Contando células-tronco neurais

Resumo

Conhecimento do número exato de células viáveis ​​é necessário para muitos manipulações cultura de tecidos. Este protocolo descreve como diferenciar entre células vivas e mortas e quantificar as células usando um hemocitômetro. Embora contando descreve-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), ele pode ser usado para outros tipos celulares.

Resumo

Conhecimento do número exato de células viáveis ​​em um determinado volume de uma suspensão de células é necessária para muitas manipulações de rotina de cultura de tecidos, como células de revestimento para imunocitoquímica ou para transfections celular. Este protocolo descreve um método simples e rápido para a diferenciação entre as células vivas e mortas e quantificar a concentração de células eo número total de células usando um hemocitômetro. Este primeiro procedimento requer destacando as células de uma superfície de crescimento e ressuspensão na mídia. Em seguida, as células são diluídas em uma solução de Trypan azul (de preferência a uma concentração que vai dar 20-50 células por quadrante) e colocado no hemocitômetro. Finalmente, a média das contagens de células viáveis ​​em vários quadrantes selecionados aleatoriamente, dividindo a média do volume de um quadrante 1 mm ² (0,1 mL) e multiplicando pelo fator de diluição dá o número de células por l. Multiplicando este concentração celular pelo volume total em mL dá o número total de células. Este protocolo descreve contando-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas também pode ser usado para muitos outros tipos celulares.

Protocolo

Passaging células-tronco neurais

Nota: Consulte o Neural Stem Passaging células artigo sobre como separar e ressuspender as células. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

Preparar a suspensão de células de Contagem

1. ML 25 lugar de 0,4% solução azul Trypan e 20 l de mídia celular em um tubo eppendorf.
2. Ressuspender as células a serem contadas batendo o tubo que contém as células em um volume conhecido de mídia para criar uma suspensão homogênea. Colocar 5 mL de células dentro do tubo eppendorf da etapa anterior. Esta etapa dilui a concentração de células por um fator de 10.
3. Coloque a tampa de vidro sobre o hemocitômetro e carregar sobre 11-12 mL da suspensão de células.
   
   
   
   

Contagem de células no hemocitômetro

1. Observar toda a grade do hemocitômetro em um microscópio de contraste de fase. Concentre-se em um quadrante da grade (como a de vermelho).
   
   
   
   
2. Células mortas ou morrendo aparecerá azul por causa de sua membrana foi danificado e não são capazes de excluir o corante azul Trypan. Células viáveis ​​não aparecerá azul e será rodeado por um "halo" de luz em contraste de fase (será "fase brilhante").
3. Contar o número de células viáveis ​​em um quadrante (área 1 mm ^2). Você também pode determinar a viabilidade celular pela divisão do número de células viáveis ​​pelo número total de células. Contagem de células em 04/03 quadrantes aleatórios e determinar o número médio de células por quadrante. Como o volume de um quadrante é conhecido por ser 10 ml ou 0,1 mL ^-4, a concentração de células pode ser determinada
   
   
   
   
   
   
4. Você pode usar o atalho a seguir para determinar as células # / mL:
   
   
   
   Número total de células em tubos = # células / mL X mL em tubo

Discussão

Este protocolo descreve uma maneira simples e rápida para determinar a concentração de células para uma variedade de experiências envolvendo células. Usando o atalho descritas em 3d, pode-se rapidamente e determinar com precisão a concentração de células eo número total de células em um determinado volume.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phase Contrast Hemacytometer	Tool	Hausser Scientific	02-671-54	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4%	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15250-061	Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #