Uso de um sistema de suspensão de peso para oclusão da artéria renal isolada

Resumo

Um modelo murino precisa de lesão renal aguda (IRA) devido à isquemia é uma ferramenta importante para investigar lesão renal aguda e, eventualmente, encontrar ferramentas terapêuticas para tratar a lesão renal. O sistema de suspensão de peso oferece uma ferramenta para a oclusão da artéria renal imediata e confiável e reperfusão sem causar congestão renal.

Resumo

Em pacientes hospitalizados, mais de 50% dos casos de lesão renal aguda (IRA) são causados ​​por isquemia renal ^1-3. Um estudo recente de pacientes hospitalizados revelou que apenas um aumento moderado nos níveis de creatinina sérica (0,3 a 0,4 mg / dl) é associada a um risco 70% maior de morte do que em pessoas sem qualquer aumento de ^1. Ao longo destas linhas, procedimentos cirúrgicos que exigem de pinçamento da aorta e vasos renais estão associadas com uma taxa de insuficiência renal de até 30% ^4. Da mesma forma, AKI após cirurgia cardíaca ocorre em mais de 10% dos pacientes em circunstâncias normais e está associado com aumentos dramáticos na mortalidade. AKI também são complicações comuns após o transplante hepático. Pelo menos 8-17% dos pacientes acabam necessitando de terapia de substituição renal ^5. Além disso, a função tardia do enxerto devido à lesão de células tubulares durante transplante renal é freqüentemente relacionados à isquemia-associados AKI ^6. Além disso, AKI ocorre em aproximadamente 20% dos pacientes que sofrem de sepse ^6. A ocorrência de lesão renal aguda está associada com um aumento dramático de morbidade e mortalidade ^1. Abordagens terapêuticas são muito limitados ea maioria dos ensaios de intervenção no AKI falharam em seres humanos. Portanto, modalidades terapêuticas adicionais para evitar lesões de isquemia renal são urgentemente necessários ^{3, 7-9.}

Para elucidar os mecanismos de lesão renal por isquemia e possíveis estratégias terapêuticas modelos murinos são intensamente necessários ^7-13. Modelos de ratos oferecem a possibilidade de utilizar diferentes modelos genéticos, incluindo gene-alvo ratos e tecidos específicos do gene-alvo camundongos (cre-flox sistema). No entanto, isquemia renal murino é tecnicamente desafiadora e detalhes experimentais influenciar significativamente os resultados. Foi realizada uma avaliação sistemática de um novo modelo de oclusão da artéria renal isolado em ratos, o que especificamente evita o uso de fixação ou sutura dos ¹⁴ pedículo renal. Este modelo requer uma nefrectomia do rim direito desde a isquemia pode ser realizada somente em um rim devido à configuração experimental. Na verdade, usando um sistema de suspensão peso, a artéria renal é apenas instrumentados vez durante todo o procedimento cirúrgico. Além disso, nenhuma obstrução venosa ou uretral ocorre com esta técnica. Poderíamos demonstrar tempo de dose-dependente e altamente reprodutível lesão renal com isquemia através da medição da creatinina sérica. Além disso, quando se compara com este novo modelo convencional de fixação do conjunto de proteção, pedículo renal por pré-condicionamento isquêmico é mais profunda e mais confiável. Portanto, sua nova técnica pode ser útil para outros pesquisadores que estão trabalhando no campo da lesão renal aguda.

Protocolo

Observações gerais. Todas as operações devem ser realizadas em um microscópio de dissecação vertical (Leica) e usando um coagulador cirúrgico. Os ratos do grupo experimental devem ser combinados em idade e peso para garantir a comparabilidade dos resultados. Administração de temperatura, pressão arterial anestesia, e fluido deve ser estável e monitorados durante o experimento.

