Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Resumo

Neste protocolo, apresentamos um método para medir Caenorhabditis elegans Tempo de vida em 96 placas de microtitulação.

Resumo

Expectativa de vida é um processo biológico regulado por várias vias genéticas. Uma estratégia para investigar a biologia do envelhecimento é estudar os animais que as mutações em componentes porto de idade-regulação caminhos. Se essas mutações perturbam a função da via idade-regulação e, portanto, alterar a vida útil de todo o organismo, eles oferecem importantes perspectivas mecanicistas ^1-3.

Outra estratégia para investigar a regulação da vida útil é a utilização de pequenas moléculas para perturbar a idade regulamentar caminhos. Até à data, um número de moléculas são conhecidos por prolongar sua vida útil em vários organismos modelo e são utilizados como ferramentas para estudar a biologia do envelhecimento ^16/04. O número de moléculas identificadas até agora é pequeno se comparado ao "conjunto de ferramentas" genético que está disponível para estudar a biologia do envelhecimento.

Caenorhabditis elegans é um dos modelos princípio usado para estudar o envelhecimento devido à sua genética excelente e curta duração de três semanas. Mais recentemente, C.elegans tem emergido como um organismo modelo para telas de fenótipo baseado drogas ^5,7,16-20 por causa de seu pequeno tamanho e sua capacidade de crescer em placas de microtitulação.

Aqui apresentamos um ensaio para medir C.elegans vida em 96 placas de microtitulação. O ensaio foi desenvolvido e utilizado com sucesso para a tela de grandes bibliotecas de moléculas que se estendem C.elegans vida ^7. A confiabilidade do ensaio foi avaliada em testes de múltipla: primeiro, através da medição do tempo de vida de animais de tipo selvagem crescidas em diferentes temperaturas, em segundo lugar, através da medição do tempo de vida dos mutantes, com expectativa de vida alterado, em terceiro lugar, medindo mudanças na expectativa de vida em resposta a diferentes concentrações da mirtazapina antidepressivo. A mirtazapina tem sido mostrado previamente para estender o tempo em C.elegans ^7. Os resultados destes testes mostram que o ensaio é capaz de reproduzir os achados anteriores de outros ensaios e quantitativa. O formato de microtitulação também faz esse ensaio vida compatível com sistemas de tratamento automatizado líquido e permite a integração em plataformas automatizadas.

Protocolo

Resumo: O protocolo é dividido em quatro partes. Parte 1 descreve como preparar as bactérias alimentação. Parte 2 descreve como preparar a cultura worm. Parte 3 descreve como pontuação vida. Parte 4 mostra alguns resultados representativos, e Parte 5 descreve como preparar as soluções necessárias. Experimentos vida levar várias semanas para ser concluído. Para cada etapa da semana de protocolo, dia e hora do dia está incluído para facilitar o planejamento. O estágio L4 (Dia 0) é usado como ponto de referência para todo o protocolo.

1. Preparação de bactérias que se alimentam

Esta seção descreve a preparação das bactérias alimentação. O E. específicas coli cepa utilizada para alimentar C.elegans é chamado OP50. Antes deste protocolo, para evitar a contaminação cruzada da cultura verme com outras bactérias, a cepa OP50 foi feito carbenicilina / Ampicilina resistentes ^21. Prepare o OP50 4-5 dias de antecedência. Todos os materiais em contacto com OP50 devem ser estéreis.

Dia -7: quinta-feira (1 semana): Inocular 5 ml de TB contendo 100 mcg / ml ampicilina e 0,1 mcg / ml anfotericina B com uma colônia OP50 única e incubar durante a noite a 37 ° C em um agitador bacteriana.

Dia -6: sexta-feira (1 semana).

8:30 da manhã. Inocular cedo para dar tempo suficiente para a cultura para atingir a saturação

1. Diluir a cultura da noite para o dia OP50 1:2000 em 300 TB mL contendo 50 mcg / ml ampicilina. Incubar a cultura em um shaker bacteriana por 8-12 horas a 37 ° C até à saturação é atingido. Não permita que a cultura a crescer mais de 14 horas.
2. Transferir o OP50 em um tubo de centrifugação estéril, pré-ponderada. Pellet o OP50 por centrifugação por 10 min a 3500 rpm (2200 xg) em uma centrífuga de mesa.
3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet OP50 em água estéril e re-pellet por centrifugação. Repita esta lavagem duas vezes.
4. Depois da segunda lavagem, retire cuidadosamente toda a água restante. Nenhuma água deve ser deixado no tubo. Pesar o tubo de centrifugação contendo o pellet e subtrair o peso do tubo de centrifugação vazia, a fim de determinar o peso do sedimento.
5. Completamente re-suspensão do sedimento em S-completa para uma concentração de 100 mg / mL. Não aglomerados deve ser deixado.
6. A concentração de 100 mg / mL OP50 deve corresponder a 2 x10 ¹⁰ bactérias / mL. Use um espectrômetro foto para determinar o número de bactérias por mL, se a relação entre a densidade ótica eo número de bactérias por mL é conhecido. Se necessário, ajustar a concentração da solução de alimentação OP50 a 2 x10 ¹⁰ bactérias / mL.
7. Armazenar os OP50solution a 4 ° C até ser utilizado para a cultura worm.

2. Preparação de uma Cultura Worm Synchronous

Esta seção descreve a preparação da cultura worm. Seu objetivo é gerar uma população em idade síncrona de worms. Todos os materiais em contacto com C.elegans após o tratamento de lixívia na etapa 5 devem ser estéreis. Placas são mantidos a 20 ° C salvo indicação em contrário.

Dia -6: sexta-feira (1 semana), 16:00: Transfer os animais para um prato fresco

1. Dê uma placa NGM 50-10 dias de idade em que a maioria da população sem-fim consiste de larvas L1 fome.
2. Esterilizar uma espátula de metal por pouco tempo de aquecimento é mais um bico de Bunsen. Deixe esfriar. Use a espátula resfriado a cortar pedaços de agar da placa contendo os vermes famintos. Transferência de vários desses pedaços em uma nova placa de 10 centímetros NGM semeados com OP50. Incubar por aprox. 65 horas a 20 ° C até que a maioria da população sem-fim é composto por adultos gravídico. O tempo que leva para os animais L1 fome para crescer em adultos gravid pode variar de cepa para cepa.

-3 Dia: segunda-feira (2 semanas) 10:00: Estabelecer uma população síncrona

3. Coletar worms da placa de 10 cm, lavando-as fora do prato com água mL 10/05 estéril. Transferir a solução worm / água em um tubo cônico de 15 mL.
4. Lave os vermes por centrifugação 2 min em uma centrífuga de mesa em 1200 rpm (280 xg). Elimine o sobrenadante e adicionar 10 mL de água. Repetir.
5. Remover o sobrenadante e adicionar 5 mL de lixívia preparada / solução de NaOH (2,5 lixívia mL, 1 mL de NaOH 10N, 6,5 mL H ₂ O). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente até que os vermes abrir. Certifique-se de vortex suavemente a cada minuto. Monitorar o progresso da reação sob o microscópio de dissecação.
6. Assim que todos os adultos se dissolver, adicionar 5 mL de tampão M9 para neutralizar a reação.
7. Lave os ovos três vezes com 10 mL tampão M9 por centrifugação 2 min a 2500 rpm (1100 xg).
8. Lave os ovos uma vez com 10 mL S-completo por centrifugação 2 min a 2500 rpm (1100 xg).
9. Remover o sobrenadante, adicionar 10 mL S-completo e transferir a solução para um tubo cônico de 50 mL fresco. Adicionar 30 mL de S-complete para um volume final de 40 mL. Agite suavemente o tubo durante a noite a temperatura ambiente em um nutator ou dispositivo similar.

