Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

Resumo

Neste vídeo, demonstramos a visualização da translocação da PKC em células vivas usando PKCs fluorescente etiquetado.

Resumo

Proteína quinase Cs (PKCs) são serina treonina quinases que desempenham um papel central na regulação de uma ampla variedade de processos celulares como crescimento celular e aprendizagem e memória. Há quatro famílias conhecidas de isoformas da PKC em vertebrados: PKCs clássica (α, βI, βII e γ), tipo romance que PKCs (ε e η), novo tipo II PKCs (δ e θ), e PKCs atípicos (ζ e ι ). O PKCs clássica são ativadas por Ca ^{2 +} e diacylclycerol (DAG), enquanto o PKCs romance são ativadas por DAG, mas são Ca ^{2 +-independente.} O PKCs atípicos são ativadas por Ca ^{2 +} nem nem DAG. Em Aplysia californica, o nosso sistema modelo para estudar a formação da memória, há três isoformas específicas do sistema nervoso PKC um de cada classe principal, ou seja, o convencional PKC Apl I, o novo tipo I PKC Apl II ea PKC atípica Apl III. PKCs são lipídios cinases ativadas e, portanto, a ativação de PKCs clássica e romance em resposta a sinais extracelulares tem sido freqüentemente correlacionada com a translocação da PKC do citoplasma para a membrana plasmática. Portanto, visualizando translocação da PKC em tempo real em células vivas tornou-se uma ferramenta valiosa para a elucidação das vias de transdução de sinal que levam à ativação da PKC. Por exemplo, esta técnica permitiu-nos estabelecer que diferentes isoformas da PKC translocate sob diferentes condições de mediar tipos distintos de plasticidade sináptica e que a serotonina ativação (5HT) da PKC Apl II requer a produção de ambos os DAG e ácido fosfatídico (PA) para translocação ^02/01. Importante, a capacidade de visualizar o mesmo neurônio repetidamente nos tem permitido, por exemplo, para medir a dessensibilização da resposta PKC no requintado detalhe ^3. Neste vídeo, demonstramos cada etapa de preparação de culturas de células Sf9, culturas de neurônios sensoriais Aplysia foram descritas em outro artigo de vídeo ^4, expressando PKCs fluorescente etiquetado em Sf9 células e nos neurônios sensoriais Aplysia e live-imaging de translocação da PKC em resposta a ativadores diferentes, utilizando microscopia de varredura a laser.

Protocolo

1. Preparação e manutenção de culturas monocamada de células Sf9

1. Sf9 cultura de células e manutenção é realizada em uma capa de cultura de tecidos.
2. Sf9 células são derivadas de células de ovário de Spodoptera frugiperda (Sf21 células) e podem ser comprados como células congeladas em meio Grace da Invitrogen.
3. Lugar de 8 mL de meio de insetos de Grace, completados, a que 30% de soro fetal bovino (FBS) foi adicionada em um balão de 75 centímetros cultura ² celulares com o pescoço inclinado. (1X)
4. Descongelar o tubo congelado de células Sf9 rapidamente em banho-maria a 37 ° C, movendo o tubo de ida e volta (cerca de 1-2 minutos).
5. Transferência de células Sf9 para a 75 centímetros garrafa de cultura celular e ^duas placas de rocha suavemente com a mão para distribuir uniformemente as células.
6. Incubar de 1-2 horas a 27 ° C até que as células têm em anexo.
7. Remova o meio de idade e substituir com 10 mL de meio de insetos freshGrace com 30% FBS.
8. Incubar a 27 ° C até que as células são confluentes.
9. Para manter as culturas em monocamada, remova o meio de idade do frasco confluentes de células Sf9 e adicionar 5 mL de meio de insetos de Grace com 10% de FBS.
10. Toque levemente no lado do frasco várias vezes para retirar as células Sf9.
11. Usando uma pipeta 10 mL e uma pipeta, pipetar os meios de comunicação para cima e para baixo uma vez gentilmente, pulverização parede frasco enquanto pipetagem para baixo. Transferência das células para um tubo estéril 15 ml poliestireno.
12. Adicione 2 mL da suspensão de células Sf9 a 8 mL de meio de insetos de Grace com 10% FBS (1:5 diluição para manter o crescimento fase log) em novos 75 centímetros garrafa de cultura celular e ^duas placas de rocha suavemente com a mão.
13. Incubar a 27 ° C até que as células são confluentes.