1. Anestesia e cirurgia

1. Experimentos isquemia renal pode ser realizada com aplicação simultânea isquemia e reperfusão de ambos os rins, ou depois de nefrectomia único em combinação com o tratamento da isquemia do rim remanescente. Como o tratamento da isquemia bilateral dos dois rins é associado ao aumento de dificuldades técnicas, um cenário mais complexo e mais experimental da cirurgia, iremos realizar uma nefrectomia direita seguido de tratamento da isquemia do rim remanescente, utilizando um sistema de peso pendurado. Nós utilizamos este sistema de peso pendurado também para oclusão da artéria coronária no coração. No entanto, o procedimento é diferente, pois a artéria renal pode ser isolada do tecido circundante ao passo que a artéria coronária está dentro do músculo cardíaco.
2. Camundongos (8-14 semanas de idade, ambos os sexos) serão anestesiados com pentobarbital na dose de 70mg/kg. Vamos manter a anestesia com aprox. 10 mg de sódio / kg / h pentobarbital. Sobredosagem pode reduzir significativamente a pressão arterial e, portanto, pode alterar os resultados. Em nossos estudos iniciais, também utilizada cetamina e xilazina. No entanto, estes compostos induziram uma forte bradicardia (150 min /). Ao lado da bradicardia observada também há evidências de que ambos os compostos estão envolvidos em mecanismos de proteção durante condições de isquemia. Anestésicos voláteis não pode ser usado, quer devido à sua capacidade para induzir também a protecção renal e pressão arterial baixa. Portanto, nossa escolha final para a anestesia foi pentobarbital. Além disso, a quetamina e xilazina são excretados principalmente pelos rins. Nefrectomia e isquemia pode prolongar a anestesia cetamina.
3. Uma vez que os reflexos estão ausentes dor (testado apertando os dedos dos pés, com uma pinça) ratos serão colocados sobre uma mesa de aquecimento com temperatura controlada (RT, Effenberg, Munique, Alemanha, para manter a temperatura corporal de 37,0 ° C) em uma posição de decúbito lateral esquerdo.
4. Prenda as extremidades inferiores e superiores para a tabela usando fita.
5. Para não-sobrevivência cirurgias, como mostrado no vídeo de demonstração, cobrir a área da incisão com óleo mineral para evitar a inalação de cabelo de rato, cortando a pele e, assim, evitar o risco de alergias cabelo mouse. Em caso de experimentos própria sobrevivência técnicas assépticas, incluindo corte de cabelo, a desinfecção da pele com iodóforos (Betadine, por exemplo), manuseio de instrumentos estéreis autoclavado e usando máscaras de uma luvas estéreis para o cirurgião são obrigatórios. Óleo mineral não é utilizado em cirurgias de sobrevivência. Para cirurgias de sobrevivência NaCl estéril é usada
6. Incisão flanco direito será feita com uma tesoura e um eletrodo de coagulação (Erbe, ICC50, Alemanha) para prevenir sangramento de músculos e vasos da pele. Em contraste com os rins acessando via laparotomia mediana, esta técnica não requer acesso à cavidade peritoneal.
7. O pedículo renal, incluindo artéria renal e veia renal são ligados com uma sutura 4 / 0 de seda e do rim direito serão cortadas com uma tesoura sem interferir com os vasos supra-renais.
8. A ferida cirúrgica é fechada com sutura contínua (dois pontos) da parede muscular e da pele com uma sutura 4 / 0.
9. Os animais são então colocados em uma posição de decúbito lateral direito e de uma incisão flanco esquerdo será executada.
10. O rim esquerdo é cuidadosamente removida do tecido conjuntivo, evitando a glândula adrenal e vasos.