Dia -2: terça-feira (2 semanas), o meio-dia 12:00: Seed os animais em placas

10. No âmbito de dissecação, verificar se os vermes nascidos durante a noite. Determinar a concentração de worms na solução S-completo por contagem do número de worms em 10 gotas mL usando um escopo de dissecação. Contar, pelo menos, 10 gotas para cada amostra.
11. Re-suspender a worms em uma concentração de 8-10 worms / mL em S-completa. Adicionar carbenicilina (stock 100 mg / mL) a uma concentração final de 50 mcg / mL e anfotericina B (stock 250 mcg / mL) para uma concentração final de 0,1 mg / mL. Agitar em um nutator. Se preparando quantidades maiores de vermes, use um frasco de 600 mL nunclon com tampa de filtro.
12. Em 2:30 adicionar o OP50 preparada na parte 1 para uma concentração final de 6 mg / mL (= 1,2 x10 ⁹ bactérias / mL). Devolver o OP50 a 4 ° C.
13. Transferência de 120 mL da solução worm/OP50 em cada poço de uma placa de 96 poços. Use 96 placas bem com um fundo transparente. Certifique-se manter os vermes em suspensão, enquanto pipetagem.
14. Selar a placa usando uma fita isolante para evitar a contaminação e evaporação. Agite a placa em uma placa de microtitulação shaker por 2 min e incubar por 2 dias a 20 ° C até os animais atingirem o estágio L4.

Dia 0: quinta-feira (2 semanas) antes do meio dia: Esterilizar animais adicionando Fluorodeoxyuridine (FUDR)

15. Para esterilizar os animais adicionar 30 mL de uma solução estoque 0,6 mM FUDR a cada poço. Esta etapa traz o volume final em cada poço a 150 mL e reduz a concentração final de OP50 de 6mg / ml a 5 mg / mL (1x10 ⁹ bactérias / mL). Selar a placa usando fita selantes e agitá-lo por 2-3 min em uma placa de microtitulação shaker. Se o OP50 foi adicionado às 2:30 no dia -2, é importante que o FUDR é adicionado antes do meio dia. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C

Dia 1: sexta-feira (2 semanas): Adicionar drogas para a cultura

16. Por 9h00 a maioria dos animais deve ser gravid e contêm vários ovos cada. Adicionar as drogas cujo efeito no tempo de vida é para ser testado na concentração desejada. Se dissolver a droga em DMSO a concentração final de DMSO não deve exceder 0,6%, como DMSO concentrações superiores a 0,6% C.elegans encurtar sua vida útil. Após a adição da droga, selar as placas com fita isolante e agitá-lo por 2-3 min em uma placa de microtitulação shaker. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C
17. Adicionando as drogas podem, ocasionalmente, matar alguns animais por placa, especialmente se estiver usando um outro solvente que a água. Use um microscópio invertido para verificar se há animais mortos. Geralmente, não deve ser inferior a 10 animais mortos por placa de 96 poços. Retorno pratos para a 20 ° C incubadora.

Dia 4: segunda-feira (3 semanas): selantes Alterar

18. Para permitir que o oxigênio fresco para entrar a cultura remover o selante, espere um minuto e feche o prato. Agite a placa por 2-3 minutos em uma placa de microtitulação shaker. Repita uma vez por semana.

Dia 5: terça-feira (3 semanas): Adicionar novo OP50 para evitar a fome

19. Adicionar 5 mL da 100 mg / mL OP50 solução que foi preparada na parte 1 a cada um dos 96 poços para evitar a fome.

3. Pontuação de Lifespan.

Esta seção descreve como a sobrevivência da população sem-fim sincronizado da Parte 2 é monitorada até que os animais morreram. Para observar os animais nos 96 pratos bem, use um microscópio invertido com um objetivo 2x ou 2.5x. Registro de dados de sobrevivência três vezes por semana; segunda, quarta e sexta-feira. Use movimento para determinar se os animais estão vivos ou mortos. Luz forte, luz especial azul, induz os animais a se mover. Não retire os animais mortos a partir do ensaio. Ocasionalmente, os animais que não se moveu e estavam determinados mortos na contagem anterior pode se mover mais tarde.

