Armadilha cromossomo associados para Identificar Interações de longo alcance DNA

Resumo

O associado armadilha cromossomo ensaio (ACT) é um novo método imparcial para identificar as interações de longo alcance DNA. A caracterização das interações DNA de longo alcance nos permitirá determinar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene em ambos os fisiologia normal e em estados doente.

Resumo

Informação genética codificada pelo DNA é organizado em uma estrutura complexa e altamente regulamentado cromatina. Cada cromossomo ocupa um território específico, que pode mudar de acordo com o estágio de desenvolvimento ou do ciclo celular. Expressão gênica pode ocorrer em fábricas especializadas em segmentos transcricional da cromatina podem loop out cromossomo a partir de territórios diversos, levando a co-localização de segmentos de DNA que podem existir em cromossomos diferentes ou distantes no mesmo cromossomo. A Associated cromossomo Armadilha ensaio (ACT) fornece uma metodologia eficaz para identificar essas associações de longo alcance DNA de uma maneira imparcial, estendendo e modificando o cromossomo técnica de captura de conformação. O ensaio ACT torna possível para nós para investigar os mecanismos de regulação da transcrição em trans, e podem ajudar a explicar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene na fisiologia normal e durante estados de doença.

Protocolo

1. Fixação em formol de interações de longo alcance cromatina

1. Cultura linha celular humana HL-60 em RPMI1640 média com 15% FBS e 1 x penicilina / estreptomicina a confluência de 80-90% em uma incubadora fornecido com 5% de CO ₂ a 37 ° C.
2. Coletar as células em um tubo de 50 ml Nunc, centrifugar a 1.200 rpm por 15 minutos e remova o meio por aspiração
3. Adicionar 5 ml de meio de cultura para voltar a suspender as pelotas de células, e contar as células usando um hemocitômetro. Demorar cerca de 1 x 10 ⁷ células para um volume de 40 ml com FBS RPMI1640 / 10%, em seguida, adicionar 1,7 ml de formaldeído 37% para corrigir a cromatina diluído.
4. Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos, agitando suavemente, e depois apagar com 2,4 ml de glicina 2M. Centrifugar por 15 minutos a 1.200 rpm a 4 ° C, e remover o sobrenadante. Lave o pellet uma vez com 40 ml de gelo frio PBS, em seguida, girar o pellet e remover o PBS.

2. Lise celular para isolar núcleos

1. Ressuspender as células em 40 ml de gelo tampão de lise gelada (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) com inibidores da protease recém adicionado (1:500 diluição) e 0,1 mM PMSF. Incubar em uma sala fria, com rotação de 90 minutos, centrifugar a 2.500 rpm por 15 minutos, e remover o sobrenadante.

3. Digestão com enzima de restrição Bgl II

1. Ressuspender os núcleos em 0,5 ml de tampão NEB 1 x 3, e adicionar 15 μlof SDS 10%. Incubar a 37 ° C por 1 hora com agitação, em seguida, adicione 45 mL de 20% Triton X-100 para seqüestrar o SDS. Incubar a 37 ° C por 1 hora com agitação.
2. Use uma alíquota de 1 x 10 ⁶ núcleos (cerca de 15 mg, 1 / 10 das células original) para a digestão enzima de restrição. Retire 55 ml de solução núcleos da Etapa 3.1 e completar a 500 mL com 433 mL de um tampão NEB x 3 e 12 mL de Bgl II (50U/ul). Incubar a 37 ° C durante a noite.

4. Ligadura de segmentos de DNA interagindo

1. Inativar a enzima de restrição, adicionando 95 mL de SDS 10%, e desnaturados por aquecimento a 65 ° C por 20 minutos em banho-maria.
2. Adicionar 7 ml de um tampão ligadura x (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl _2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) e 360 de mL Triton 20% X-100 e incubar a 37 ° C por 1 hora .
3. Abaixe a temperatura para 16 ° C e adicionar 50 ul de 400 U / mL DNA ligase T4. Incubar a amostra a 16 ° C por 4 horas e, em seguida, em temperatura ambiente por 30 minutos.

5. Purificação de DNA

1. Adicionar 300 mg de proteinase K, e incubar a 65 ° C durante a noite.
2. Adicionar 5 mg de RNase A e incubar a 37 ° C por 30 minutos
3. Purificar DNA por extração de fenol / clorofórmio, eo DNA precipitado em isopropanol. Dissolver o DNA em 150 mL de água destilada estéril.

