Análise do transcriptoma de uma única célula

Resumo

Neste artigo descrevemos um método simples para a colheita de células isoladas de ratos culturas primárias neuronais e análise de transcriptoma subsequentes usando a amplificação ARNA. Esta abordagem é generalizável a qualquer tipo de célula.

Resumo

Muitas técnicas de análise de expressão gênica confiar no material isolado de populações heterogêneas de células de homogeneizados de tecidos ou células em cultura. ^1,2,3 No caso do cérebro, regiões, tais como o hipocampo contém um arranjo complexo de diferentes tipos de células, cada uma com distintos perfis de mRNA. A capacidade de colheita de células individuais permite uma maior investigação detalhada sobre as diferenças molecular entre e dentro de populações de células. Nós descrevemos um método simples e rápido para a colheita de células para posterior processamento. Pipetas muitas vezes utilizados em eletrofisiologia são utilizados para isolar (por meio de aspiração) uma célula de interesse e convenientemente depositá-lo em um tubo Eppendorf para posterior processamento com qualquer número de técnicas de biologia molecular. Nosso protocolo pode ser modificada para a safra de dendrites de cultura de células ou até células individuais de fatias aguda.

Descrevemos também o método de amplificação ARNA como uma das principais aplicações a jusante de isolamentos única célula. Este método foi desenvolvido anteriormente por nosso laboratório como uma alternativa a outras técnicas de expressão de genes de análise, como transcrição reversa em tempo real ou reação em cadeia da polimerase (PCR). ^4,5,6,7,8 Esta técnica prevê ampliação linear do RNA polyadenylated começando com femtogramas só de material, resultando em quantidades micrograma de RNA antisense. O material amplificado linearmente fornece uma estimativa mais precisa do que a amplificação exponencial da abundância relativa dos componentes do transcriptoma da célula isolada. O procedimento básico consiste em dois rounds de amplificação. Resumidamente, a T7 RNA polimerase promotor local é incorporada dupla cDNA encalhado criado a partir de transcritos no mRNA. Uma noite de transcrição in vitro de reação (FPI) é então feita em que T7 RNA polimerase produz muitas transcrições antisense do cDNA dupla fita. A segunda rodada repete este processo, mas com algumas diferenças técnicas desde a matéria-prima é antisense RNA. É padrão para repetir o segundo turno, resultando em três rounds de amplificação. Muitas vezes, a terceira rodada in vitro a reação de transcrição é realizada utilizando-nucleosídeos trifosfatos biotinilado para que o RNA antisense produzido pode ser cruzados e detectado em um microarray. ^7,8

Protocolo

1. Cultura de células

Nosso laboratório utiliza culturas primárias de neurônios hipocampais de ratos para os experimentos a seguir. A seguir descreve o protocolo Banker modificado para como essas culturas de células são criadas e mantidas. ⁹ Há, naturalmente, um número exaustivo de permutações destas técnicas de cultura de células e qualquer método estabelecido adaptados às necessidades específicas de um laboratório especial que fornece uma fornecimento consistente de células saudáveis ​​seria um substituto adequado.

1. Cinco autoclavado, redondo, 12 lamínulas mm são colocados em um prato de 35 mm e revestido com 80 mg / mL Poly-D-lisina (MW 70-150,000) em tampão borato S / N, lavados com água (grau de cultura de células), então revestido com 1 mg / mL laminina em tampão borato S / N, em seguida, lavados novamente com água. NG media (MEM com sais de Earle e Glutamax suplementado com glicose (0,6% w / v), penicilina (100 U / mL), estreptomicina (100 mg / ml), soro de cavalo (10% v / v)) é adicionado e pratos são armazenados em uma incubadora (5% CO ₂ a 37 ° C). O PDL150/laminin serve como um substrato para os neurônios isolados a crescer como um monocamada. As lamelas podem ser revestidos até duas semanas antes do plaqueamento.
2. No dia de cultivo, os neurônios primários da embrionárias dia 18 ratos hipocampos são banhados na mídia NG, adicionando 1,5 mL de 100.000 células / mL de suspensão. Quatro a seis horas após o plaqueamento, cada prato é tratada de 35 mm com 0,75 mL de 5 mM citosina beta-D-arabinofuranoside (ara-C) para impedir o crescimento de todas as células da glia contaminando. Vinte e quatro horas depois, a mídia chapeamento é alterado para MEM com sais de Earle e L-glutamina suplementada com 0,6% w / v de glicose, piruvato de sódio 1 mM, e B27. Células são permitidos a crescer por pelo menos duas semanas antes de usar em qualquer experimento para permitir o desenvolvimento completo de processos.

2. Pipetas preparar

Nota sobre RNases: A pele, saliva, respiração e até mesmo são as principais fontes de RNases, enzimas que degradam o RNA. É imperativo que RNase técnica ser observado a partir deste ponto no protocolo de modo que a amostra não seja contaminado com RNases e, posteriormente, se degradar. Isto inclui sempre usar luvas ao manusear as amostras e reagentes, nunca falando sobre amostras ou reagentes, e usando novas caixas de ponteiras esterilizadas e tubos. Muitas vezes, pipetas que não são designadas exclusivamente para o trabalho de RNA são descontaminados, limpando-as com uma solução de tratamento RNase como RNase AWAY (Bioproducts Molecular). No entanto, estas soluções irá inibir qualquer reação enzimática a jusante por isso é também importante para evitar a contaminação de suas amostras com estes tratamentos.

1. Autoclave 1,5 milímetros de diâmetro exterior (OD) pipetas de vidro.
2. Utilizando um extrator de micropipeta, pipetas puxar para um diâmetro adequado para gravações eletrofisiológicas, que podem variar com base no seu puxador, filamento, e pipetas. ¹⁰ O diâmetro não é muito crítico, pois a ponta vai ser quebrado antes da coleta das células.
3. Cuidadosamente as pipetas loja em um ambiente livre de poeira, onde as dicas permanecerá intacta (o ideal é usar um frasco de armazenamento micropipeta).
4. Para quebrar a ponta de uma forma controlada, realizar uma kimwipe tenso entre os dedos em uma mão e muito gentilmente escovar a ponta da pipeta através do papel 1-2 vezes. A abertura deve ser de aproximadamente 75-100% do tamanho da célula-alvo. Ajuste este passo até que você alcançar o resultado desejado.

3. Cultura prepara, Tubos e Microscópio

1. Prepare número desejado de 1,7 mL tubos Eppendorf. Adicione 2 mL de tampão PBS vertente, primeiro se o material é para ser usado para amplificações única célula, ou qualquer outra solução para o armazenamento do material colhido.
2. Para a colheita, você vai precisar de um microscópio de luz com uma objetiva de 40x equipado com um micromanipulador. Use um suporte de pipeta com tubos flexíveis para afastamento da titular. Apor a tubulação a uma superfície estável para evitar movimentos indesejados da pipeta durante a coleta. No final da tubulação, inserir uma agulha, para que uma seringa de 1 mL com uma conexão Luer-Lock pode ser anexado e mudou entre os usuários.
3. Se estiver usando lamínulas, trabalhar com uma lamela de cada vez. Se necessário, a transferência de uma lamela única para um prato milímetros novos 35 * contendo PBS ou mídia de sua escolha. Quanto mais tempo as células estão fora da incubadora, os mais insalubres eles se tornarão e quanto mais os seus perfis de mRNA vai desviar-se de que uma célula saudável. É fundamental para preservar a saúde das células sobre as lamelas outros, mantendo-os na incubadora quando não está trabalhando com eles. Trabalho o mais rápido possível com as células fora da incubadora.

* Com a nossa configuração é necessário usar a tampa de um prato de 35 mm desde as paredes do prato reais são altos demais para permitir o avanço adequado da micropipeta para o coverslip.

4. Células colheita

1. Assegurar a micropipeta no suporte micropipeta. Apor titular micropipeta para a inserção no micromanipuladores. Definir a objetiva de 40x.
2. Coloque o prato sobre o estágio do microscópio e descobrir uma região de células adequadas para a colheita. No caso de culturas primárias neuronais, a célula deve ser relativamente isolado de seus vizinhos para impedir a colheita de células vizinhas e / ou processos. A população de transcritos mRNA entre a soma e processos variam, por isso, se interessado em somáticas mRNAs apenas, os cuidados devem ser tomados para evitar a contaminação da soma com os processos. Coloque a célula que você deseja colheita no centro do campo de visão.
3. Use o micromanipulador para o avanço da micropipeta para a solução do prato para o caminho da luz. Inferior a ponta da pipeta na solução. Aplicar pressão positiva a partir deste ponto, soprando suavemente através da seringa. Olhar através da ocular. A pipeta deve aparecer como uma sombra no campo de visão. Bem acima do plano das células, ajustar a posição da ponta da pipeta até que seja dentro do campo de visão e foco na ponta da pipeta usando os botões grossa foco. Neste ponto, deve ser avaliado se o diâmetro da pipeta é muito grande ou muito pequeno. Colheita prática irá fornecer a capacidade para determinar se o tamanho correto furo foi alcançado neste momento.
4. Agora, o avanço da pipeta para o plano das células. É importante que a ponta não é avançado muito rapidamente, fazendo-a quebrar na região a partir do qual você deseja coletar. Para evitar isso, use o foco grosso para fazer avançar o plano focal antes de avançar a ponta da pipeta para as células usando o micromanipuladores. Quando você está perto para as células, use o foco bem até que ambas as células e a ponta da pipeta estão em foco. Parar de aplicar pressão positiva antes de chegar ao plano das células para prevenir soprando-los fora da lamela.
5. Use o micromanipuladores para posicionar a ponta da pipeta de modo que é tocar a soma das células que você deseja para a colheita.
6. Usando a seringa, aplique uma suave sucção pela boca até que a célula entra na ponta da pipeta. Se a célula não está entrando na pipeta, gentilmente mover a ponta mais perto do celular e para baixo até que ele se levanta da lamela.

5. Salvando o celular

1. Use o micromanipulador para mover imediatamente a pipeta cima e para fora da solução.
2. Retire a pipeta do titular.
3. Segure o tubo de Eppendorf 1,7 ml em uma das mãos e gentilmente quebrar a ponta da pipeta no lado do tubo em direção ao fundo. (Apontar para o 0,1 mL marca.)
4. Com a ponta quebrada centrada no interior do tubo, inserir uma agulha acoplada a uma seringa mL 1-3 na abertura superior da pipeta. Rapidamente o êmbolo forçando a solução na pipeta para pulverizar fora para dentro do tubo. A célula deve permanecer na ponta da pipeta e isso deve ser suficiente para expelir o adequadamente celular. Tenha cuidado para não tocar com a ponta para qualquer tipo de líquido nas laterais do tubo como ação capilar vai trazer de volta o líquido na pipeta.
5. Rapidamente girar o conteúdo do tubo de microcentrífuga usando um desktop e congelar imediatamente (armazenar a -80 ° C) ou colocar no gelo para posterior processamento (de preferência).

6. Amplificação ARNA

1. Round 1 síntese Primeiro domínio cDNA:
   Criar mRNA / híbridos cDNA.
   1. ML para cada 5 de único volume da célula de cobrança, adicionar 1x das seguintes opções para o tubo de coleta (no gelo). A reação pode ser ampliada para um maior volume de coleta (2x por 10 volumes coleção mL, etc.) Criar um master mix multiplicando os seguintes reagentes pelo número de tubos de coleta de mais de 10-20% para dar conta de pipetagem erro. Faça isso para todas as reações subseqüentes no procedimento ampification ARNA.
      • ON ICE
      • 1,2 mL de dNTP (2,5 mM cada)
      • 2,4 mL de buffer vertente 5x Primeiro
      • 0,3 mL de primer T7-oligo (dT) (100 ng / mL)
      • 1,2 mL TDT (100 mM)
   2. Até perfazer o volume para 10,25 mL com água livre de nuclease. Pipeta mix e girar rapidamente usando uma microcentrífuga.
   3. Incubar por 5 minutos a 70 ° C para desnaturar qualquer estrutura secundária do mRNA. Colocar imediatamente no gelo por pelo menos 5 minutos.
   4. Add (novamente usando um mix master):
      • 0,3 RNasin mL (40 U / mL)
      • 0,45 mL Sobrescrito III (200 U mL /)
      • 1 mL de água livre de nuclease
   5. Pipeta mix e brevemente spin. Incubar por 1 hora a 42 ° C.
   6. Incubar a 70 ° C por 15 minutos para inativar a Sobrescrito. Continue para a próxima etapa.
2. Round 1 síntese Segundo domínio cDNA
   Criar primers de RNA a partir da porção mRNA do híbrido mRNA / DNA para ajudar na síntese of dupla fita de cDNA.
   1. • ON ICE
      • Para a reação vertente 12 mL em primeiro lugar, acrescentar:
      • 8 mL de água livre de nuclease
      • 7,5 mL de buffer vertente 5x Segundo
      • 0,75 mL mix dNTP (2,5 mM cada)
      • 0,25 mL DNA ligase (10 U / mL)
      • Uma DNA polimerase mL I (10 U / mL)
      • 0,25 mL Rnase H (2 U mL /)
      Misturar bem por pipetagem e girar rapidamente. Incubar por 2 horas a 16 ° C.
   2. Adicionar: 1 mL T4 DNA polimerase (5 U / mL). Mix por pipetagem e brevemente spin. Incubar mais 10 minutos a 16 ° C.
   3. Limpar a reação usando o kit Qiagen MinElute conforme instruções do fabricante, com ligeiras modificações: ¹¹ Lavar 2 vezes com 500 mL de tampão de lavagem em vez de 1 hora com 750 mL. Eluir em água livre de nuclease.
   4. Concentre-se a 2-4 mL usando um Speedvac ou por precipitação de etanol. Para a precipitação de etanol, o glicogênio age como um transportador de ácido nucléico e é usado quando precipitando pequenas quantidades de DNA ou RNA. O sódio do acetato de sódio ajuda a neutralizar a carga negativa do DNA backbone, auxiliando na precipitação. Não é necessário fazer um mix master para precipitações de rotina.
      • Adicionar 29 mL de água DEPC
      • 2 mL de glicogênio (5mg/mL)
      • 10/01 volume (3 mL) de acetato de sódio 3M
      • 2,5 volumes (~ 250 mL) de etanol frio a 100%
      Misture bem. Precipitado a -80 ° C (30 min. A O / N).
   5. Centrifugar por 20 minutos a 4 ° C.
   6. Remover o sobrenadante e lavar o pellet com 800 mL de etanol 70%. Não se esqueça de deslocar o pellet seja por pipetagem ou vórtex para ajudar na remoção do excesso de sal.
   7. Centrifugar por mais 20 minutos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e secar por 15-20 minutos.
   8. Ressuspender em 4 mL de água livre de nuclease. Armazenar a -20 ou -80 ° C ou continuar para a próxima etapa.
3. Round 1 Na transcrição in vitro (IVT):
   Sintetizar RNA antisense do promotor T7 incorporados ao cDNA dupla fita.
   1. Esta reação é realizada usando o Ambion MEGAscript T7 kit conforme as instruções do fabricante, exceto escalado para uma mL 10 em vez de uma reação 20 mL. ¹² É imperativo para montar essa reação à temperatura ambiente e para manter o buffer em temperatura ambiente durante a montagem. O buffer fornecido vai precipitar o DNA se estiver frio gelo. Manter o PNT e misture enzima no gelo quando não em uso.
      • NA TEMPERATURA AMBIENTE
      • Transferir o cDNA dupla fita ressuspenso para um tubo de PCR paredes finas.
      • Adicione 4 mL NTP mix (18,75 mM cada)
      • Um tampão de reação 10x mL
      • Uma mistura de enzimas mL 10x
   2. Incubar 14 horas a 37 ° C em um termociclador (preferível) ou incubadora.
   3. Esta reação pode ser limpo usando dois métodos diferentes seguido de concentração da amostra, utilizando um Speedvac ou precipitação de etanol. Para limpeza usando um kit, vá para a A. Método Para limpar com um padrão de extração fenol / clorofórmio, vá para o Método B.
   4. Um método:
      1. Limpar a reação utilizando o kit Ambion Megaclear conforme instruções do fabricante, com cerca de ¹³ modificações: Lave 2 vezes com 500 mL de tampão de lavagem em vez de 1 hora com 750 mL. Para a etapa de eluição, adicionar 50 mL de água livre de nuclease para o centro da coluna, incubar a 70 ° C por 10 minutos. Giram a 10.000 g por 1 min. Repetir em um novo tubo. Combine eluatos. Concentre-se amostra a 2-4 mL usando um Speedvac ou por precipitação de etanol.
      2. Para a precipitação de etanol: acetato de amônio é usado no lugar de acetato de sódio, neste caso, porque é eficiente na prevenção de co-precipitação de nucleotídeos livre com o ácido nucléico. Isto é importante por causa da alta concentração de NTP é usado na reação IVT, que pode inibir reações a jusante.
         • Adicionar 50 mL de água DEPC
         • 2 mL de glicogênio (20 mg / mL)
         • 0,6 volumes (37,2 mL) de acetato de amônio 5M
         • 2,5 volumes (~ 180 mL) de etanol frio
      3. Precipitado a -80 ° C (30 min. A O / N) .*
      4. Centrifugar por 20 minutos a 4 ° C.
      5. Remover o sobrenadante e lavar o pellet com 800 mL de etanol 70% (em água livre de nuclease). Não se esqueça de deslocar o pellet para remover todo o sal em excesso.
      6. Centrifugar por mais 20 minutos a 4 ° C.
      7. Remover o sobrenadante e ar seco de 15-20 minutos.
      8. Ressuspender pellet em 4 mL de água nuclease livre.
   5. Método B:
      1. Alternativamente, o ARNA pode ser limpo com uma extração de padrão de fenol / clorofórmio.
         • Adicionar 50 mL de água DEPC
         • 2 mL de glicogênio (20 mg / mL)
         • 0,6 volumes (37,2 mL)Acetato de amônio 5M
         • 1 volume (98 mL) de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25:24:1 (pH equilibrado para 7,8-8,0)
      2. Vortex por 15 segundos. Centrifugar por 1,5 minutos na metade da velocidade máxima em microcentrífuga tampo da mesa. Transferir a camada superior aquosa para um novo tubo contendo 2,5 volumes (245 mL) de etanol frio.
      3. Precipitado a -80 ° C (30 min. A O / N).
      4. Centrifugar por 20 minutos a 4 ° C.
      5. Remover o sobrenadante e lavar pellet com 800 mL de etanol 70% (em água livre de nuclease). Não se esqueça de deslocar o pellet para remover todo o sal em excesso.
      6. Centrifugar por mais 20 minutos a 4 ° C.
      7. Remover o sobrenadante e ar seco de 15-20 minutos.
      8. Ressuspender pellet em 4 mL de água nuclease livre.
         
         * A amostra pode congelar a esta temperatura durante a incubação durante a noite. Tem sido demonstrado que isso pode realmente aumentar a produção de ácidos nucléicos.
4. Round 2 síntese Primeiro domínio cDNA
   1. • ON ICE
      • Adicionar 1 mL primers aleatórios (0,05 mg / mL) *
   2. Calor a 70 ° C por 10 minutos. Colocar imediatamente no gelo por pelo menos 5 minutos.
   3. • Adicione 2 mL de buffer vertente 5x Primeiro
      • 1 mL TDT (100 mM)
      • 0,5 mL de dNTP (2,5 mM cada)
      • 0,5 RNasin mL (40 U / mL)
      • 1 mL Sobrescrito III (200 U mL /)
   4. Misturar bem por pipetagem e girar rapidamente. Deixe descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. Esta etapa é necessária para permitir a extensão dos primers curtos aleatórios antes da reação de transcrição reversa é executada.
   5. Incubar durante 30 minutos a 42 ° C.
   6. Heat 5 minutos a 95 ° C para desnaturar o RNA em DNA / RNA híbridos. Colocar no gelo por pelo menos 5 minutos. Armazenar a -20 ° C ou -80 ° C ou imediatamente continuar para a próxima etapa.
      
      * A concentração de primers aleatórios é importante. Se a concentração é muito alta, o produto será mais truncado, com cada rodada de amplificação.
5. Round 2 síntese Segundo domínio cDNA
   1. • ON ICE
      • Adicione 2 mL de primer T7-oligo (dT) (10 ng / mL) *
   2. De calor por 5 minutos a 70 ° C. Colocar imediatamente no gelo por pelo menos 5 minutos. Girar por alguns instantes.
   3. • Adicionar 43,5 mL de água livre de nuclease
      • 15 mL de buffer vertente 5x Segundo
      • 1,5 mL mix dNTP (2,5 mM cada)
      • 2 mL DNA polimerase I (10 U / mL)
   4. Misturar bem por pipetagem e girar rapidamente. Incubar por 2 horas a 16 ° C.
   5. Adicione 2 mL T4 DNA polimerase (5 U / mL)
   6. Misturar bem por pipetagem e girar rapidamente. Incubar mais 10 minutos a 16 ° C.
   7. Limpar a reação usando o kit Qiagen Minelute como na Seção 6.2.3.
   8. Concentre-se a 2-4 mL com um Speedvac ou precipitação etanol como nas Seções 6.2.4 para 6.2.8.
      
      * Observe a concentração de ações diferentes de T7-oligo (dT) primário em comparação com a síntese de primeira vertente segunda rodada cDNA.
6. Round 2 Na transcrição in vitro
   Executar como na Seção 6.3.
   1. Repita Seções 6,4-6,6 número desejado de vezes. Note que cada rodada subseqüente de resultados de amplificação em produtos mais curtos ARNA. O número de rounds de amplificação deve ser limitado por este motivo. Normalmente dois a três rodadas de amplificação são suficientes para amplificar o material colhido de uma única célula para realizar a análise microarray. No caso da análise de microarray, a terceira reação IVT rodada é realizada usando a Illumina TotalPrep Kit de amplificação do RNA de acordo com as instruções do fabricante. Este procedimento incorpora biotina UTP, marcado para o ARNA que é então utilizado para a detecção em um chip de microarray.
   2. Medir a concentração de ARNA terceira rodada usando um Nanodrop ou Agilent Bioanalyzer com um RNA Nano kit.

7. Resultados representante

Colheita bem sucedida de uma única célula de culturas primárias de neurônios pode ser concluído em menos de 2 minutos, dependendo da aptidão (ver Figura 1). Entretanto, o tempo para a colheita irá variar entre sistemas e com a intervenção de manipulação experimental. Sujeitando a única célula para o procedimento ARNA (ver Figuras 4A e 4B) resulta em quantidades de microgramas ARNA amplificada total e produz um pico característico ampla quando analisadas com um Bioanalyzer (ver Figura 3). Três rodadas pode ser concluído em um mínimo de três dias, permitindo a análise rápida de expressão única célula gene.

Figura 1. Mostrado é um exemplo de uma colheita bem sucedida de um neurônio isolado. Nós seleCTED uma região relativamente baixa densidade (A) e avançados a ponta da pipeta para o celular desejado (B). A terceira imagem (C) mostra o campo de visão após a célula tinha sido colhida. Note-se que os processos em torno permanecer na lamela.

Figura 2. Mostrado estão duas imagens de ponteiras, que são um tamanho inadequado para a colheita eficaz. Essas dicas vão levar a safra incompleta (A) e colheita de meio envolvente (B), respectivamente.

Figura 3. Colheita seguinte e análise de amplificação, usando um Bioanalyzer é recomendado para examinar a distribuição ea quantidade de RNA amplificado. A amplificação de sucesso a partir de material única célula renderá montantes totais na microgramas baixo e terá uma distribuição que é suave e largura.

Figuras 4. Schematics do primeiro turno (A) e segunda rodada (B) do procedimento ARNA são mostrados.

Discussão

Notas e solução de problemas

• Você pode querer tomar antes e depois de imagens mostrando que a célula-alvo foi isolado e que a penumbra restante foi deixado intocado.
• Se demasiada solução é entrar na pipeta como você está colhendo, você pode usar 3 vias Luer-Lock e acessórios para o êmbolo da seringa para manter pressão positiva na tubulação. O volume desejado irá variar com o tipo de processamento, mas até 5 mL deve ser bom para a maioria das aplicações.

Dicas gerais sobre técnicas da biologia molecular

• Vortex todos os tubos de ações e spin-las antes de adicionar a uma reação. NUNCA enzimas vortex.
• Misturar bem reações antes de adicionar a enzima para garantir que o buffer está na concentração adequada.
• Manter o estoque de enzimas a -20 ° C, se possível usando um stratacooler. Caso contrário, remova direito antes do uso, manter no gelo, e retornar imediatamente a -20 ° C.
• Sempre fazer misturas de mestre na elaboração de mais de uma reação para reduzir os erros de pipetagem. Calcular o volume necessário com base no número de amostras e adicionar 10-20%.
• Loja RNA a -80 ° C para a degradação retard. RNA é mais estável armazenados em buffer para retardar apurination de RNA que ocorre em condições ácidas.

Esquema Geral do Procedimento ARNA

Figura 4A ilustra a primeira rodada do processo de ARNA. Na reação de primeira vertente, a parcela de poli-T da T7-oligo primer (dT) seleciona para as espécies de mRNA (retângulo branco longo) ligando-se à cauda poli. Alguns microRNAs são também polyadenylated e será capturado por esse procedimento. Mais importante, porém, os RNAs mais abundante na célula, RNAs ribossomais, não. Este oligo funciona como um primer para transcriptase reversa para sintetizar uma fita complementar de cDNA (retângulo cinza longo) usando o mRNA como um modelo. A porção do T7 T7-oligo primer (dT) incorpora o promotor T7 RNA polimerase no quadro com a seqüência de antisense para o mRNA de partida. Esta é usada mais tarde na reação in vitro de transcrição.

Em seguida, o mRNA no híbrido mRNA / DNA criado na etapa anterior é parcialmente hidrolisada por Rnase H criação de RNA "primers" (pequenos retângulos brancos), semelhante aos fragmentos Okazaki criado em síntese lagging strand DNA. DNA Polimerase I utiliza fragmentos de RNA para preparar a síntese de DNA usando o DNA complementar ao mRNA como um modelo. Quando atinge o fragmento de RNA que vem, seus 5 'para 3' atividade nuclease remove o ribonucleotídeos e substitui-los com desoxirribonucleótidos. DNA ligase é adicionado a qualquer ligadura vertentes em que a substituição da fita líder não está completo. Polimerase DNA T4 é adicionada para preencher as áreas onde fragmentos de RNA serviu como primers inicial para Polimerase DNA eu criar uma ponta e dupla fita de cDNA, que depois é purificado antes de realizar a reação IVT.

Na reação IVT, T7 RNA polimerase se liga ao promotor T7 incorporados ao cDNA dupla fita e sintetiza moléculas de RNA antisense (long retângulos pretos), utilizando a vertente sentido como um modelo. Isto serve como etapa de amplificação em que milhares de moléculas de RNA antisense são produzidos a partir de cada molécula de cadeia dupla de cDNA (Figura 4A).

A segunda rodada, conforme apresentado na Figura 4B, começa com uma reação de transcrição reversa, que é ligeiramente diferente da primeira rodada desde o RNA de partida é antisense (retângulo preto sólido) e não tem o rabo polyadenylated que foi alvo pela T7-oligo (dT) primário no primeiro turno. Portanto, essa reação é preparado com primers aleatórios (pequenos retângulos cinza) e posteriormente o RNA desnaturado. A reação segunda vertente é, então, preparado pela T7-oligo primer (dT), que se liga ao poli-A seqüência na extremidade 3 'do RNA sentido criado na reação de transcrição reversa anteriores. Outra reação IVT é realizada na mesma maneira que no primeiro turno. Esta segunda ronda geralmente é repetido pelo menos uma vez para atingir três rounds de amplificação de uma única célula.

Aplicações

As técnicas que apresentamos neste artigo pode ser traduzido em um grande número de aplicações. O protocolo de isolamento única célula pode ser modificado para uso em fatias aguda. ¹⁴ Embora tecnicamente mais desafiador, os mesmos princípios se aplicam nesta preparação alternativo. Além disso, se o tamanho da pipeta é ligeiramente ajustada, as gravações da fisiologia das células pode ser feita antes da colheita permitindo uma investigação bem controlados dos mecanismos moleculares por trás saídas fisiológicas. Outra pequena modificação é isolar os processos da soma das células. ¹⁵ Para esta aplicação, recolher corpos celulares com uma pipeta e depois voltar com uma pipeta nova e recolher 100-300 Dendrit identificadoses ou axônios por tubo de coleta. ¹⁶

Uma vez que as células foram colhidas, as comparações de abundância de mRNA e composições podem ser feitas entre diferentes e mesmo dentro da mesma célula populações. Incorporando-biotinilado UTP no ARNA terceira rodada microarray permite a análise para determinar esses abundâncias mRNA relativo. A composição da população mRNA original pode também ser determinada após o procedimento ARNA utilizando seqüenciamento da próxima geração. O ARNA amplificados também podem ser usados ​​para confirmar os estudos de células fenótipo de conversão em que um conjunto completo de mRNAs de um tipo de célula são transfectadas em um tipo de célula diferente, a fim de induzir a transição do fenótipo do tipo de célula última em que do primeiro, um procedimento desenvolvido pelo laboratório e conhecido como TIPeR ^17. Esses estudos são particularmente úteis para o estudo de estados de doença e fenótipos celulares e tais estudos estão em andamento no laboratório. RT-PCR ou qPCR pode ser realizada sobre o material amplificado para confirmar a expressão de genes específicos de células. Além disso, as avaliações da eficiência de transfecção ou transdução pode ser feita no nível da célula única.

Vantagens e Limitações

Como dito no resumo, o isolamento de células individuais para análise elimina os efeitos média de visto com a análise de populações de células heterogêneas. Estes efeitos média deturpar abundâncias mRNA em uma única célula por excesso de transcrições representando abundante e média para fora e evitar a detecção de muitos de baixa abundância transcrições. Citometria de fluxo pode ser usado para classificar as células individuais, mas este método requer o conhecimento de marcadores celulares específicos e equipamentos caros. ¹⁸ microdissecção de captura a laser ou com sistemas de laser UV ou IR microdissecção de captura permitem única célula e até mesmo a captura subcelulares, mas requer células de interesse para estar localizados na superfície de seções muito finas. ¹⁹ Semelhante a citometria de fluxo, laser microdissecção de captura também exige equipamentos caros.

Um dos principais benefícios da técnica de coleta de eletrodo baseado descrito acima é que valiosos dados eletrofisiológicos pode ser obtido a partir da célula de interesse antes da colheita, permitindo a análise funcional e transcriptoma a ser realizada na mesma célula. ²⁰ A desvantagem da nossa técnica é que exige experiência com micromanipuladores. Investigadores familiarizados com micromanipuladores encontrará esta técnica muito intuitiva, no entanto, os indivíduos com tal experiência será necessário tornar-se confortável com os movimentos bem necessário.

Inerentes a qualquer técnica de amplificação é a amplificação preferencial de certas transcrições com base no tamanho e na composição de nucleotídeos. ^4,6,7 reação em cadeia da polimerase (PCR), tais como técnicas baseadas transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e amplificação rápida de cDNA termina resultado (RACE) na amplificação exponencial de transcrições, enquanto que o procedimento de amplificação ARNA resultados na amplificação linear. Assim, uma das principais vantagens do procedimento ARNA reside na sua capacidade de preservar melhor a abundância relativa de transcritos mRNA por apenas linearmente ampliando quaisquer erros ou desvios que ocorrem no processo de amplificação em oposição a amplificar exponencialmente disse erros e distorções.

O procedimento ARNA juntamente com a análise de microarray permite a comparação da abundância de mRNA entre as células individuais da morfologia semelhantes ou diferentes, tratada ou não. Além disso, material amplificado podem ser enviadas para o seqüenciamento da próxima geração. ^5,8 No entanto, o cuidado deve ser tomado em tais análises, pois, em contraste com o uso de primers aleatórios para o procedimento, o procedimento de oligo-dT preparado descrito acima preconceitos amplificação do 3 'extremidades do mRNA e geralmente resulta em redução ligeira de material amplificado subseqüente a cada rodada. Cuidados devem ser tomados na análise dos resultados microarray com métodos padrão como algumas chamadas falsas ausentes podem surgir a partir ligeiramente encurtado material amplificado. Além disso, os resultados enquanto o seqüenciamento vai realmente proporcionar a plena 5 'seqüência da maioria dos mRNA original, a 5' seqüências de alguns mRNA pode ser desperdiçada. Por estas razões, o número de rodadas de amplificações devem ser limitados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spiegelgas coverslips	Carolina Biological	63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes	Fisher Scientific	12-565-90
Water for cell culture	Lonza Inc.	17-724Q	For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K	Sigma-Aldrich	6407
Laminin, ultrapure	BD Biosciences	354239
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax	Invitrogen	41090-101	For plating cells
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Horse serum	Invitrogen	16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Invitrogen	11095-098	For growing cells
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)	Kimble Chase	34500 99	Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS	Invitrogen	14175	Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe	BD Biosciences	309628
Needle	BD Biosciences		Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix	Amersham	28-4065-51
dt-T7 oligo	Custom	Midland Certified
Second strand buffer (5x)	Invitrogen	Y01129
DTT			Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase	Invitrogen	100002324
DNA polymerase I	Invitrogen	100004926
Rnase H	Invitrogen	18021-071
Megascript T7 kit	Ambion	AM1334
Random primers	BMB	11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	56575	in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit	Ambion	1908
MinElute Reaction Cleanup Kit	Qiagen	28206
T4 DNA polymerase	Invitrogen	100004994
Rnasin	Promega Corp.	N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit	Ambion	AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-87	Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator	Olympus Corporation		Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder	Warner Instruments	MP-S15A	Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511