1. No dia 0, no início do experimento contar o número total de vermes em cada poço. Censor poços que contêm mais de 18 animais a partir da análise como animais nesses poços não terá o suficiente OP50 e irá mostrar os efeitos da restrição alimentar.
2. A fim de aumentar a chance de que os animais se movem agitar a placa de 96 poços em uma placa de microtitulação shaker por 2 min. antes da contagem.
3. Em cada sessão contando data de registro e número de animais quese movem como animais vivos. Movimento em líquidos é muito mais fácil do que em meios sólidos e pode ser induzida por luz forte. O uso de uma maior ampliação pode ajudar a detectar movimentos muito sutis, como os da ponta da faringe. Tais movimentos sutis são muitas vezes o único movimento observado em animais muito velhos.
4. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C
5. Repita o passo 2-4 a cada dois ou três dias até que todos os animais são mortos.

4. Resultados representante.

Esta seção mostra um exemplo de como manter registros dos dados gerados por este tempo de vida do ensaio e alguns resultados representativos.

Figura 1A mostra um exemplo de como gravar dados de expectativa de vida durante este ensaio. Uma folha excel é usado para rastrear a sobrevivência das populações em cada poço. Para cada bem, é coordenar na placa, a tensão, a droga, concentração da droga e do número total de animais vivos no dia 0 (X0) é gravada no início do experimento. Data de registo, bem como o número de animais mortos vivos e três vezes por semana a fim de seguir a sobrevivência das diversas populações em cada poço. Para o gráfico dos resultados, calcular a fração de animais vivos para cada dia e enredo como uma função do tempo em dias. P-valores devem ser calculados utilizando pacotes estatísticos como STATA ou software similar.

A vida útil média de C.elegans é dependente da temperatura. Figura 1B mostra que as mudanças dependem da temperatura na expectativa de vida são reproduzidas exatamente pela expectativa de vida de microtitulação com base ensaio ^22. Da mesma forma, o ensaio de placa de microtitulação reproduz mudanças na vida de mutantes relatado para ter tempo de vida que diferem dos animais tipo selvagem N2 ^{23-24 25} (Figura 1C).

O ensaio também pode ser usado para fazer declarações mais quantitativa. Em média Fig1D vida é plotado como uma função da concentração mirtazapina ^7. Cada ponto de dados representa a vida útil média de 12/07 população, cada um vivendo de uma forma diferente também. Mesmo que o número de animais por bem é relativamente baixa (5-15 animais) a variação bem-bem é relativamente pequena, como pode ser visto a partir as barras de erro.

Figura 1. A placa de microtitulação com base lifespan ensaio reproduz com precisão as mudanças na expectativa de vida relatadas na literatura.
(A) Os dados da amostra coletada em uma planilha excel. Durante cada sessão data de contagem, de coordenadas do bem e do número de animais vivos e mortos foi registrado. No início do experimento, o número total de animais em cada poço foi determinado. (B) Curva de sobrevida de tipo selvagem (N2) animais cultivados a 20 ° C e 25 ° C. (C) As curvas de sobrevida de estirpes portadores de mutações que afetam a vida. Todas as quatro cepas foram testadas em paralelo a 20 ° C. (D) curva de resposta da dose de mirtazapina N2 animais tratados. A média de expectativa de vida é plotado como uma função da concentração de mirtazapina. Barras de erro indicam o EPM de 8 poços por condição.