2. Expressão de PKCs fluorescente Tagged em Células Sf9

1. Para a imagem live-experiência, cultura de células Sf9 em 35 milímetros de vidro de fundo Mattek cultura disheswith uma superfície de vidro de 14 mm e uma espessura de lamela 0,16-0,19 mm.
2. PKCs marcadas com proteínas fluorescentes são expressos em células Sf9 usando Cellfectin II recomendação de reagentes de transfecção seguintes do fabricante, com as modificações detalhadas abaixo.
3. Dia 1: Antes de revestimento das células, tratar cada prato Mattek com meio de insetos de Grace com FBS 10% para pelo menos 30 minutos.
4. Contagem de células Sf9 a partir do passo 11 (acima), utilizando um hemocitômetro.
5. Placa de 0,05 x 10 ⁶ células em cada lamela de vidro Mattek em um volume total de 150 mL. Permitir que as células para anexar por 30 minutos em temperatura ambiente.
6. Adicionar 2 mL de Grace suplementado com 10% de SFB a cada mL prato 1 de cada vez lentamente para evitar separar as células.
7. Incubar a 27 ° C durante a noite.
8. Deste ponto em diante, use a recomendação do fabricante para a transfecção de células Sf9 com DNA plasmidial.
9. Dia 2: transfecção Sf9 células com PKCs fluorescente etiquetado usando Cellfectin reagente transfecção II. Temos muitas vezes co-expressas neste sistema PKCs marcados com Proteína Verde Fluorescente melhorada (eGFP) e proteína monomérica Vermelho Fluorescente (MRFP) (detalhes para a construção do plasmídeo foram previamente descritos ^2,5). Expressão de uma proteína fluorescente de uma vez produz cerca de 70-80% expressar células 72 horas pós-transfecção. Co-expressão de duas proteínas fluorescentes diminui a eficiência de transfecção para cerca de 30% de co-células que expressam. Quando co-expressando eGFP marcadas PKC e MRFP marcadas PKC, use 2x mais DNA do plasmídeo para a proteína MRFP-marcadas para a expressão da proteína ideal.
10. Executar ao vivo de imagens de 48-72 horas pós-transfecção (para a expressão da proteína ideal, esperar 72 horas).

3. Expressão de PKCs fluorescente nos neurônios Tagged Aplysia Sensorial

1. Preparação de culturas de células Aplysia neuronal tem sido descrita em um artigo de vídeo por Zhao e ⁴ colegas.
2. PKCs marcadas com proteínas fluorescentes são expressos em neurônios sensoriais Aplysia usando procedimento de microinjeção detalhadas abaixo.
3. Prepare uma solução estoque de 1% Verde Fast (FCF) em água destilada, filtro usando uma seringa e uma seringa de 28 milímetros filtro (0,20 m). Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
4. Microinjeção dos neurônios sensoriais pode ser realizada no dia 1 ou 2 dias depois de isolar os neurônios mas nós achamos que esperar dois dias permite melhor adesão celular para a lamela.
5. No dia 2 após o isolamento dos neurônios sensoriais, descongelar uma alíquota do Verde Fast e filtrá-la novamente usando uma seringa e uma seringa de 28 milímetros filtro (0,20 m).
6. Prepare uma solução de DNA plasmidial em água destilada contendo 0,5% Verde Fast. Concentrações de DNA plasmídeo tão alto quanto 0,4 g / mL pode ser usado, mas não é recomendável ir acima desses valores.
7. Filtrar o DNA plasmidial / solução Verde rápida usando uma seringa de 1 mL e um filtro de seringa de 4 milímetros (0,20 m).
8. Centrifugar o DNA plasmidial / solução Verde rápida a 16.110 xg por 15 minutos, utilizando um microfonerocentrifuge.
9. Prepare eletrodos afiada para microinjeção de neurônios utilizando um extrator de microeletrodos (Sutter Flaming / Brown Micropipeta Puller, modelo P-97). Utilizando um filamento de caixa, puxe microeletrodos de vidro com 1 mm de diâmetro externo, 0,75 mm de diâmetro interno e 100 mm de comprimento com parede fina capilares de vidro com um filamento dentro (World Precision Instruments TW100F-4). Para mais informações sobre puxando eletrodos microinjeção consulte cookbook eletrodo Sutter.
10. Preencha cada eletrodo com 2 mL de DNA plasmídeo / solução rápida usando Verde microloader pipeta ponta (eppendorf CA32950-050).
11. Transferir o vidro Mattek placa de cultura de fundo contendo culturas Aplysia neuronal para a estação de microinjeção.
12. A estação de microinjeção consiste no seguinte: um home-made estágio copo grande para manter os pratos da cultura em uma mesa de isolamento de vibração (Kinetic Sistemas de estação de trabalho de isolamento de vibrações), um aparelho de som com escopo de iluminação halógena externo, um micromanipulador (Sutter Huxley micromanipulador tipo de parede que permite o posicionamento tanto grosseiro e ultra-fino nos três eixos), um suporte de microeletrodos conectado a uma bomba pneumática (Instrumentos de Precisão Mundial PV820 Pneumatic Pico-Bomba). A entrada de pressão da bomba pneumática é conectado a um tanque de nitrogênio comprimido.
13. Inserir um microeletrodo no suporte de microeletrodos.
14. Visualização sob um estereomicroscópio, introduza a ponta da micropipeta no núcleo da célula.
15. Entregar pulsos de pressão curto de nitrogênio (10 a 100 ms de duração, 20 lb / pol ²⁾ até o núcleo torna-se uniformely verde.
16. Incubar as células durante 4 horas à temperatura ambiente e manter a 4 ° C até o uso. Para a translocação da PKC ideal, tocar ao vivo de imagens experimento 20-24 horas após a injecção.

