Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

Resumo

Dieletroforese (DEP) é um método eficaz para manipular células. Placas de circuito impresso (PCB) pode fornecer eletrodos de baixo custo, reutilizáveis ​​e eficaz para o contato livre de manipulação de células dentro de dispositivos microfluídicos. Ao combinar PDMS baseado canais microfluídicos com lamelas em PCBs, demonstramos a manipulação de contas e celular e separação dentro multicanal dispositivos microfluídicos.

Resumo

Dispositivos microfluídicos têm avançado estudos de células, fornecendo um ambiente dinâmico fluídica na escala da célula para estudar, manipulação, classificação e contagem de células. No entanto, a manipulação da célula dentro do domínio fluídico continua sendo um desafio e requer protocolos de fabricação complicadas para as válvulas e eletrodos formando, ou exige equipamentos especiais, como pinças ópticas. Aqui, demonstramos que convencional placas de circuito impresso (PCB) pode ser usado para a manipulação sem contato de células, empregando dieletroforese (DEP) para manipulação de contas e de células em áreas de fluxo laminar para bioactuation, e para celular e talão de separação em microfluídicos multicanal dispositivos. Primeiro, apresentamos o protocolo para a montagem dos eletrodos DEP e dispositivos microfluídicos, e preparar as células para o DEP. Então, nós caracterizam a operação DEP com esferas de poliestireno. Por fim, mostramos resultados representativos de separação de contas e celular em um dispositivo de múltiplos canais microfluídicos. Em resumo, a DEP é um método eficaz para a manipulação de partículas (grânulos ou células) dentro de dispositivos microfluídicos.

Protocolo

Um diagrama geral da instalação do equipamento é mostrado na Figura 1A. A montagem PCB-amostra é ainda mais detalhado em um esquema de corte transversal na Figura 1B.

1. Preparando Eletrodos PCB:

1. Design de PCB eletrodos para a geometria desejada para gerar um campo elétrico não uniforme. Eletrodo fichas personalizadas PCB podem ser encomendados através de instalações de fabricação comercial (Figura 1C).
2. Prepare pré-fabricados eletrodos PCB por arame 16 gauge solda ao final de cada eletrodo metálico impresso (Figura 1D).
   1. Coloque o fio na extremidade do eletrodo. Segure o fio no lugar sobre a área de metal do PCB com o ferro de solda quente para aquecer o fio.
   2. Alimentar uma pequena quantidade de solda no fio aquecido para preencher o fio com solda.
   3. Após o fio é preenchido com solda, retire o ferro de solda, segurando o fio no lugar enquanto a solda esfria.
3. Repita o processo de soldagem para cada conexão elétrica sobre o PCB (Figura 1D).

2. Prepare canais microfluídicos:

1. PDMS (polidimetilsiloxano) baseado em canais microfluídicos são preparados com o elastômero PDMS, Sylgard 184 da Dow Corning. Um molde mestre que define os canais geralmente é criado através de processos de microfabricação padrão usando uma placa de silício e fotorresiste SU-8.
2. Mix composto de base para agente de cura em uma razão de 10:1 por 5 minutos.
3. Despeje o líquido sobre PDMS o molde mestre pré-fabricadas SU-8 e remover as bolhas de ar, expondo PDMS líquido a vácuo por alguns minutos. Repita o processo a vácuo, se necessário remover completamente todas as bolhas.
4. Curar o PDMS a 70 ° C por 2 horas.
5. Remover laje PDMS com canais microfluídicos do wafer com uma lâmina de barbear, cuidado para não quebrar wafer.
6. Furos para a introdução de líquidos e células para dentro do dispositivo microfluídicos. (Nota: Seringa de bombeamento gravidade, ou da tensão superficial de fluxo baseado podem ser usados ​​com DEP).
7. Inspecionar o dispositivo micro para garantir que está livre de poeira e detritos. Limpeza do PDMS podem ser facilmente conseguido usando 3M Fita Mágica Scotch.
8. Plasma vínculo do PDMS canais microfluídicos para uma espessura No.0 limpo (80-130 mm) lamela. Aqueça a montagem lamela-microfluídicos a 100 ° C por um mínimo de 15 min.