5. Materiais.

M9 buffer, 1000 mL

• 6 g Na ₂ HPO ₄
• 3 g KH ₂ PO ₄
• 5 g de NaCl
• 0,25 g MgSO ₄ 7H ₂ O ∙
• Adicione água deionizada para 1000 mL
• Autoclave

PH Potassiumphosphate tampão 6.0, 1000 mL

• 136 g KH ₂ PO ₄
• Adicionar água deionizada até 900 mL
• Ajustar o pH para 6,0 com KOH 5M
• Adicione água deionizada para 1000 mL
• Autoclave

Traço solução de metal

• 1,86 g Na ₂ EDTA
• 0,69 g FeSO ₄ 7H ₂ O ∙
• 0,20 g MnCl ₂ ∙ 4H ₂ O
• 0,29 g ZnSO ₄ 7H ₂ O ∙
• 0,016 g CuSO ₄
• 1000 mL de água deionizada
• Autoclave e armazenar no escuro.

S-basal média, 1000 mL

• 5,9 g NaCl
• 50 mL de fosfato de potássio 1M, pH 6,0
• 1000 mL de água deionizada
• Autoclave
• Deixe a solução arrefecer e adicionar 1 mL de colesterol 5mg / mL (dissolvido em Et-OH).

1M citrato de potássio, 1000 mL

• 268,8 g de citrato tripotássio
• 26,3 ácido cítrico
• Adicionar 900 mL de água deionizada
• Ajustar o pH para 6,0 com KOH 5M
• Adicione água deionizada para 1000 mL
• Autoclave

S-médio completo, 1000 mL

• 977 mL S-basal
• 10 mL de citrato pH 1M de potássio 6 (estéril)
• Rastreamento 10 mL de solução de metais (estéril)
• 3 ml 1M CaCl ₂ (estéril)
• 3 mL 1M MgSO ₄ (estéril)

Agar NGM

• 3.0G NaCl
• 2,5 g peptona(Pancreático de caseína, digerir)
• Agar 17g
• Adicionar água deionizada para 975 mL e uma barra de agitação
• Autoclave
• Após autoclavagem arrefecer a 55 ° C e adicionar os seguintes componentes:
  • 0,5 mL de CaCl ₂ 1M (estéril)
  • 1 mL de Colesterol 5mg / mL em etanol
  • 1 mL de 1M MgSO ₄ (estéril)
  • 25 tampão Potassiumphosphate mL, pH 6,0 (estéril)

TB, 1000 mL

• 12g Bacto Triptona
• Extrato de levedura 24 g
• 4 mL de glicerol
• Adicionar 900 mL de água deionizada
• Autoclave
• Após autoclavagem arrefecer a 55 ° C e adicione o componente seguinte:
  • adicionar 100 mL de 0.17M KH ₂ PO ₄ / 0.72MK ₂ HPO ₄

0,6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma # cat F0503), 1000 mL

• 100 mg FUDR
• Dissolver em 670 mL estéreis S-completar, fazer 10 mL ou 45 mL alíquotas.
• Armazenar a -20 ° C.

100 mg / mL carbenicilina, 10 mL

• 1 g carbenicilina
• 10 mL de água deionizada estéril
• Estéril filtrado e alíquota
• Armazenar a -20 ° C.
• Use a uma concentração final de 50 mcg / mL

250ug / ml anfotericina B, 4 mL

• 1mg anfotericina B
• 4 mL Et-OH
• Armazenar a -20 ° C
• Use a uma concentração final de 0,1 mg / mL

Discussão

O protocolo apresentado permite a medição de C.elegans vida em 96 placas de microtitulação. Como mostrado nos resultados representante seção, de forma confiável replica achados prévios e fornece informações quantitativas. Com este ensaio conseguimos exibido mais de 89.000 moléculas para o seu efeito sobre C.elegans vida.

