Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

Resumo

A ressonância magnética (RM) tornou-se uma ferramenta cada vez mais popular para examinar o fenótipo de camundongos geneticamente modificados. Este artigo ilustra os métodos necessários para alcançar alto rendimento fenotipagem de ratos geneticamente alterados usando vários mouse MRI.

Resumo

O campo de fenotipagem do mouse com a ressonância magnética (MRI) está crescendo rapidamente, motivado pela necessidade de melhores ferramentas para a caracterização e avaliação de modelos do rato da doença humana. MRI é uma modalidade excelente para investigar animais geneticamente alterados. Ele é capaz de cobertura do cérebro inteiro, pode ser usado in vivo, e fornece mecanismos múltiplos contraste para investigar diferentes aspectos da neuranatomy e fisiologia. O advento de scanners de alto campo, juntamente com a capacidade de digitalizar vários mouses ao mesmo tempo permite a fenotipagem rápida de novas mutações.

Estudos com ratos eficaz MRI requerem atenção a muitos aspectos do delineamento experimental. Neste artigo, vamos descrever métodos gerais para adquirir imagens de qualidade para fenotipagem do mouse usando um sistema que as imagens camundongos simultaneamente em freqüência de rádio blindados de transmissão / recepção (RF) bobinas em um ímã comum (Bock et al., 2003). Nós nos concentramos principalmente na fenotipagem anatômicas, uma aplicação importante e acessível, que mostrou um alto potencial de impacto em muitos modelos de ratos no nosso centro de imagem. Antes de podermos fornecer os passos detalhados para adquirir tais imagens, existem importantes considerações práticas para ambos in vivo de imagem cerebral (Dazai et al., 2004) e ex vivo de imagem cerebral (Spring et al., 2007) que devem ser observados. Estes são discutidos abaixo.

Protocolo

1. Mouse-múltiplos in vivo Brain Imaging:

Quando os animais imagens ao vivo, várias características-chave devem estar presentes durante toda a sessão de imagens: 1) um método seguro de anestesia, 2) de controle ambiental e 3) monitoração fisiológica. Além disso, os indivíduos quando imagens múltiplas em simultâneo, não são adicionados complexidades em relação a facilidade ea rapidez da preparação e da reprodutibilidade das posições animal para facilitar o registo de imagem. Conseqüentemente, três grandes componentes personalizados foram projetados e fabricados: a carga do sistema para inserir os ratos em bobinas de RF dentro da ressonância magnética, uma câmara de indução para facilitar a preparação e uma plataforma com monitoramento integrado leva para padronizar posição.

O Sistema de carregamento:

O sistema de carregamento do rato consiste de duas partes principais: o 'mouse hive' eo 'array de carga ". Função principal da colméia do mouse é posicionar sete bobinas Millipede RF (RMN Varian Systems, Palo Alto, CA) em uma matriz hexagonal dentro do magneto furo. A matriz de carregamento é projetado para manter e transportar vários mouses alojados em 50 tubos de centrífuga mililitro com furos através de suas dicas para permitir a entrada de gás anestésico. Depois de os ratos são anestesiados e interface com o equipamento de monitoramento em uma área de preparação nas proximidades do ímã, eles são inseridos os tubos de centrifugação modificado e montado sobre a matriz de carga. Depois de montar todos os ratos, a matriz de carga é transportada e inserido no ímã e posicionados em um sistema ferroviário. O sistema ferroviário permite que a matriz casal com a colméia do mouse quando pressionado para baixo o furo do ímã. Quando estiver totalmente inserido no ímã, a centrífuga doca tubos para o sistema de entrega de anestésico dentro das bobinas de RF. Isoflurano misturado com o oxigênio é fornecido a partir do final hive do mouse com o modelo através de um tubo ao longo do eixo de cada bobina individual. Esta mistura de gás anestésico fluxos dentro dos tubos, passando a ratos e é recolhido por uma unidade ativa limpeza conectado à parte traseira do conjunto de carga (Figura 1).

A Câmara de indução:

Desde os tempos de imagem pode demorar até três horas, minimizando o tempo de preparação de animais é fundamental para limitar a exposição dos camundongos à anestesia. Por isso, temos desenvolvido uma câmara de indução personalizado para agilizar o processo de preparação (Figura 2). A câmara de indução personalizado cria um ambiente único para indução e manipulação de vários mouses. Construído a partir de acrílico transparente, as características de indução de câmara fecho rápido portas silicone iris para minimizar as fugas de anestesia e permite ao usuário acessar o ambiente interno sem a necessidade de luvas especiais. Em comparação com máscara convencional e circuitos para um único rato, a câmara de indução é grande o suficiente para abrigar até vinte ratos e permite a manipulação livre dos ratos sem o anexo de tubos pesados ​​e máscaras. A unidade é fornecida com um fluxo constante de gás anestésico, que é coletado através de um sistema passivo de limpeza. Elementos de aquecimento resistivos são usados ​​para aquecer o chão da câmara para manter a temperatura corporal dos animais durante a preparação.