6. Digestão com Msp I e ligadura com linkers oligonucleotídeo

1. Incubar 2μg de DNA purificado com 5 unidades de Msp I, a 37 ° C por 4-6 horas. Inativar Msp I a 65 ° C por 10 minutos, em seguida, precipitar o DNA em etanol com 1 ml de glicogênio 5 mg / ml. Dissolver o sedimento de DNA em 50 ul de água destilada estéril.
2. Mix 50 ul de DNA Msp I-tratados com 2 l de um oligonucleotídeo 20 L M linker (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 ml de um 20 mM oligonucleotídeo S (5'-cggtgaatc-3'), 1 ml de água destilada estéril e 6 mL de tampão ligase 10 x T4 DNA. Cubra a mistura com cera líquida.
3. Oligonucleotides desnaturar a 50 ° C por 1 minuto e deixe arrefecer gradualmente para 10 ° C em um gradiente de 0,5 ° C / minuto em um termociclador.
4. Adicionar 1 ml de 400 U / mL DNA ligase T4 e incubar a 15 ° C durante a noite. Purificar o DNA linker-ligado com um kit de purificação QIAquick PCR, e eluir em 50 l de água destilada estéril.

7. PCR amplificação e análise de seqüência de

1. Escolha um primer para a região específica do DNA que você deseja examinar para interações de longo alcance (isto é, a 'isca'). Neste exemplo, usamos ABL-1.
2. Tomar 1 ml do DNA purificado para realizar a primeira rodada PCR utilizando 1 ml de 20 mM de primer -1 ABL específica # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 ml de 20 mM de primer específico linker # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl de 3 x Klen Taq DNA polimerase I cocktail e 3 l de água destilada estéril. Dois mL de ³² P-dCTP é adicionado 100 ul de 3 x DNA polimerase Taq I Klen cocktail antes da amplificação PCR. O ciclo térmico de um hot start PCR é de 72 ° C por 2 min, 95 ° Cpara 2 minutos, 18 ciclos de 95 ° C por 20 segundos, 65 ° C por 40 segundos e 72 ° C por 1 minuto; extensão da final é realizada a 72 ° Cpor 5 minutos.
3. Purificar os primeiros produtos rodada PCR usando um kit de purificação QIAquick PCR e DNA eluída em 30 mL de água destilada estéril.
4. Tomar 1 ml de 100 x diluída produto PCR primeiro a realizar uma segunda rodada de PCR usando primers nested adicionando 1 ml de 20 mM ABL-1 primer específico # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (Figura 1a), 1 ml de 20 mM de primer específico linker # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 mL de 3 x Klen Taq DNA polimerase I cocktail e 3 l de água destilada estéril. A programação de ciclos térmicos é de 25 ciclos de 95 ° C por 20 segundos, 67 ° C por 40 segundos e 72 ° C por 1 minuto, seguido por extensão a 72 ° C por 5 minutos.
5. Visualize os produtos de PCR, executando a 5% gel uréia-PAGE e digitalização a tela exposta em um PhosphoImager (Figura 1b). Cada banda PCR pode ser reciclado a partir do gel, dissolvendo as tiras de gel em um tubo Eppendorf contendo 60 mL de água destilada estéril e incubar a 95 ° C por 5 minutos. Centrifugar brevemente a 10.000 rpm por 10 segundos para recolher todas as amostras. Retire 1 ml para usar como molde de DNA para realizar PCR com o par de iniciadores 2961/4626 usando as mesmas condições, como descrito acima. Análise da seqüência pode ser realizada depois da purificação usando um kit de purificação QIAquick PCR.
6. Seqüências de DNA são analisadas utilizando uma ferramenta online para determinar a sua localização cromossômica no site: http://genome.ucsc.edu (Figura 1c). Clique em 'BLAT' para introduzir uma nova janela que permite colar uma seqüência de DNA, uma nova janela aparece após clicar em 'Enviar', e mostra o 'Resultados da Pesquisa BLAT. Clique em "browser" da batida com 100% de identidade para entrar numa janela ao lado mostra a localização da seqüência de DNA.

8. Resultados representante

1. ACT ensaio usando ABL-1 região como isca para determinar suas interações DNA de longo alcance

Como ilustrado na Figura 1a, dois sites Bgl II e um site que eu BAMH foram escolhidos para o ensaio ACT. Na segunda rodada de PCR, primer set 4626/2961 foi usado para amplificar ABL-M1, 4630/2961 foi usado para ABL-M2, e 4636/2961 foi usado para ABL-M3. Um padrão típico mostra um gel de várias bandas (Figura 1b). Cada fragmento de um ensaio ACT consiste em dois segmentos de DNA combinado: um segmento é derivada da região do DNA isca, enquanto o segundo segmento vem do parceiro associado, que se juntou ao segmento região isca pela primeira seqüência de reconhecimento enzima de restrição. A seqüência de reconhecimento segunda enzima irá aparecer no final da seqüência de parceiro associado (Figura 1c). O fragmento clonado ABL-M1 contém DNA da região de ABL1 localizado no cromossomo 9q32.4 de +133,592,306-133,592,399, e os parceiros associados está localizado no cromossomo 3p13 de +71,869,882-71,870,107. As identidades dos parceiros associados são descobertos por jateamento suas seqüências usando o browser genoma UCSC (GRCh7/hg19 lançado em fevereiro de 2009). PROK2 foi identificado como o parceiro associado no locus chr3p13.