Para efeitos de drogas-triagem, medindo vida em um formato de placa de 96 poços de microtitulação tem várias vantagens sobre o ensaio de mídia clássica sólido. Ele reduz o trabalho necessário para a preparação de mídia, a quantidade de espaço de incubação, ea quantidade de droga necessária. O formato de 96 poços ea instalação de microscopia permitem a automação do ensaio inteiro para exames de alto throughput.

Durante o desenvolvimento do ensaio vários valores para cada variável e suas combinações foram testadas para os seus efeitos sobre C.elegans vida. Estes testes incluíram concentração OP50 diferentes variando de 3 a 10 mg / mL (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), número diferente de worms por poço variando de 7 a 45 (7, 10, 15, 22, 45 worms / poço), os volumes de cultura diferentes que variam de 40-150 mL por poço (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), e mudanças na composição buffer. Se alimentado com uma OP50 carbenicilina resistente, nem carbenicilina nem anfotericina B nas concentrações indicadas foram encontrados para afetar C.elegans vida. Agitação suave contínuo de placas, como é frequentemente recomendada em C.elegans cultura líquida, foi encontrado dispensável para os pequenos volumes utilizados neste ensaio. Agitação suave, porém, é necessário se placas de microtitulação com poços maiores devem ser usados. Os valores indicados neste protocolo foram cuidadosamente selecionados com base na comparação estatística das diferentes condições testadas.

A característica mais surpreendente deste ensaio é provavelmente o fato de que C.elegans pode ser mantida em 96 placas de bem que são seladas com fita adesiva. Side-by-side comparações não revelaram qualquer diferença na expectativa de vida de animais cultivadas em placas sem lacre, em placas seladas com um selante plástico, ou em placas vedadas com selantes que permitem troca de ar. Em todas as três condições, os animais desenvolveram muito homogênea de L1 a adultos gravid no prazo de 65 horas e mostrou expectativa de vida muito semelhantes. Animais cresceu em paralelo em NGM desenvolveu um pouco mais rápido, mas esta diferença foi independente da ausência ou presença de um selador.

O protocolo apresentado é baseado em bactérias vivas, mas pode ser adaptado para as bactérias mortas. No entanto, em um ensaio de líquidos uma única bactéria pode sobreviver e se multiplicar rapidamente re-popular a cultura. Em nossas mãos, a única maneira confiável para matar as bactérias na medida em que eles podem ser usados ​​para a cultura líquido é de tratamento prolongado das bactérias com radiação gama.

Um ponto importante a considerar no planejamento de um experimento de vida é o poder de detecção. Depende do tamanho do efeito, o efeito da droga de interesse devem ser testados em poços múltiplos. Em um ensaio típico de 4 tratados com o fármaco e 4 poços de controlo, que corresponde aproximadamente a 40-50 animais cada, deveria ser suficiente para detectar um aumento de 30% na expectativa de vida em mais de 95% dos experimentos. Aumenta de 14% só são detectados em 60% dos casos e, portanto, exigem mais poços replicar.

A riqueza de dados gerados por este tempo de vida do ensaio pode ser usado para desenvolver experiência ou cepa específica modelos Gompertz paramétricos ^1. Estes modelos Gompertz são úteis para determinar o poder de detecção e para estimar o número de falsos positivos e negativos para grandes telas. Verificou-se as previsões destes modelos em experimentos cegos e os usou para estimar o número de falsos negativos em telas de grandes dimensões (resultados não publicados).

Em resumo, nós antecipamos que o ensaio apresentados serão de grande utilidade para identificar as moléculas pequenas que estender o tempo de C.elegans e estudar os mecanismos subjacentes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Calbiochem	cat# 171375	Also called Fungizone
FUDR	Sigma-Aldrich	cat# F0503	FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin	Sigma-Aldrich	M2525-250MG	Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine	Sigma-Aldrich	cat#C6022-MG	Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape	Nalge Nunc international	cat# 236370	Polyester, non-sterile
96 well plate	Falcon BD	cat# 351172	Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask	Nalge Nunc international	cat# 178883	used for large volumes