3. Prepare mídia de baixa condutividade:

1. Baixa condutividade media é preparada misturando 8,5% de sacarose + glicose 0,3% (w / v) em água deionizada (DI) ^1.
   Nota:. Nós já demonstraram que as células podem ser cultivadas durante dias em meio de cultura convencional de células após ser exposto a baixa condutividade por períodos curtos (cerca de 30 min) ¹¹

4. Montar canais microfluídicos sobre eletrodos PCB:

1. Coloque uma pequena quantidade (aproximadamente 10 mL) de óleo mineral para o PCB para garantir o contato firme entre o PCB ea lamela.
   Nota: Um passo opcional para diminuir a visualização do eletrodo é para revestir a superfície PCB com uma camada muito fina do marcador permanente preta ou tinta.
2. Coloque o conjunto de canais microfluídicos-lamínula sobre o PCB oleada, com lamela contato formando com o óleo (lamínula para baixo). Pressione suavemente a montagem lamela-microfluídicos para baixo para garantir um bom contato e minimizar bolhas de ar que pode prejudicar a visualização celular e talão. Um exemplo do dispositivo completo é mostrado na Figura 1D.

5. Concentre-se classificar e Contas e células usando DEP:

1. Preencher os canais microfluídicos com água DI ou de baixa condutividade media; o processo de colagem plasma facilita o carregamento fácil de soluções aquosas nos canais microfluídicos temporariamente tornando o normalmente hidrofóbico da superfície hidrofílica PDMS.
2. Introduzir células e / ou esferas de poliestireno no reservatório canal (Figura 1C). Aqui usamos adenocarcinoma de cólon humano (HT-29) células.
3. Ligue a saída de um gerador de função para a entrada de um amplificador de potência AC, então conecte a saída do amplificador para os fios dos eletrodos. Cobrir todos os fios elétricos e superfícies da instalação com fita isolante para proteger os usuários da eventual exposição aos choques. Um diagrama esquemático da configuração do equipamento é mostrado na Figura 1A.
4. Ajuste o gerador de função para produzir uma saída de onda senoidal de 1,0-1,5 MHz. A amplitude da saída deve ser ajustado para o amplificador de potência RF para produzir uma saída de 80-100V para o PCB. O amplificador de potência RF neste trabalho requer uma tensão de entrada em torno de 220-330 mV. Em celas separadas e contas, a taxa de fluxo laminar deve ser compatível com a força DEP para mover as células e os grânulos dentro do canal principal (largura w = 100 mm, altura h = 27 mm) para os canais de destino (largura w = 100 mm , a altura h = 27 mm).
   Atenção: consultar com o fabricante para determinar o PCB mtensões de operação aximum para evitar problemas, tais como PCB superaquecimento ou de fusão. Verifique as especificações dos fabricantes de equipamentos "para o gerador de função e fabricantes de amplificador de potência para determinar as configurações de operação segura.
5. Iniciar DEP às células classificar e miçangas. Células experiência positiva-DEP enquanto esferas de poliestireno uma experiência negativa DEP em um campo não-uniforme dentro das freqüências especificadas. Isto permite-force-DEP ativada bioactuation e separação de células e outras partículas dentro de dispositivos microfluídicos usando PCB acessível e reutilizável como eletrodos.

6. Resultados representativos:

Quando a DEP é eficaz em células de atuação ou partículas, um alinhamento forte dentro não uniforme campos elétricos é observado para banhos estáticos ou velocidades de fluido lento. Em condições de maiores velocidades de fluidos, o comportamento das células ou partícula depende da orientação relativa do fluxo axial para o campo elétrico ea velocidade do fluxo. Além disso, os comportamentos de células e partículas são também depende da intensidade do campo elétrico e do grau de não-uniformidade dentro do campo elétrico. Comportamentos típicos de células ou partículas include 'cadeias de pérola ", ciclismo, enrolando, ou virar.

