e colocar na coleira corretamente orientado (cabeça e tórax em cima das lâminas e abdômen abaixo as lâminas). 20/10 moscas deve caber facilmente na gola.

Nota: Se você está analisando vários genótipos, não se esqueça de fazer uma nota do número de colarinho e genótipo correspondente.

3. Seções de parafina de Drosophila tórax

1. Realocar o colar para a solução de Carnoy e fixar o tecido a 4 ° C durante a noite.
2. Após a fixação, desidratar a amostra usando concentrações crescentes de etanol. Por 10 minutos cada submergir o colar em 40% (2 vezes), 70% e 100% (2 vezes) de etanol à temperatura ambiente. Colar incubar seguinte em MB e MB solução de parafina + (1:1) por 30 min em cada um e, em seguida, se infiltrar na gola em duas mudanças de parafina por 60 minutos cada um em 60-65 ° C. Rapidamente mudar o colar na bolsa de alumínio e encher com derretida (60-65 ° C) parafina. Colocá-lo à temperatura ambiente e permitir que a parafina para se tornar rígido (o melhor é deixar overnight). Note que o colar pode ser colocado no bolso folha em diferentes orientações, dependendo da orientação das seções que você precisa (longitudinal ou transversal).
3. Desembrulhar blocos de parafina seca com colares do papel alumínio e levemente separadas o colar do bloco de parafina. Com a ajuda de uma lâmina afiada ou um bisturi corte cuidadosamente a parafina extra-de todo o tecido voar.
4. Corte o bloco de parafina com passos M 10/07 seção em um micrótomo rotativo e permitir que o tecido cortado a flutuar apartamento em banho-maria a 37 ° C. Coloque o tecido seccionado em lâminas polares e permitir a secagem durante a noite. Estas lâminas podem ser usados ​​para a coloração com hematoxilina e eosina (Figura 1A-D), azul de toluidina, azul de anilina ou outro morre de visualizar estruturas de tecidos, bem como para a coloração de anticorpos (Figura 1E-E ``).

4. Criosecções de Drosophila tórax

1. Tal como acontece com parafina, prepare as moscas em um colar e uma bolsa fashion folha de alumínio. Um refrigerador congelamento serão necessários para preparar as amostras. Certifique-se que o cooler está em torno de -60 ° C, use um pouco de etanol e gelo seco para permitir chegar a esta temperatura. Uma hora antes de iniciar o experimento colocar a garrafa de incorporação crio-médio (Tissue-Tek composto OCT) de cabeça para baixo em um frigorífico 4 ° C, a fim de resfriá-lo para baixo e para minimizar a formação de bolhas de ar.
2. Realocar o colar com as moscas para o bolso de alumínio que foi pré-resfriado por vários minutos dentro do refrigerador congelamento e rapidamente preencher com o composto crio incorporação. Deixe o congelamento da amostra para 30-10 min. Cuidadosamente desmontar o bloco formado dentro do refrigerador, separar delicadamente o colar do bloco de incorporação e colocá-lo a -20 ° C durante pelo menos um dia.
3. Cortar os músculos congelados em um crio-micrótomo entre -15 e -18 ° C com uma espessura de 10-15 mM. Lugar em slides polarizada e manter a -20 ° C até que esteja pronto para fazer o processamento adicional. Sugerimos a fixação do tecido em 4% solução de formol PBS por 10 min em temperatura ambiente antes da coloração de anticorpos.

5. Detecção lipídios nos músculos Drosophila

Gotículas lipídicas pode ser detectado com óleo vermelho O mancha na criosecções usando um protocolo adotado a partir de Sieber e Thummel ^5.

1. Após a fixação, lavagem das lâminas com água duas vezes por 5 min, equilibrada em propilenoglicol por 10 minutos e incubar por 3 h em óleo vermelho O mancha em temperatura ambiente. Em seguida, lave as amostras duas vezes por 5 min em propilenoglicol e 30 min em PBS. Montagem em glicerol 30%.

6. Resultados representativos:

FigoA Figura 1. Parrafin-embedded seções
Hematoxilina eosina e corados transversal (AB) e longitudinal (CD) seções dos músculos de vôo indiretos. A e C mostra os músculos normais estruturado. Anormais pelos músculos tamanho e morfologia estão representados na B e D, respectivamente (setas pretas). Seção transversal da Drosophila manchada tórax com anti-LAMCE marcador envelope, nuclear e DAPI, mancha nuclear (EF). Visão ampliada do normal (seta vermelha) e piorou (seta amarela) músculos (F). G representa a secção de Drosophila manchada trato intestinal com LAMCE e DAPI.

Figura 2. Cortes congelados
Seções transversais A. congelados de Drosophila manchada tórax com óleo vermelho O, rótulo gotículas lipídicas.
B. Longitudinal cortes congelados de músculos de vôo indireta corados com anti-Dg, sarcolema do músculo marcador e DAPI.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stainless steel collars	Home made		Specially constructed
Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Aluminum foil	Any Supplier
Blade or scalpel	Any Supplier
Wheaton macro staining jar	Wheaton	900200
Microtome	Carl Zeiss, Inc.		Model: Hyrax M25
Cryo-microtome	Leica Microsystems		Model CM3050S
60-65°C Incubator	Any Supplier		Large enough to hold at least 4 staining jars
Freezing cooler with metal block	Any Supplier		Store at -80°C
Super-frost slides	Thermo Fisher Scientific, Inc.	9161155
Cover slips	Any Supplier		Recommend 24 X 40 mm
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306	Analytical grade
Glacial acetic acid	Merck & Co., Inc.	100063	Analytical grade
Ethanol	Merck & Co., Inc.	100983	Analytical grade
Methylbenzoate	Sigma-Aldrich	M29908-500G	Analytical grade
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	76258	Paraffin
Tissue-Teck O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
16% formaldehyde, methanol free	Polysciences, Inc.	18814
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5150-1L