Da mesma forma, a ABL-M2 parceiro associado foi localizada chr5q21.1, enquanto clone ABL-M3 foi identificado como uma associação intra-cromossômicas perto do lugar-1 ABL.

2. Determinar menos prevalente interações de longo alcance usando ensaio ACT

Outros ensaios com base em 3C relataram muitos mais parceiros do que a interação que temos mostrado na Figura 1 e na IGF2 / H19 lugar ^12. A metodologia que temos delineado irá selecionar as mais prevalentes interações de longo alcance. No entanto, ao aumentar o número de ciclos de PCR, é possível identificar adicional, associações menos freqüentes, bem como (Figura 2).

3. Diferenças nas interações de longo alcance em células de câncer quando comparados com os tecidos normais.

O ensaio ACT também pode ser usado para identificar diferenças na arquitetura nuclear e interações de longo alcance entre células normais e células cancerosas (Figura 3). Estas diferenças podem refletir mudanças arquitetura nuclear que ocorrem durante a transformação celular, e, portanto, este ensaio pode vir a ser aplicáveis ​​para fins de diagnóstico. Os padrões de gel semelhantes que ocorrem em ambos os normais e os tecidos de câncer indicou que o ensaio ACT é confiável e repetível. Enquanto o ensaio ACT pode identificar parceiros de longo alcance DNA, análises adicionais, tais como FISH e ensaios ChIP, são obrigados a verificar a presença das associações identificadas entre loci distantes. Estudos genéticos, fisiológicos e bioquímicos podem então ser realizados para elucidar as implicações biológicas dessas associações DNA de longo alcance.

Figura 1 usando ensaio ACT ABL-1 DNA região como isca em células HL-60. a. Struct DNAure na ABL-1 região. A enzima de restrição usada pela primeira vez no ACT ensaio foi Bgl II. Os primers para a segunda rodada de PCR também estão marcados por setas e números primário correspondente. b. Gel padrão do ensaio ACT em 5% de uréia-PAGE. O par de iniciadores 4626/2961 foi usado para amplificar clone ABL-M1 na PCR nested, 4630/2961 foi usada para clonar ABL-M2, e 4636/2961 foi usada para clonar ABL-M3. c. Seqüência de DNA do clone ABL-M1. Fragmento de DNA a partir de ABL-1 DNA isca é marcado em vermelho, eo parceiro de DNA associado é rotulado em ciano. Bgl II site (AGACTC) foi marcado em verde, e Msp site que eu (CCGG) é marcado em roxo.

Figura 2 ciclos de PCR afetar os resultados do ensaio ACT. Usando a região de controle imprinting (ICR) no locus Igf2/H19 como isca DNA em células de fibroblastos de rato, os programas de ciclismo diferentes foram aplicadas no primeiro e segundo turnos da PCR no ensaio ACT. 18-20 ciclos no primeiro turno da PCR não amplificar o sinal suficiente para ser visualizado. Vinte e cinco ciclos nos resultados da segunda PCR em bandas claras, enquanto aumenta o número de ciclos para a segunda rodada de PCR induziu um padrão de manchas, além de bandas mais.

Figura 3 detecção de diferenças na arquitetura nuclear entre o tecido normal e tecido do cólon câncer de cólon em ensaio ACT. A. Estrutura do DNA da região ICR em IGF2/H19 locus e gene IGF2. Locais DPN II para o ensaio ACT são rotulados. Primers utilizados na PCR segunda rodada estão marcados por setas e números em cores diferentes que correspondem a cada pista no painel b da figura. b. Gel padrão do ensaio ACT em 5% de uréia-PAGE. Tecido do cólon normal, MAD03-1423 e tecido de câncer de cólon MAD04-149 foi obtida a partir da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN) Divisão Ocidental. Depois de cada tecido do cólon foi homogeneizado, ensaio ACT foi realizada seguindo os procedimentos aqui descritos. Faixa 1 representa os resultados da PCR usando primers # # 2961and 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') marcado em rosa em um painel; lane 2 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') marcado em laranja no painel a; faixa 3 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') marcada em azul no painel a; lane 4 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') marcado em verde no painel de a. Bandas originais que só aparecem no tecido do cólon normal são marcados por setas amarelas, e as bandas que apareceu somente no tecido de câncer de cólon são rotulados de setas vermelhas. ICR, região de controle imprinting; DMR, região metilado diferentes.