O Trenó:

Um dos aspectos mais difíceis e demorados de se preparar para os ratos de ressonância magnética são a aplicação de eletrocardiograma (ECG) eletrodos e sondas de temperatura retal. Além disso, muitos dos eletrodos convencionais, como o manguito e eletrodos de agulha, foram encontrados para distorcer a postura do animal, dificultando a padronização de posicionamento. Por isso, planejamos uma plataforma de posicionamento personalizado forma de embutidos equipados com ECG, respiração e sondas de temperatura chamado de "trenó" (Patente dos EUA 7.146.936) (Figura 3). Restrições de movimento feito de fechos de velcro foram usados ​​para limitar o movimento da cabeça.

Mouse-em etapas múltiplas de imagem in vivo do cérebro:

1. Todas as pesquisas locais mouse requer ACC (Comitê Animal Care), a aprovação IACUC (Animal Care Institucional e Comitê Use) ou equivalente para os procedimentos de manuseio do mouse.
2. Todos os procedimentos, tais como identificação e pesagem dos animais deve ser realizada sob um Gabinete de Segurança Biológica (CSB) e na Unidade de ressonância magnética. Os animais são transferidos para um recipiente de plástico autoclavável e transportados para a câmara de indução de ressonância magnética.
3. Os ratos são anestesiados em uma câmara de indução pré-aquecida com 4% de isoflurano e 4 L / min de oxigênio. Os animais são completamente anestesiados, uma vez que não respondem ao pinch pata. Pêlo do peito é removido através de um removedor de pêlos (NAIR) se necessário para proporcionar um melhor contato com ECG e dispositivos de monitoramento de temperatura que foram construídas em um trenó personalizado. Eve salve (Lágrimas Naturale PM) é aplicada para os olhos para evitar a secagem, e aproximadamente 0,3 mL de solução salina é administrada por via subcutânea para manter a hidratação.
4. Gd-DTPA-BMA (Omniscan) podeser usado se realce de contraste é desejada. Se Gd-DTPA é para ser usado, ele vai ser diluído em soro fisiológico (volume final 300uL) e administrado em uma dose única de 1 mmol / kg antes da sessão de MR via IP.
5. Os ratos são depois carregados em trenós individuais, imobilizados com tiras de cabeça e deslize em open-ended tubo cônico 50mL (Figura 3). Até 7 camundongos vivos podem ser digitalizados em uma hora. Uma vez que todos os animais são carregados com monitoração fisiológica conectado, defina o nível de isoflurano no ímã furo a 2% eo nível de oxigênio a 8 L / min.
6. Os tubos cônicos são montados em um sistema de encaixe (Figura 1) projetado para ratos posição uniformemente em cada bobina RF posicionado no centro do magneto furo. Uma vez carregado, o isoflurano pode ser reduzida a 0,9-2%. ECG e temperatura são monitoradas em cada animal durante todo o curso da verificação. Os animais são mantidos aquecidos durante o curso da verificação com o ar aquecido.
7. A duração de cada scan tridimensional é de aproximadamente 3 horas. Os detalhes são os seguintes: spin echo rápido com TR de 2300 ms e um TEeff de 36 ms. Echo comprimento do comboio de 8 com uma média. Resolução de imagem resultante é de 125 mM (Figura 4).
8. Quando a pesquisa estiver concluída, os animais são removidos do ímã e descarregado em uma câmara de indução morna preenchido com oxigênio a 100%. Os animais são transferidos para um recipiente de plástico selado e transportado em um BSC. Eles são colocados em uma gaiola projecto quente livre e permitiu a recuperação da anestesia.

2. Múltipla do mouse ex Brain Imaging vivo:

Afetado por artefatos de movimento, fixa RM atinge resolução maior do que imagens ao vivo. De alta resolução, tridimensional conjuntos de dados oferecem flexibilidade máxima na extração de informações quantitativas e permitir a análise de imagem automática. Uma matriz bobina personalizado RF foi desenvolvido para a aquisição de 16 conjuntos de dados paralela de alta resolução de MR-crânio fixado em cérebros de camundongos durante a noite sessões de digitalização.

Os 16 ex-Coil vivo Matriz Brain Imaging:

A custom-built conjunto solenóide 16-coil foi criado à imagem de 16 amostras simultaneamente. Este projeto aperfeiçoa um protótipo anteriormente utilizado para a imagem de três amostras simultaneamente em um conjunto de 60 milímetros inserir gradiente. As bobinas de 8 turn-solenóides são mais de feridas nas extremidades para fornecer sensibilidade uniforme dentro de 10% em relação a um comprimento de 26 milímetros e são blindados individualmente dentro de compartimentos modulares (Idziak e Haeberlen, 1982). Os 16 compartimentos da bobina são montados em um frame (Figura 5), ​​que posiciona as bobinas dentro do gradiente e grampos no lugar usando uma bexiga pneumática para minimizar o movimento.

