Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

Resumo

Este protocolo vídeo demonstra como discriminar e enumerar bona fide células-tronco neurais em uma população mista de células precursoras neurais utilizando o ensaio de célula neural formadoras de colônias.

Resumo

O ensaio neurosphere (NSA) é um dos métodos mais usados ​​para isolar, expandir e também calcular a freqüência de células-tronco neurais (NSCs). Além disso, este sistema de cultura sem soro também tem sido usado para expandir células-tronco e determinar sua freqüência a partir de uma variedade de tumores e tecidos normais. Foi demonstrado recentemente que um relacionamento um-para-um não existe entre a formação neurosphere e NSCs. Isto sugere que a NSA como actualmente aplicado, superestima a freqüência de NSCs em uma população mista de células precursoras neurais isoladas tanto o cérebro embrionárias e adultas dos mamíferos. Este vídeo demonstra praticamente um romance baseado colágeno semi-sólido ensaio, a neural-formadoras de colônia ensaio de células (N-ACCP), que tem a capacidade de discriminar-tronco a partir de células progenitoras com base em seu potencial de longo prazo proliferativa, e, portanto, fornece um método para enumerar freqüência NSC. No N-CFCA, colônias ≥ 2 mm de diâmetro são derivadas de células que cumprem todos os critérios funcionais de NSC, enquanto colônias <2mm são derivadas de células progenitoras. O procedimento de N-CFCA pode ser usado para as células preparadas a partir de diferentes fontes, incluindo adultos primário e cultivadas ou células do SNC embrionárias de camundongos. Aqui usamos células preparadas a partir de uma passagem neurospheres gerados a partir de dia embrionário 14 cérebro de ratos para realizar N-CFCA. As culturas são reabastecidos com meio de proliferação a cada sete dias durante três semanas para permitir que as células banhado a exibir todo o seu potencial proliferativo e, em seguida, a freqüência de progenitoras neurais e de boa-fé células-tronco neurais são calculados, respectivamente, por contagem do número de colônias que são <2mm e os que estão ≥ 2mm em referência ao número de células que foram inicialmente banhado.

Protocolo

1. Itens que precisam ser preparados antes de prosseguir para Galvanização Cell:

1. Volume apropriado de meio NSC completo é preparado pela mistura NeuroCult NSC Basal Medium e Suplementos NeuroCult NSC Proliferação na proporção 9:1, respectivamente.
2. Uma alíquota de NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas é descongelado.
3. O meio é aquecido em banho-maria a 37 ° C.
4. Soluções estoque de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF), na concentração de 10 mcg / mL e heparina em 0,2% estão dispostos à frente.
5. Dependendo do tamanho experimento, várias placas de cultura de 35 milímetros de tecido são necessários para a placa de células e um 150-200cm de plástico placa de Petri também é necessária para manter os pratos duplicar 35mm e um terceiro prato 35mm para água.

2. Preparação de células:

Dependendo do seu experimento, as células podem ser preparados a partir de uma fonte adulta ou embrionária (tecido dissociado primária ou neurospheres dissociada). Dissecar os tecidos do adulto / embrionárias mouse do sistema nervoso central (SNC) ou dissociar neurospheres adulto / embrionárias derivadas de ^1,2 como descrito anteriormente e, em seguida:

1. A suspensão única célula é passado através de um filtro de malha 40 mícrons de tamanho, de modo a remover não-dissociada aglomerados.
2. 10μl da suspensão de células é misturado com 90μl de Trypan azul para realizar uma contagem de células. Nota: Outras diluições célula apropriada também pode ser usado.
3. Se estiver usando embrionárias primárias ou adultas derivadas de células neurais, diluir a suspensão de células a uma concentração de 6,5 x 10 ⁵ células / mL em meio NSC completa. Se estiver usando células de neurospheres dissociada derivado de adulto ou embrionárias células neurais, diluir a suspensão de células a uma concentração de 2,2 x 10 ⁵ células / mL em meio NSC completa.

