Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

Resumo

O Virochip é um microarray pan-viral projetado para detectar simultaneamente todos os vírus conhecidos, bem como novos vírus, com base em homologia de seqüência conservada. Aqui demonstramos como executar um ensaio Virochip para analisar amostras clínicas para a presença de vírus conhecidos e desconhecidos.

Resumo

O diagnóstico de causas virais de muitas doenças infecciosas é difícil devido à diversidade inerente seqüência de vírus, bem como o surgimento contínuo de novos patógenos virais, como a SARS coronavirus e 2009 pandemia de H1N1 do vírus influenza, que não são detectáveis ​​através de métodos tradicionais. Para enfrentar esses desafios, temos desenvolvido e validado previamente uma plataforma de microarray pan-viral chamado de Virochip com a capacidade para detectar todos os vírus conhecidos, bem como variantes de romance com base na homologia de seqüência conservada ^1. Usando o Virochip, identificamos o espectro de vírus associados com infecções respiratórias, incluindo casos de doença grave inexplicável em pacientes hospitalizados, com uma sensibilidade igual ou superior a ^2-5 testes clínico convencional. O Virochip também tem sido usado para identificar novos vírus, incluindo o coronavírus SARS ^6,7, um clade rinovírus romance ^5, XMRV (um retrovírus ligado ao câncer de próstata) ^8, bornavirus aviária (a causa de uma doença degenerativa nos papagaios) ^9, Cardiovirus e um romance em crianças com doenças respiratórias e diarréicas ^10. A versão atual do Virochip foi portado para uma plataforma de microarray Agilent e consiste de aproximadamente 36.000 sondas derivados de ~ 1.500 vírus no GenBank a partir de dezembro de 2009. Aqui demonstramos as etapas envolvidas no processamento de um ensaio Virochip do início ao fim (~ o ​​tempo de resposta 24 horas), incluindo amostras de extração de ácidos nucléicos, amplificação por PCR usando primers aleatórios, incorporação de corantes fluorescentes, e hibridação microarray, digitalização e análise.

Protocolo

As etapas do ensaio Virochip incluem (1) a extração de ácidos nucléicos a partir de amostras clínicas, (2) transcrição reversa do RNA extraído e 2 ^ª vertente de síntese-cDNA, (3) amplificação por PCR de cDNA preparado de forma aleatória, (3) Cy3 incorporação corante fluorescente (4), a hibridização de material marcado para o microarray Virochip, e (5) de varredura e análise (Figura 1). O protocolo mostrado abaixo irão demonstrar o uso do ensaio Virochip em uma amostra swab nasal de uma criança com uma doença semelhante à gripe.

Seqüências Primer

Primer A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA (N ₉₎ -3 '

Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '

1. Extração de ácido nucléico

1. Extração de ácidos nucléicos de amostras clínicas devem ser realizadas sob o Nível de Biossegurança 2 (NB-2) ou em condições mais elevadas, uma vez que estas amostras são potencialmente infecciosos.
2. O swab nasal amostra é transportada em meio de holding viral. Alíquota de 200 mL da amostra em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL Eppendorf.
3. Opcional: pass amostra através de um filtro mM 0,22 (purificar para partículas virais)
4. Opcional: amostra pré-tratamento com DNAse (a degradar DNA genômico de host e purificar para protegidas, o ácido nucléico viral encapsidated), utilizando o kit Turbo DNAse (Ambion) por instruções do fabricante
5. Extrair a amostra usando o Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit ou Kit Qiagen Virus UltraSens acordo com as instruções do fabricante.

2. Transcrição reversa e 2 ^ª vertente de síntese-CDNA ("Round A")

1. Adicione 1 uL Primer 40 pmol / mL A a 4 uL extraído RNA. Calor a 65 ° C por 5 min em um termociclador (por exemplo, GeneAmp PCR System 9700) e, em seguida, deixe esfriar em temperatura ambiente x 5 min.
2. Adicionar 5 mL de uma mistura principal consiste em 2 mL tampão RT 5X, 1 mL 12,5 mM dNTP, 1 mL de água, 0,5 mL 0,1 M DTT, e 0,5 mL SSIII RT (Invitrogen). Incubar a 42 ° C x 60 minutos.
3. Em um termociclador programável, o calor a 94 ° C x 2 min (para abortar a reação da transcriptase reversa), arrefecer até 10 ° C, centrífuga, pulso e, em seguida, adicionar 5 mL Sequenase mix composto por um tampão 5X Sequenase mL, 3,8 mL de água, e 0,15 mL Sequenase (USB Corporation). Para 2 ^ª vertente de síntese, rampa acima de 10 ° C a 37 ° C por 8 min, segure 8 min, então o calor a 94 ° C min x 2 (para inativar Sequenase) e arrefecer a 10 ° C (espera).
4. Opcional: Rd Uma amostra de cDNA podem ser armazenados neste momento a -20 ° C.

3. Amplificação por PCR do CDNA aleatoriamente Primário ("Round B")

1. Adicionar 5 uL de Rd Uma amostra de 45 mL de uma mistura principal composto de 5 mL tampão PCR 10X, 1 mL 12,5 mM dNTP, 1 mL 100 B cartilha pmol / mL, 1 mL KlenTaq LA (Sigma), e 37 mL de água.
2. Executar PCR protocolo da seguinte forma: 94 ° C, 2 min → (25 ciclos de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( espera)
3. Verifique o Rd amostra B em um gel de eletroforese de agarose 1,5%. Uma mancha de cerca de 200 - 1000 bp deve ser visualizada (Figura 2A)

4. Cy3 Incorporação corante fluorescente

1. Opcional: outra amostra podem ser rotulados com o corante fluorescente e Cy5 hibridizado ao microarray mesmo.
2. Para incorporar aa-dNTP, adicionar 5 uL de amostra Rd B a 45 uL de uma mistura principal, composto por 5 tampão PCR 10X uL, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL cartilha B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma) e 37 uL de água. Executar PCR protocolo da seguinte forma: 94 ° C, 2 min → (15 ciclos de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( espera)
3. Limpe o Rd amostra C com o DNA Limpo e Concentrador-5 Kit (Zymo Research) por instruções do fabricante. Eluir em 10 mL.
4. Adicione 1 uL de bicarbonato de 1M (Sigma) e 1 uL Cy5 (GE Healthcare) para a amostra C Rd.
5. Incubar x 1 hora no escuro.
6. Limpe a amostra Cy3 marcado com o DNA Limpo e Concentrador-5 Kit (Zymo Research) por instruções do fabricante. Eluir em 12 mL.

5. Hibridização para Virochip Microarray

1. Opcional: usar 1,5 mL para verificar a concentração de cDNA e da quantidade de corante incorporado em um espectrofotômetro Nanodrop (para normalização das amostras)
2. Em um tubo de strip PCR adicionar 1 mL de buffer fragmentação 25X, 5 mL tampão 5X bloqueio, 9,5 mL (ou quantidade de normalizar) de Cy3 marcado amostra, e água a um volume total de 25 mL (Agilent)
3. Adicionar 25 mL de tampão de hibridização 2X GEX (Agilent). Girar rapidamente para remover as bolhas.
4. Carga 40 mL da amostra em slides junta.
5. Lugar Agilent-impressos série Virochip (Universidade de California, San Francisco / Agilent) (lado marcado "Agilent" para baixo) em cima do deslize junta e aperte o parafuso firmemente.
6. Hibridizar durante a noite em 65 ° C forno, ajuste de velocidade de 10 rpm.
7. Para lavar matrizes, pré-aqueça tampão 2 (Agilent) a 37 ° C. Desmonte subaquático junta corrediça / array sanduíche em tampão 1 (Agilent). Lavar em tampão 1 x 1 min. Lavar em tampão pré-aquecido 2 x 1 min. Remover lentamente deslize do buffer 2, tendo o cuidado de evitar bolhas (use kimwipe para espalhar a umidade extra tendo cuidado para evitar tocar directamente lado ativo da matriz)
8. Lugar de slides no suporte de slides e inserir em scanner matriz.

6. Virochip Digitalização e Análise

1. Varredura Cy3 marcado matriz em 5 mm ou 2 mm de acordo com o protocolo do instrumento de rastreamento padrão (Figura 2B).
2. Analisar microarrays Virochip por inspeção visual, análise de cluster, ou o programa de análise automatizada Virochip, E-Predict ^11. Por cada um desses três métodos, o vírus influenza é facilmente detectada na amostra swab nasal (de uma criança com doença semelhante à influenza) (Figura 2C)

7. Resultados representativos:

Quando o protocolo é feito corretamente, uma mancha deve ser visto na eletroforese em gel de agarose após a etapa B Rd (Figura 2A). O microarray Virochip na plataforma Agilent será difícil analisar visualmente (Figura 2B), mas se um vírus estiver presente, deve ser facilmente identificado por inspeção visual, análise de cluster, e / ou E-Predict (Figura 1C). As amostras podem ser incrementadas com quantidades medidas de ácido nucléico de um vírus conhecido (por exemplo, vírus do mosaico do tabaco; MS2 bacteriófago) para servir como um controle positivo para o ensaio.

Figura 1. Esquemática do processamento de microarray Virochip e análise. Extraído de ácidos nucléicos a partir de amostras clínicas são amplificados aleatoriamente, marcados com corantes fluorescentes e hibridizada com o microarray Virochip. Microarrays são digitalizadas com resolução de 2 mm e analisados ​​utilizando uma variedade de ferramentas computacionais, incluindo E-Predict.

Figura 2. Passos no ensaio Virochip Após a amplificação por PCR aleatória, uma mancha de 200 -. 1000 bp pode ser visualizado por eletroforese em gel (A) (B) Três microarrays Virochip dos 8 matrizes / lâmina de vidro são mostradas, com uma pequena região. de um microarray blown-up na inserção no canto inferior direito. (C) Automated análise microarray viral usando E-Predict revelando a presença do vírus influenza A na amostra clínica. A pontuação alta similaridade (s = 0,55) corresponde a um p-valor que é próximo de zero, tornando esta uma previsão extremamente significativo.

Discussão

O protocolo Virochip como descrito aqui é complexo e requer um técnico de pesquisa meticulosa e qualificados. Concentração de reagentes corretos e as condições de PCR, rotulagem, e hibridação são críticos. O protocolo Virochip pode ser facilmente modificado para acomodar a análise de tecidos doentes pelo uso de um método de extração de tecidos, tais como TRIzol (Invitrogen) para a extração de ácidos nucléicos. Sondas podem ser adicionados ou excluídos conforme necessário para obter o espectro desejado e amplitude de cobertura, por exemplo, sondas para detecção de alvos não-virais, tais como bactérias e fungos podem ser projetados e acrescentou "on-the-fly". Algumas aplicações do ensaio Virochip atualmente em desenvolvimento incluem de amplo espectro de diagnóstico viral em laboratório clínico, investigação de surtos, a triagem pureza de medicamentos e vacinas, e da novela descoberta do patógeno viral.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / material	Nome do reagente / material
Primera	5'-GTTTCCCAGTCACGATA (N9) -3 '
Primer B	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
RT Master Mix (5 mL)	2 mL tampão 5X RT
	1 mL 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 mL de água
	0,5 mL 0,1 M DTT
	0,5 mL SSIII RT (Invitrogen)
Sequenase Mix (5 mL)	Um buffer de Sequenase mL 5X
	3,8 mL de água
	0,15 mL Sequenase (USB Corporation)
º B PCR Master Mix (45 mL)	5 mL tampão PCR 10X
	1 mL 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 mL 100 B cartilha pmol / mL
	1 mL KlenTaq LA (Sigma)
	37 mL de água
º C PCR Master Mix (45 mL)	5 uL tampão PCR 10X
	1 mL 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 mL 100 B cartilha pmol / mL
	1 mL KlenTaq LA (Sigma)
	37 mL de água
Tampão de hibridação (25 mL)	Um buffer de fragmentação mL 25X (Agilent)
	5 mL tampão 5X de bloqueio (Agilent)
	9,5 mL (ou quantidade de normalizar) de Cy3 marcado amostra
	Adicionar água ao volume total de 25 mL
Agilent Virochip microarray	licença pendente; disponível a partir de Chiu laboratório, UCSF