1. Preparando o MRSA de Infecção (dois dias antes da infecção)
- Inocular uma loopful de MRSA de uma cultura de ações a um agar sangue (Trypticase Soy Agar (TSA)) prato.
- Verificar o fenótipo hemólise (uma zona clara em torno de cada colônia) na placa de ágar sangue.
- Escolha uma colônia que tem um fenótipo hemolítico que é consistente com outros experimentos.
- Inocular a colônia em 3 mL Todd Hewitt Broth (THB), com o antibiótico apropriado quando necessário, em um tubo de 15 mL snap-tampado.
- Incubar a 37 ° C durante a noite com agitação a 220 rpm.
2. Preparando o Ratos de Infecção (um dia antes da infecção)
- Dependendo do tamanho dos ratos, raspar os pêlos fora de uma área de 3 cm x 4 na parte traseira de ratos.
- Aplicar ~ 5 mm 3 creme removedor de pêlos (comprado de uma loja de droga local) para a área depilada.
- Permitir que o creme removedor de pêlos para incubar na superfície da pele por cerca de 1 min.
- Toalhas de papel molhado com DDH 2 O.
- Limpe o creme removedor de pêlos com a toalha de papel molhado.
3. Preparando o MRSA de Infecção (no Dia da infecção)
- Diluir a cultura bacteriana durante a noite em 1:500 para 1:1000 com 10 mL de pré-aquecido THB, em um tubo de 50 mL com tampa de rosca.
- Incubar a 37 ° C por aproximadamente 2,5 horas com agitação de 220 rpm, até A 540 chega a 2,5.
- Coletar MRSA por centrifugação a 3225 xg por 10 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento de bactérias em 10 mL de fosfato salina tamponada Dulbecco (DPBS).
- Repita os passos 3 e 4.
- Ressuspender o pellet bacteriano em DPBS na concentração desejada.
- Serialmente diluir a suspensão bacteriana de 10 janeiro - 10 agosto.
- Placa bacteriana diluída a suspensão em placas de agar sangue.
- Incubar as placas a 37 ° C durante a noite.
- Observar e registrar o fenótipo hemolítico do inóculo.
- Contar as Unidades Formadoras de Colônias (UFC) número da placa.
- Calcular o inóculos com base no número de UFC na placa.
4. Infecção subcutânea de MRSA (no Dia da infecção e 3 dias pós-infecção)
- Injetar por via subcutânea 100 mL de suspensão bacteriana na área raspada.
- Observar os animais de 3 a 5 horas após a injecção para se certificar de que os ratos estão vivos.
- Observe a lesão nas costas dos animais diariamente e registrar a área de lesão ao dia, quando ela é necessária. Observação lesão deve incluir a gravação do tamanho da lesão e morfologia. A pele e as lesões musculares são quantificada pela multiplicação do comprimento e largura da lesão. Lesões de formato irregular precisa ser dividido em pequenos pedaços simétricos, e cada peça medida pelo mesmo método. Medições lesão também pode utilizar um assistida por computador programa de avaliação histomorfométrica (ImageJ; open-source disponível a partir do NIH em http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) 2.
- Sacrifício dos animais no dia 3 pós-infecção por inalação de isoflurano seguido por deslocamento cervical.
- Observar e registar a lesão na pele.
- Nick a pele com uma tesoura esterilizada.
- Descasque a pele fora cuidadosamente e observar e registar a lesão no músculo.
- A lesão de consumo e cerca de 2-5 mm da área circundante.
- Coletar baço e rins.
- Homogeneizar os tecidos utilizando um homogeneizador de tecido ou pela aplicação repetida de um êmbolo de uma seringa de 1 mL para um tubo de microcentrífuga contendo o tecido e 100 mL de DPBS.
- Adicionar 900 mL de DPBS a cada tubo.
- Vortex as amostras por 5 min.
- Serialmente diluir a suspensão com DPBS 10 janeiro - 10 junho.
- Placa de suspensões diluídas em placas THA.
5. Resultados representativos:
- Imediatamente após cada injecção subcutânea, uma bolha será observada na superfície da pele quando a infecção é feito corretamente (Figura 1A). Se nenhuma bolha é observada na superfície da pele, a injeção pode ser muito profunda, e isso pode afetar o resultado da infecção (o tamanho da lesão, CFU).
- A suspensão bacteriana precisa ser diluída em série e do UFC precisam ser examinadas em placas de ágar sangue para cada experimento. Esta etapa irá fornecer informações importantes: 1) se o inóculo têm fenótipo homogêneo; 2) a contagem de bactérias viáveis exata para a infecção.
- As lesões e sobrevivência bacteriana pode ser avaliada em vários pontos do tempo pós-infecção. Aqui, nós examinamos a infecção no 3 º dia pós-infecção. Os tamanhos são analisados lesão na superfície da pele (Figura 1B: 1x 10 9; Figura 1D: 1 x 10 7 UFC) e na superfície do músculo (Figura 1C: 1x 10 9 ; Figura 1E: 1 x 10 7 UFC). A área de lesão é igual ao comprimento (mm) x largura (mm) podem ser medidos para avaliar o dano tecidual (Figuras 2 A e B). Este resultado pode ajudar a determinar a extensão do dano tecidual causado por um fator de virulência dado. Além disso, as lesões são retirados e homogeneizados em DPBS, e banhado para quantificar o número de CFU (Figura 2C), que indica a viabilidade da bactéria no local da infecção.

Figura 1. A pele e as lesões musculares. CD1 camundongos foram inoculados por via subcutânea em um flanco com MRSA (LAC). Fotos foram tiradas em 0 hora e dia 3 pós-infecção. (A) Tempo 0 pós-infecção (pi), (B) - (G) 3 º dia pi; B, D. e F: lesões de pele; C, E e G: lesões musculares, B e C: 1x 10 9 CFU infectados; D e E: 1x 10 7 UFC infectados; F e G: mock.

Figura 2. Tamanho da lesão de pele e bactérias viáveis contar no local da infecção no 3 º dia pós-infecção de pele. E lesões musculares em MRSA (LAC) CD1 infectados camundongos. (A) tamanho da lesão de pele. (B) tamanho da lesão muscular. (C) CFU tecido Total. H: 1 x 10 9 UFC inóculos; L: 1 x 10 7 UFC inóculos. *: P <0,05, Mann-Whitney.