Discussão

Dekker et al. Desenvolveu o cromossomo conformação capturar abordagem (3C) para detectar a freqüência de interação entre dois loci genômicos ¹ e 3C tem sido amplamente utilizado para investigar associações cromossômicas intra-e inter-cromossômicas entre duas regiões do DNA em células de mamíferos conhecidos ^{dois -9.} Embora recém-desenvolvida metodologia de Hi-C pode ser aplicado para o estudo do genoma de DNA associação, ensaio ACT ainda é uma técnica eficaz para o estudo do locus específico de interação DNA ^10-11. Nós modificamos essa abordagem para identificar regiões do DNA desconhecidos que estão associados a uma região do DNA conhecido no rato cultivadas e células humanas (Figura 1). Chamamos este método na armadilha cromossomo associado ensaio (ACT), uma vez que nos forneceu um método confiável e reprodutível para identificar novos parceiros DNA desconhecidos que se associam a uma região conhecida de DNA alvo ^12. Um ensaio bem sucedido 3C com controles adequados é feita antes de executar os aspectos novos do ensaio ACT ^13. A fim tofind tantas regiões do DNA associado quanto possível, é necessário o uso de várias combinações de enzimas de restrição primeiro e segundo. É especialmente importante o uso de enzimas de restrição que são insensíveis a metilação CpG para realizar a etapa ligadura primeiro 3C. A ligação às proteínas e metilação do DNA também podem influenciar a eficiência restrição de digestão enzimática e pode levar à insuficiência de ligadura das regiões DNA associado para digestões certas enzimas de restrição. A ocorrência de ligadura intra ou inter-cromossômicas depende de proteínas DNA-cross-linking e apropriado mapas físicos de ambos das regiões DNA associado. Assim, alguns experimentos preliminares são essenciais para estabelecer uma possível concentração de formaldeído eficaz e tempo de tratamento no ensaio ACT. A gama de concentrações finais de formaldeído (from1.5% para 2%) têm sido utilizados em diversos laboratórios durante a parte 3C do ensaio ^7,9. Alternativamente, os oligonucleotídeos utilizados como linkers pode ser projetado para combinar com o final coesa cortado pela enzima de restrição segundo. Embora descobrimos que 18-20 ciclos na primeira rodada de PCR e 20-25 ciclos no segundo turno da PCR poderia fornecer bandas claras, é necessário estabelecer as melhores condições de PCR para cada experimento (Figura 2). Intra-molécula annealing entre seqüência adaptador 5'-end e 3'-end complementares de uma cadeia de DNA pode ocorrer em PCR, inibe específicas do adaptador primário de recozimento com a molécula de DNA, e resultou em eficiência de amplificação muito mais baixo nos primeiros ciclos diversos. Após o DNA alvo foi ampliado para os ciclos, o montante pode ser muito maior do que estas reações inespecíficas, e pode facilitar a competição de primer annealing para as moléculas de DNA alvo. É também por isso nós podemos ver a amplificação de fundo, e porque o primeiro produto da PCR rodada tem que ser diluído para diminuir amplification.It fundo é importante para remover excesso de primers a partir da reação de PCR, a fim de diminuir a fundo na segunda rodada de PCR. Como em todos os experimentos baseados em PCR, é essencial para projetar primers que não estão localizados em regiões de repetição de seqüência, que constituem a maioria do DNA humano e do rato. Embora recém-desenvolvida metodologia de Hi-C pode ser aplicado para o estudo do genoma de DNA associação, ensaio ACT ainda é uma técnica eficaz para o estudo do locus específico de interação DNA.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI1640 medium	Invitrogen	22400-105
acrylamide	Invitrogen	15512-023
ATP solution, 10mM	Invitrogen	AM8110G
fetal bovine serum	Invitrogen	16000-044
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
1M Tris pH8.0	Invitrogen	AM9856
RNase A	Invitrogen	12091-039
SDS	Invitrogen	15525-017
urea	Invitrogen	15505-035
BamH I	New England Biolabs	R0136T
Bgl II	New England Biolabs	R0144M
Dpn II	New England Biolabs	R0543T
Msp I	New England Biolabs	R0106S
dNTPs	New England Biolabs	N0447L
proteinase K	New England Biolabs	P8102S
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T
37% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Bis-acrylamide	Sigma-Aldrich	146072
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815
glycine	Sigma-Aldrich	50046
PMSF	Sigma-Aldrich	93482
proteinase inhibitor	Sigma-Aldrich	S8830
Nonidet P-40	Roche Group	11754599001
KlenTaq1	Ab peptides	1001
dCTP alpha P32	PerkinElmer, Inc.	BLU513H250UC
PTC-100 Thermal Cycler	MJ Research	mjptc100
Power Supply	Bio-Rad	164-5056
OmniPAGE Maxi	Aurogene Life Science	VS20D
Typhoon 9400	GE Healthcare	63-0055-78