Condições que comprometam ou abolir DEP incluem a presença de sais ou outras moléculas no líquido iônico, intensidade do campo elétrico fraco,, velocidades de fluxo excessivo, lamelas que são muito espessas, ou soluções condutoras entre as lamelas e eletrodos PCB (por exemplo, uma lamela rachados podem induzir a mistura de água e óleo mineral).

Aqui, quando se utiliza No.0 lamínulas espessura (80-130 mm) e um espaçamento entre os eletrodos de (231 mm), o gradiente do quadrado da intensidade do campo elétrico aplicado ao HT-29 células e contas é estimada em entre 2 ^-8 a 6 ^-8 V ^{2 m} / ^{3 1.}

A força DEP pode ser estimado através da medição da velocidade da partícula, manipulados por DEP no fluido estático (Figura 2A-B). Devido à inércia da partícula pequena e ambiente altamente viscoso do canal de microfluídica, a força de arrasto hidrodinâmico será igual, mas em sentido oposto com a força DEP. A velocidade média no talão de baixa condutividade media é 34,5 mM / s com DEP tensão de 93 Vpp e 1,5 MHz. A força de arrasto hidrodinâmico pode ser calculada com a seguinte equação ^1.

F = _drag 6πηRv

A média viscosidade η dos meios de comunicação de baixa condutividade a 20 ° C é de 1,27 mPa • s eo raio R talão é de 7,5 mM. A força de arrasto hidrodinâmico para o microbead poliestireno é estimada em 6,19 pN. Para demonstrar a capacidade de atuar dentro de contas canais microfluídicos (Figura 2C-F), iniciamos o fluxo dos meios de comunicação de baixa condutividade, empregando superfície mediada pelo fluxo de tensão. A velocidade média do grânulo no canal de entrada única foi 1.540 M / s, enquanto que a velocidade média dentro dos canais individuais foi reduzida para 565 M / s (Figura 2C). Ao iniciar DEP, as contas foram mantidas dentro do canal central ao invés de ser liberado para o canal lateral. Assim, sob essas condições, as forças DEP foram suficientes para superar a força de arrasto do fluido nos dois canais laterais.

O mesmo princípio foi usado também para desviar as contas do canil central para um canal único lado simplesmente mudando a orientação dos canais e do fluxo de contas para que os eletrodos de DEP (Figura 2E-F). Ao dobrar o eletrodo de metal no lado do canal de entrada única, quando a DEP foi iniciado, as contas foram guiados para o lado do canal, como as contas aproximou-se do ponto de trifurcação. Lá, as forças DEP foram suficientes para puxar as contas em um dos canais laterais, onde o fluxo laminar continuou a impulsioná-los para baixo o canal (Figura 2F).

Porque as células e esferas de poliestireno têm diferenças em sua capacidade de ser polarizada e atuado em países não-uniforme campos elétricos, usamos DEP para demonstrar a capacidade de realizar a separação on-chip de células e contas, ao mesmo tempo. Usamos a estrutura de canais microfluídicos mesmo PCB e eletrodos, conforme configurado na Figura 2E-F, mas introduziu uma suspensão de células HT-29 e contas da condutividade de baixa media para o canal de entrada simples (Figura 3). Quando a DEP é introduzida, e sob essas condições, o HT-29 células foram mantidas nos dois canais de saída esquerdo enquanto que as contas foram retidos no canal de saída individual na direita. Aqui as células mostram o comportamento de uma característica "pérola-chaining", como são coletadas no canal de saída esquerdo. Ocasionalmente, um cordão e células se tornam ligados em conjunto em que estão reunidos, muitas vezes nos canais de saída da célula. A partir desta experiênciaal dados, determinar a taxa de classificação a ser 713 partículas (células e esferas) por minuto, ou o equivalente a 14.260 células e contas em 20 minutos. O número de células e os grânulos recuperados é relevante e útil para a biologia molecular, imagem, na bioquímica e lab-on-a-chip aplicações.

Figura 1. PCB baseado DEP de células e partículas em canais microfluídicos. (A) A configuração do equipamento para a DEP baseada em atuação começa com um gerador de função para definir a freqüência e amplitude do sinal elétrico, em seguida, um amplificador de potência para aumentar a intensidade do sinal da campo elétrico gerado no PCB. (B) O conjunto de dispositivos microfluídicos para atuação amostra é constituída por canais microfluídicos PDMS irreversivelmente ligado a um não. 0 espessura lamela (80-130 mm) através de plasma de oxigênio, não condutor de mídia para banhar-se nas células e / ou contas. (C) Os eletrodos PCB usados ​​aqui duas regiões de onde os eletrodos são interdigitados para gerar um campo não-uniforme elétrico forte. (D) O dispositivo completou: um PCB com um dispositivo trifurcadas microfluídicos em uma lamela única, inset mostra todo o dispositivo com fios de eletrodo. (CD) Por escala, as medidas são 8,4 centímetros PCB (l), 2,1 cm (w), com 5 mm de largura eletrodos.

Figura 2. Imagens representativas das células e contas em canais antes e durante DEP atuação. (A) 15 mm esferas de poliestireno fluorescentes em a-baixa condutividade solução de mídia dentro de um canal microfluídicos PDMS, sem fluxo laminar (tempo decorrido, 1,23 seg). (B) Após a DEP iniciação, as contas migram para os padrões de eletrodo PCB (listras pretas) ao invés de entre os eletrodos (tempo decorrido, 8,18 seg). (C) Contas na mesma via, sob fluxo laminar são divididos entre os três canais separados (tempo decorrido, 5,3 seg); quando a DEP é iniciada (D), as contas são acionados a fluir apenas no canal central (tempo decorrido, 4.3 sec). (E) Ao alterar a orientação dos canais para os eletrodos PCB, esferas podem ser diferencialmente direcionada para os canais laterais (F), utilizando DEP em vez do canal central como mostrado em (D). (EF) Tempo decorrido é 8,23 seg e 5,16 segundos, respectivamente. Todas as barras de escala = 100 mm.

Figura 3. Imagens representativas das células e contas em canais antes e durante DEP atuação. (AB) Antes de iniciar DEP, uma solução mista de adenocarcinoma de cólon humano (HT-29) e fluxo de células contas de um canal para três canais de saída separados. A seta aberta identifica a direção do fluxo laminar e os canais são delineadas com linhas tracejadas para orientação e esclarecimento. (CD) Por DEP induzindo, pérolas e as células são seletivamente acionados em canais separados, identificados. HT-29 células de saída do canal central e esquerdo enquanto esferas de sair do canal direito. Encadeamento de pérolas característica de contas e células é observada durante DEP atuação. (A, C) Diferencial de imagem Contraste de Interferência de células e contas em microcanais torna as contas facilmente visível. Glow Images escala de intensidade (B, D) das mesmas imagens DIC (A, C) melhorar a visualização de células em canais. Os eletrodos de metal reflexivo ((A, C) faixa de luz e (B, D) amarelo e verde) oferecem um marco histórico importante para o alinhamento de microcanais para os eletrodos para atuação DEP baseada eficaz. Barra de escala = 100 mm.

Discussão

Manipulação de células em dispositivos microfluídicos é desejável para a ordenação ou colocação seletiva de células individuais ou para estudos populacionais. ² O fluxo laminar é usado em conjunto com válvulas e bombas para manipular células dentro de dispositivos microfluídicos. No entanto, estes métodos só são desafiadoras e requerem processos de fabricação detalhado e habilidades ³ Centrifugação pode simplificar as exigências para a colocação simultânea de imagens de células, mas é um desafio;. Além disso, a arquitetura de canal para a centrifugação deve ser cuidadosamente considerar ao projetar as manipulações desejadas e considerando efeitos de forças centrípetas. ^quatro pinças Laser pode ser usado para a colocação de celular, mas o método é caro e não passíveis de high-throughput separação de células. ⁵ No entanto, DEP tem sido demonstrada como um sistema eficaz de "pinça elétrica" ​​para a colocação de células eficaz, caracterização e manipulação ^6,7.

Especificamente, a DEP tem sido usado para capturar e classificar seletivamente células para on-chip de processamento de viver e de células mortas, ^7-10 e para coleta de células em sensores de ressonância para a medição da massa celular. ¹¹ Nós já demonstraram que, aumentando o DEP vigor em bactérias ou contas acima da força de arrasto fluídica, a concentração on-chip e aprisionamento de esferas de poliestireno e Listeria monocytogenes V7 pode ser realizado. ¹² populações mistas de E. coli e L. monocytogenes bactérias também pode ser dirigida e liberado através de pulsos DEP. Além disso, as partículas maiores podem ser diferencialmente capturada e concentrada nos eletrodos com base no tamanho de partículas grandes, enquanto que partículas menores não são de captura, mas são removidos com o fluxo de fluidos ^13. Quando as forças DEP não superar as forças fluídicas arrastando as partículas, o talão ou célula não é capturado, mas mudou-se dentro do fluxo de fluidos. Conforme mostrado na Figura 2C, contas pode ser focada na região central do fluxo de líquido suficiente para manter as contas no canal central. Isto pode ser devido ao efeito combinado de partícula para partícula influências dentro do campo elétrico, fluido velocidades superiores a DEP forças arrastando, a combinação destes, ou algum outro efeito indefinido.

Avanços mais recentes em contato DEP permitem maximizar a captura e manipulação de células com o campo mínimo exigido, protegendo assim os tipos de células, na maior medida, durante a manipulação do DEP. ^1,9 Contactless DEP promessa oferece à comunidade microfluídica para classificação, coleta e posicionamento de células dentro de dispositivos microfluídicos. Nós antecipamos que, com o aumento da procura e implementação de, DEP para a manipulação dentro de dispositivos microfluídicos, novas descobertas e inovações irá expandir a compreensão e influência de forças DEP.

PCBs podem ser fabricados por meio de alto volume de processos a um preço acessível com um rápido tempo de resposta de fabricação, tornando-as plataformas de bom para comercialização. Além disso, os PCBs são fáceis de usar e acessível para os cientistas em uma série de disciplinas para manipulações on-chip celular e classificação.

Ao projetar o layout do PCB eletrodos, deve-se considerar para a desejada trajetória de partículas / células. Principais fatores a considerar incluem tamanho de partícula e tipo (cordão e / ou celular), tipo de célula, o tamanho de microcanais, velocidade de fluxo, espaçamento entre os eletrodos (que determina a intensidade do campo elétrico), espessura da lamela, ea condutividade do fluido. Esses fatores influenciam a força necessária e disponível para manipular a partícula ou célula, e, finalmente, a eficiência da separação. Nosso protocolo aqui apresentado demonstra uma configuração eficaz para iniciar DEP para micro e separação de células. Para aplicações potenciais, os usuários devem coincidir com a arquitetura do projeto do canal microfluídicos com os caminhos de fluxo desejado para as células e contas, bem como os padrões de eletrodo para otimizar a eficiência para cada aplicação. Espaçamento entre os eletrodos e espessura lamínula pode ser usado de acordo com as diretrizes anteriormente relatados ao projetar o layout de canais microfluídicos ^1.

A condutividade e permissividade da célula / partícula e da mídia em torno deve ser diferente o suficiente para facilitar DEP positiva ou negativa, mantendo as células intactas. A polaridade do DEP para uma partícula esférica pode ser determinada a partir da parte real de um valor complexo do fator de Clausius-Mosotti seguinte no ω freqüência de tensão DEP.