Múltipla do mouse ex vivo de imagens do cérebro passos:

1. Cavidade torácica aberta e inserir a agulha (ou Segurança de perfusão Winged, 25G X 3 / 4) para o ventrículo esquerdo do coração de um rato anestesiado (via injeção intraperitoneal de cetamina (150 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) . Corte a aurícula direita.
2. Transcardíaca perfusão nivelado com 30 quartos temporários mL PBS 1 X + 1 mL / mL de heparina (1000 unidades USP / mL) + ProHance mM 2 a uma vazão de aproximadamente 100 mL / hr.
3. Passar fixação com 30 mL PFA 4% (temperatura ambiente) + ProHance mM 2 em 100 mL / hr.
4. Decapitar e remover a pele, mandíbula, orelhas, ponta do nariz cartilaginoso.
5. Coloque estrutura craniana restantes em 4% PFA + ProHance mM 2 overnight a 4 ° C.
6. Transferência para 1X PBS + 0,02% de azida de sódio + ProHance mM 2.
7. De alta resolução de varredura três dimensões de ressonância magnética em 7 Tesla ocorre entre 4 dias e não superior a 2,5 meses após a perfusão. Cérebros são colocados em uma matriz de bobina de 16 canais solenóide (Figura 5).
8. Parâmetros de imagem são os seguintes: spin echo rápido com TR 325 ms e um de 30 ms TEeff comprimento do comboio, echo de 6 com 4 médias. As imagens finais têm uma resolução isotrópica de 32 mM (Figura 6) ea duração da verificação é de aproximadamente 12 horas.
9. Após a digitalização, coloque o crânio em formalina a 10% + 2 ProHance mM para a preservação.

3. Resultados representativos:

Figura 1. O sistema de carregamento mouse. A "matriz de carga" e "mouse colméia" conectado com um sistema comum de fibra de vidro ferroviário.

Figura 2. A câmara de indução.

Figura 3. A) O trenó, mostrando sensores de monitoramento integrado e apoio de cabeça. b) Um rato anestesiado em um trenó com o apoio de cabeça em anexo. O conjunto de trenó desliza facilmente para dentro do tubo de centrífuga.

Figura 4. Representante in vivo imagens múltiplas do cérebro de um scan 3 horas tridimensional.

Figura 5. 16 canais série bobina para a digitalização de 16 amostras do cérebro fixo.

Figura 6. Imagem do cérebro Representante ex-vivo.

Discussão

Tanto in vivo e ex vivo do mouse imaging assuntos imagem múltiplos sistemas de uma só vez para aumentar o rendimento de estudos de imagem consideravelmente, sem aumentar o tempo de imagem. As imagens do cérebro de ambos os in vivo e ex vivo várias técnicas mouse-imagem são de alta qualidade e são adequados para fenotipagem estruturas maiores e menores no cérebro do rato, respectivamente.

Para minimizar o tempo de preparação de espécimes animais múltiplas, a paralelização de processos é de extrema importância. Por exemplo, o desenvolvimento da câmara de indução permitiu a indução de amostras simultaneamente, o trenó e sincronizou a aplicação do ECG e sondas de temperatura ao padronizar o posicionamento do corpo. Além disso, nosso sistema de imagem ex vivo permite-nos adquirir alta resolução imagens tridimensionais, de 16 de fixos cérebro todo de uma só vez o que é ideal para estudos de fenotipagem de alto rendimento.

Possíveis limitações do nosso sistema de imagem in vivo incluem a incapacidade de controlar individualmente anestésico e temperatura para cada rato. Se necessário o controle anestésico individuais podem ser implementadas com a adição de vaporizadores anestésicos exclusivo para cada rato. Outra limitação do sistema de imagem in vivo é que a digitalização é restrita a camundongos que são menos do que aproximadamente 32 gramas. No entanto, há um plano atualmente para aumentar o tamanho da bobina para acomodar animais maiores.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP (AErrane)	Baxter Internationl Inc.	CA2L9108
NAIR	Church & Dwight Co.
Tears Naturale P.M.	Alcon	DIN 02082519
Omniscan (gadodiamide injection USP)	GE Healthcare	J-110A
Custom Sleds	Dazai Research Instruments
PBS w/o Ca and Mg	Wisent Inc.	311-010-CL
Heparin 10000USP/10ml	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02264315
ProHance (gadoteridol injection USP)	Bracco Diagnostics	11181
Parafolmadehyde (powder)	Sigma-Aldrich	P-6148-500g
Sodium Azide	Fisher Scientific	S227-100
Formalin 10%	Fisher Scientific	SF100-4