4. Visualização da translocação da PKC em células Sf9 Vivendo e em neurônios sensoriais Aplysia

1. Para geração de imagens, nós usamos um microscópio invertido Zeiss LSM510 confocal com um 200 Axiovert.
2. Protocolo de imagens é a mesma para células Sf9 e para os neurônios sensoriais Aplysia, exceto para o seguinte: Sf9 células são gravadas com uma objetiva de imersão X63 óleo enquanto neurônios sensoriais Aplysia são gravadas com um objetivo de imersão em óleo x40. Sf9 células são gravadas em uma câmara com temperatura controlada mantida a 26-27 ^º C enquanto que os neurônios sensoriais Aplysia são gravadas em temperatura ambiente mantida em torno de 18-20 ^º C.
3. Nós usamos um laser de argônio 30 mW (excitação em 488nm), com saída do laser de 50% a PKC imagem marcada com eGFP proteína e um laser HeNe (excitação em 543nm) para PKC imagem marcada com a proteína MRFP. A Argon e linhas de laser HeNe são atenuadas a 4% e de saída da transmissão de 50%, respectivamente, antes da imagem e do pinhole é ajustado para um.
4. É importante ter a placa de cultura estabilizado no palco de imagem e para evitar o movimento ou vibração.
5. Retire 1 mL de meios de cultura do prato com cuidado usando uma pipeta 10 mL deixando um volume de mL total no prato.
6. Tire fotos na seção intermediária das células onde o núcleo pode ser visto.
7. Configurar uma série temporal de 10-20 imagens confocal de tirar uma foto a cada 30 segundos.
8. Iniciar a série de tempo.
9. Depois de 2 fotos são tiradas (após o ponto de tempo de 30 segundos), adicione 1 mL da droga (2X concentração) suavemente gota a gota, em cima das células utilizando uma pipeta P1000. A droga é adicionada continuamente por cerca de 30 segundos.
10. Algumas drogas induzem uma rápida translocação, que pode ser visível imediatamente após o tratamento medicamentoso (no ponto de tempo de 60 segundos), enquanto outros induzem uma translocação lenta que só é ideal 5-10 minutos pós-tratamento (Filme 1 e Filme 2).
11. Se o medicamento precisa ser lavado, use 2 x 10 mL pipetas para fazer a lavagem, pipetagem do tampão de lavagem suavemente com uma pipeta de um lado do prato e pipetagem até a mídia do outro lado.
12. Se a lavagem tem sido eficaz e se o efeito da droga é reversível, PKC reverte para o citosol dentro de 30-60 segundos.
13. Salve o filme como um arquivo de LSM.
14. Use software NIH Image J para abrir os arquivos LSM e quantificar as imagens pré e pós tratamento medicamentoso. Quantificação tem sido descrito em outros lugares ^1.

Discussão

Nós descrevemos uma técnica para translocação imagem de PKCs fluorescente etiquetado em tempo real em Sf9 células e nos neurônios sensoriais Aplysia. Sf9 células fornecer um sistema simples de translocação imagem PKC desde cultura e transfecting deles é bem simples. Em contraste, a microinjeção de neurônios sensoriais Aplysia leva algum tempo para dominar, até alguns meses. Dificuldades relacionados a essa técnica incluem o entupimento do eletrodo. Filtragem da solução de injeção e c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	BD Biosciences	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	BD Biosciences	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Part of microinjection station
Micr–lectrode holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter Instrument Co.	MP-85	Use to position micr–lectrode in the three-axis