11. Em seguida, o rim está ligado com o lado ventral para baixo em um copo de acrílico. O copo de acrílico devem ser esterilizados para cirurgias de sobrevivência. O pólo do rim é cuidadosamente empurrado para dentro do copo de acrílico, segurando o tecido circundante, com uma pinça. Posteriormente, a pole é cuidadosamente empurrado para dentro do copo de acrílico com uma pinça. O rim será mantido molhado e quente com um cotonete molhado encharcado com água a 37,0 ° C.
12. Após a exposição do rim esquerdo e colocação em um copo de acrílico o titular do rim é contido ventralmente ter tensão sobre os vasos renais. A restrição suficiente é importante para uma colocação bem sucedida da sutura sob a artéria renal. Posteriormente, o titular do rim é fixo e da artéria renal pode ser facilmente identificada como ele roda em cima da veia renal.
13. A artéria renal é dissecado dos tecidos adjacentes, perto de sua decolagem a partir da aorta abdominal com uma pinça fina. A artéria é dissecada da veia subjacente com uma pinça curva no topo.
14. Uma sutura 8 / 0 seda (Ethicon, Norderstedt, Alemanha) é colocado sob a artéria renal usandoum fórceps como um guia de liderança. Esta técnica permite a interrupção do fluxo sanguíneo apenas o arterial para o rim sem compressão da veia renal, em comparação a fixação do pedículo renal.
15. A sutura é colocada sobre um poste pequeno (pode ser um pino de segurança elaborados) e um peso de aprox. 1g está ligado a cada extremidade (tubo eppendorf). O peso pode ser adaptado para o tamanho dos rins, retirando ou acrescentando água nos tubos eppendorf. No entanto, a artéria deve ser um pouco puxado para cima, de modo que nenhum sangue está correndo através da artéria, mas sem esticar importante sobre a artéria. Estresse estiramento importante na artéria pode causar danos parede do vaso com espessamento da parede arterial e reperfusão reduzida.
16. Enquanto os pesos não são suportados, a artéria renal é imediatamente ocluído. Em contraste, quando os pesos são suportados, o fluxo sanguíneo é restaurado imediatamente ao órgão. Oclusão bem sucedida é confirmada por uma mudança de cor de vermelho para branco.
17. Tempo de isquemia diferentes podem ser realizadas, conforme exigido pelo experimento. A reperfusão completa terá lugar, dependendo da duração do tempo de isquemia. Tempo de isquemia de até 45 minutos permitem lesão renal recuperável. Em nosso meio experimental foram utilizados 20 a 30 minutos de isquemia com uma lesão renal médio que nos permite ver a melhoria, bem como diminuição da lesão renal, dependendo da estirpe do mouse e do tratamento.
18. Após a reperfusão completa do rim pode ser substituído para fora do copo de acrílico. Portanto, o rim é titular não fixada ea tensão sobre o rim é liberado. O pólo cranial é gentilmente removido para fora do copo com uma pinça branda eo pólo caudal segue imediatamente.
19. A fixação (fitas) do mouse pode ser liberado eo mouse pode ser colocado em posição supina para a depuração de inulina por exemplo, FITC-rotulados.
20. Em subconjuntos de experiências, pressão arterial e freqüência cardíaca pode ser registada ao longo do procedimento cirúrgico. Medidas de pressão arterial são obtidos de forma contínua através de um cateter da artéria carótida. Em resumo, a artéria carótida é exposta através de dissecção romba da musculatura paratraqueal. Após a exposição ainda mais cuidado e prevenção de trauma tecidual (particular do nervo vago), um cateter é inserido dentro do vaso usando duas suturas e uma pinça pequena. A pressão arterial é medida com um elemento Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Suíça).
21. Para FITC marcado clearance de inulina de um cateter tem que ser colocado na veia jugular esquerda para infusão de cloreto de sódio e inulina FITC-rotulados. Além disso, uma sonda vesical tem que ser inserido para a coleta de urina de forma dependente do tempo, conforme explicado abaixo em detalhe.

2. Medição de lesão renal

1. Em geral: Os parâmetros de resultados a seguir são recomendados para determinar lesão renal após isquemia renal:
   Executar FITC marcado clearance de inulina para avaliar a taxa de filtração glomerular (TFG). Como uma alternativa determinar o clearance de creatinina ea creatinina sérica através de investigação gaiola metabólica 24 horas após a lesão renal. Executar renal coloração H & E e um mieloperoxidase (MPO) ELISA para determinar o dano renal e inflamação 24 horas após a isquemia renal.
2. Metabólica investigações gaiola:
   1. Após isquemia do rim esquerdo está ligado de volta para a posição retroperitoneal ea ferida é fechada, como descrito acima.
   2. No final da cirurgia os ratos recebem 0,3 ml salina IP normal e recuperar durante 2 horas sob uma lâmpada de aquecimento.
   3. Posteriormente, os ratos serão colocados em gaiolas metabólicas (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Alemanha) para determinação de parâmetros funcionais renais por 2 tempos de 24 horas.
   4. A ingestão de água de cada rato tem de ser determinada por pesagem do frasco vazio e encheu com água antes do fornecimento para o mouse e de 24 horas depois pesando a garrafa cheia novamente. O peso do mouse tem que ser determinado bem.
   5. Depois de 24 horas aproximadamente 75μl de sangue são retirados do plexo venoso por trás do olho através de um tubo capilar sob anestesia isoflorane curto.
   6. Função renal é avaliada através da medida plasmática e creatinina de urina de 24 horas após isquemia renal usando um método comercialmente disponível colorimtric acordo com o fabricante `s de protocolo (LT-SYS, Trabalho + Technik, Berlim, Alemanha). As concentrações plasmáticas e urina de Na ^+, K ⁺ são determinadas com um fotómetro de emissão de chama (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Germany). Excretor renal e hemodinâmica valores são calculados usando fórmulas padrão ^15-17.
3. Inulina clearance: experimentos FITC-clearance de inulina será realizada após isquemia renal.
   1. A veia jugular esquerda é canulada para i contínuanfusion. Depois de dissecar a veia do tecido adjacente com uma tesoura de preparação (Dumont, WPI) colocar duas suturas (4 / 0) em torno da veia. Coloque uma braçadeira na veia antes da sutura proximale para parar o fluxo de sangue. Depois disso feche o nó distal e colocar um peso em uma das extremidades da sutura distal à tensão tensão na veia. Isto é muito importante para obter o cateter na veia. Use um micro-tesoura para cortar uma pequena abertura na veia. Segure a abertura com uma pinça fina (Dumont, WPI) e colocar o cateter na veia. Para avançar o cateter assumir a braçadeira fora. Certifique-se que não há tensão no cateter de modo que você pode colocá-lo para baixo, sem segurá-lo. Posteriormente, fechar a segunda sutura proximal sobre a veia eo cateter.
   2. Um cateter é colocado na bexiga urinária para cronometrado coleta de urina. Portanto você cortar uma incisão pequena na pele sobre a bexiga. Remova cuidadosamente a bexiga através do orifício na pele. Corrigir a bexiga com um lenço molhado. Coloque uma sutura preparado sobre a bexiga (4 / 0).
   3. Corte um pequeno pedaço de um cateter (1,5 cm) e calor no fim de obter um anel ao redor do cateter que torna mais fácil para corrigi-lo na bexiga.
   4. Corte um buraco na bexiga em seu topo. Fazer o corte entre os vasos para evitar sangramento. Insira a extremidade grande do cateter na bexiga e perto da sutura sobre o cateter ea bexiga.
   5. Todos os animais recebem um bolus de solução 0,85% de cloreto de sódio em uma quantidade igual a 20% do peso corporal. Infusão contínua é mantida a uma taxa de 800ul/h/25g peso corporal e FITC-inulina é adicionado à infusão para a avaliação de toda a taxa de filtração glomerular renal (TFG). Após a estabilização dos animais durante 20 min, 20 min coleções temporizados de urina são realizados (quatro vezes) para determinação da taxa de fluxo urinário e FITC-inulina. O sangue é obtido no meio de cada período para a medição de FITC-inulina.
   6. Ao iniciar os períodos de coleta por 20 minutos usar um timer. Coletar a urina, colocando a extremidade do cateter da bexiga em um tubo eppendorf de pequeno porte. Medir o peso do tubo antes e depois da coleta de urina para que você possa determinar a quantidade de urina. Amostras de sangue são tomadas através de retro-orbitária forma de coleta de sangue do plexo venoso através de tubos capilares no meio de cada período de coleta.
4. Sangue e os rins podem ser recolhidos após cada procedimento para análise mais aprofundada, por exemplo MPO ELISA, citocina EISA, histologia.

3. Resultados representativos:

Figura 1 Modelo de um sistema de suspensão de peso-para isquemia renal:. Um sistema de suspensão de peso foi criado para induzir isquemia renal do rim esquerdo. Portanto, um fio de náilon 8,0 foi colocado sob a artéria renal e no final de cada sutura um peso pequeno (1g) foi anexado. Este projeto experimental permite a oclusão reversível da artéria renal através da aplicação e liberar a carga de peso.

Discussão

Em resumo, o presente estudo descreve uma nova técnica para a realização de isquemia renal em um modelo murino usando um sistema de suspensão de peso para oclusão da artéria renal. De fato, este estudo demonstra lesão altamente reprodutíveis, minimizando assim a variabilidade associada com pinçamento do pedículo renal.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Pentobarbital sódico	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	VPL 9372	4mg/ml em solução salina
Sutura, de seda 4,0	Harvard Apparatus	517698
Sutura, Prolene 8,0	Ethicon, EUA	M8739	reutilizáveis
microscópio de dissecação	Leica	n / a	considerar a distância de trabalho generosa
Tabela de aquecimento	Rt, Effenberger, Alemanha	n / a	único fornecedor e único
Instrumentos cirúrgicos	WPI, Dumont		uma tesoura fina microvascular