Equação 1

Neste ε equação, é a permissividade, σ é a condutividade, e ε * é a permissividade complexa. Os índices p e mdenotam a partícula e mídia, respectivamente. Quando uma célula tem uma maior permissividade do que a mídia, ou a parte real do fator de Clausius-Mosotti torna-se positiva, a partícula se torna mais polarizada do que a mídia ao redor. Devido a um campo não-uniforme, a polarização da partícula se torna não-uniforme e isso cria uma DEP positiva (+ DEP) a força que atrai a célula para a região com maior intensidade de campo elétrico. Se uma célula tem uma menor permissividade do que a mídia em torno, ou a parte real do fator de Clausius-Mosotti torna-se negativo, ele será submetido a DEP negativo (-DEP), ea célula é forçado para a região de campo mínima. Se a célula e mídia têm aproximadamente a mesma permissividade complexa, nenhuma força pode ser gerada para manipular a célula. Por esta razão, a água pura é uma mídia preferida para a manipulação de partículas DEP. No entanto, para evitar o estresse osmótico sobre a célula de água pura, media baixa condutividade foi formulado para manter inalterada a condutividade, mas para aumentar a osmolaridade para diminuir o estresse osmótico para as células. Mídia celular convencional cultura ou buffers fisiológicas, tais como DMEM ou PBS, tem alta condutividade, o que não é adequado para a manipulação DEP.

Nós também já demonstraram que as células podem ser capturados em sensores com DEP usando meios de baixa condutividade. Após um breve período para adesão celular, a mídia de baixa condutividade pode ser substituído para o meio de cultura de células necessárias para suportar o crescimento de células para dia ^11.

Pela nossa experiência, partículas fluorescentes são muito brilhantes no que diz respeito à fluorescência de células vivas, portanto, pode ser um desafio para coincidir com a intensidade do grânulo com a intensidade de uma célula viva e fluorescentes. Para melhorar a visualização de ambas as células e as contas, nós usamos a microscopia DIC em um microscópio vertical para geração de imagens de ambos. Para exibir as células e os grânulos, apresentamos os dados em uma escala de intensidade de brilho de imagem, que mantém os dados em um vasto leque de cores para facilitar a visualização. Assim, ao projetar o estudo de interesse, os parâmetros de imagem e recursos devem ser considerados.

Em resumo, demonstramos a capacidade de atuar seletivamente grânulos e células em canais separados usando DEP. Com o utilitário crescente de canais microfluídicos para biologia celular, bioquímica e aplicações de bioengenharia, DEP é uma opção desejável para a coleta de células, de colocação e classificação. O PCB fabricação de eletrodos é barato e conveniente, os eletrodos são fáceis de usar, e os tempos de fabricação rápida são ideais para a implementação da DEP.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 kit (PDMS)	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Dow Corning Sylgard
16 awg hook-up wire	Belden	8521	(Type MW) Mil-W-76C-PVC
Gold seal Cover Glass	Ted Pella, Inc.	260320	No. 0 thick, 24 x 60 mm
Miltex Biopsy Punch	VWR international	95039-104	Miltex, assorted sizes
Custom PCB electrodes	Bay Area Circuits	Custom parts
Mineral oil	Fisher Scientific	O121-1
Deionized water	House DI water supply	None	Use filtered DI water
D-Glucose Anhydrous Granular AR	Mallinckrodt Baker Inc.	4912-06
Sucrose, Crystal	Mallinckrodt Baker Inc.	8360-06
Fluorescent polymer microspheres	Bangs Laboratories	FS07F/9277	15μm Dragon green microspheres
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38D	Human colon adenocarcinoma
Typsin 0.05% EDTA	Invitrogen	25300054
Eclipse E600FN upright microscope	Nikon Instruments	Eclipse E600FN
Phantom V310 High-speed imaging camera	Phantom	V310
BX51 upright research microscope	Olympus Corporation	BX51
SpotFlex high resolution color camera	Diagnostic Instruments	FX1520
Function generator	Agilent Technologies	3325A
RF Power amplifier	EIN	2100L