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Identificação dos mecanismos subjacentes à lesão muscular é crucial. Aqui apresentamos a técnica histológica para preparar parafina e congeladas seções do Drosophila músculos do tórax. Isto permite a análise da morfologia do músculo e localização de proteínas e outros componentes celulares do músculo.
A caracterização molecular das distrofias musculares e miopatias em humanos revelou a complexidade da doença muscular e análise genética de especificação muscular, formação e função em sistemas modelo tem fornecido informações valiosas sobre a fisiologia muscular. Portanto, identificar e caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes lesão muscular é fundamental. A estrutura do adulto Drosophila multi-fibras de músculos de vertebrados se assemelham músculos estriados 1 e a rastreabilidade genética de Drosophila tornou um grande sistema para analisar a morfologia muscular distrófica e caracterizar os processos que afetam a função muscular em adultos envelhecimento moscas 2. Aqui apresentamos a técnica histológica para preparar parafina e congeladas seções do Drosophila músculos do tórax. Estes preparativos para permitir o tecido a ser marcadas com manchas histológica clássica e rotulado com corantes detectar proteínas, e especificamente criosecções são ideais para a detecção imunohistoquímica de proteínas nos músculos intactos. Isto permite uma análise da estrutura do tecido muscular, a identificação de defeitos morfológicos, e detecção do padrão de expressão para o músculo / neurônio-específica de proteínas nos músculos adulto Drosophila. Essas técnicas também podem ser ligeiramente modificada para o seccionamento de outras partes do corpo.
1. Preparação
2. Fixação Flies em Colares
Nota: Se você está analisando vários genótipos, não se esqueça de fazer uma nota do número de colarinho e genótipo correspondente.
3. Seções de parafina de Drosophila tórax
4. Criosecções de Drosophila tórax
5. Detecção lipídios nos músculos Drosophila
Gotículas lipídicas pode ser detectado com óleo vermelho O mancha na criosecções usando um protocolo adotado a partir de Sieber e Thummel 5.
6. Resultados representativos:
FigoA Figura 1. Parrafin-embedded seções
Hematoxilina eosina e corados transversal (AB) e longitudinal (CD) seções dos músculos de vôo indiretos. A e C mostra os músculos normais estruturado. Anormais pelos músculos tamanho e morfologia estão representados na B e D, respectivamente (setas pretas). Seção transversal da Drosophila manchada tórax com anti-LAMCE marcador envelope, nuclear e DAPI, mancha nuclear (EF). Visão ampliada do normal (seta vermelha) e piorou (seta amarela) músculos (F). G representa a secção de Drosophila manchada trato intestinal com LAMCE e DAPI.
Figura 2. Cortes congelados
Seções transversais A. congelados de Drosophila manchada tórax com óleo vermelho O, rótulo gotículas lipídicas.
B. Longitudinal cortes congelados de músculos de vôo indireta corados com anti-Dg, sarcolema do músculo marcador e DAPI.
Agradecemos ao Prof Eichele por nos permitir usar o crio-micrótomo. Trabalho foi financiado pelo Max-Planck-Gesselschaft.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Aluminum foil | Any Supplier | ||
Blade or scalpel | Any Supplier | ||
Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
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