3. Células chapeamento em meio semi-sólido N-CFCA:

1. O volume apropriado dos seguintes componentes é misturado em ordem, dependendo do número de repetições. Aqui nós misturamos o montante necessário para duas repetições ou duplicar pratos. Para os números de repetições adicionais, consulte a tabela 1.
   • 1,7 mL de NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas
   • 330 mL de Suplementos NeuroCult NSC Proliferação
   • 6,6 mL de EGF (10μg/mL)
   • 32 mL de penicilina / estreptomicina
   • 3,3 mL de b-FGF (10μg/mL) necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural.
   • 3,3 mL de heparina (0,2%) necessitaram de apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural.
   • 25μL da suspensão de células (de 2,2 x 10 ⁵ células / mL de células neurospheres dissociada ou 6,5 x 10 ⁵ células / mL pilhas de tecido do SNC dissociado). Nota: Os números célula final deve ser banhado a cerca de 2500 células por milímetro 35 placa de cultura para neurosphere células derivadas e 7500 células por 35 mm para placa de cultura de células primárias. Em alguns casos, a densidade de células de revestimento final, tem que ser ajustada através da realização de um experimento de titulação celular. Para as análises estatísticas, o número total de colónias detectadas após 21 dias de cultura deve estar dentro do intervalo de pelo menos 50-150 colônias.
2. O meio contendo as células é misturado com cuidado e, em seguida, 1,3 mL de solução de colágeno frio é transferido para a suspensão de células e misturar bem pipetagem suave para evitar a introdução de bolhas.
3. A solução mista é dispensado para o centro de cada placa de cultura de 35 mm (~ 1,5 mL / prato) e os pratos estão inclinados suavemente com movimentos circulares para que a mistura espalhada uniformemente sobre a superfície do prato. .
4. A segunda via placas de cultura de 35 mm são colocados em uma placa de 100 milímetros Petri. A tampa do prato milímetros novo 35 é removido eo prato aberto também é colocado no prato de 100 milímetros mesma Petri. Água estéril é adicionado a este prato mm abrem 35 para manter a umidade ideal durante o período de incubação. Placas de bioensaio quadrado (245 mm) são usadas quando mais replicar 35 milímetros pratos foram criados. Mais uma vez, incluir 2 ou 3 abertas 35 pratos mm contendo água estéril.
5. As placas são transferidas para um conjunto de incubadora a 37 ° C, 5% CO2 e umidade de 95%. O colágeno congela por aumento da temperatura ea formação de gel irá ocorrer dentro de aproximadamente uma hora. As culturas não deve ser perturbado durante este tempo.
6. Células em cultura são incubados por 21 dias (diferenças de tamanho da colônia pode ser claramente distinguido após 21 dias).

4. Preparando Médio Replenishment e Alimentação da Cultura:

Como N-CFCA culturas são incubados por um período de tempo prolongado (21 dias), as culturas devem ser alimentados com a NeuroCult apropriado completo médio de reposição preparado fresco da seguinte forma:

• 4,5 mL de NeuroCult NSC Basal Medium é misturado com 0,5 mL de Suplementos NeuroCult NSC Proliferação Nuclear e, em seguida, os fatores de crescimento é adicionado:
• 250 L de 10μg/mL EGF (para dar uma concentração final de 0,5 mg / mL EGF)
• 125 mL de 10μg/mL b-FGF (para dar uma concentração final de 0.25μg/mL b-FGF) necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural.
• 125 mL de heparina de 0,2%, necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural.
• 60 mL do Médio completo Replenishment NeuroCult apropriado (por células embrionárias ou adultas) é adicionado para o centro de cada prato Assay NCFC uma vez a cada sete dias durante a incubação cultura NCFC Assay inteiro (21 dias).

5. Colônias de pontuação N-CFC Assay Derivados e Cálculo da Freqüência de bona NSCs Fide e células progenitoras neurais:

• Cada placa de cultura 35 mm é colocado em um prato de pontuação em grade com o tamanho da grade de 2,0 mm x 2,0 mm e, em seguida, ambos os pratos são colocados no palco microscópio.
• Usando baixa potência (2.5X - 5X) objetiva de cada prato é digitalizado e as colônias são pontuadas com base em seus tamanhos.
• Colônias são classificadas em duas categorias principais:
  1. Menos de 2 mm de diâmetro
  2. ≥ 2 mm de diâmetro

6. Resultados representativos:

Como no ensaio neurosphere, as células semeadas em N-CFC ensaio começam a proliferar e fazer pequenas colônias de células dentro de 3-7 dias após o revestimento (Figura 1). Dentro de duas semanas, as colônias de tamanhos diferentes podem ser distinguidos. Embora a maioria das colônias tende a parar de crescer após 14 dias, algumas colônias continuam a aumentar de tamanho. Ao dia 21, as colônias podem ser classificados em uma das quatro categorias: 1) menos de 0,5 mm de diâmetro, 2) 0,5-1 mm de diâmetro, 3) 1-2 mm de diâmetro e 4) ≥ 2mm de diâmetro. Praticamente, colônias menores que 2 mm de diâmetro são referidos como progenitor derivados (Figura 2) e colônias ≥ 2mm de diâmetro são denominados NSC derivados (Figura 3). O número de colónias ≥ 2mm de diâmetro por células totais chapeado, representa a freqüência da real bona fide células-tronco neurais de longo prazo auto-renovação e potencial multi-capacidades. O total de neurosphere formando freqüência em uma determinada população celular após 7-8 dias em um experimento paralelo NSA foi estimado para ser semelhante ao do total da colónia formando freqüência da população de células mesmo após 21 dias em um experimento de N-CFCA. O N-CFCA no entanto, oferece uma condição mais permissiva, de modo cada célula pode mostrar todo seu potencial proliferativo.

Componente	2 repetições	3 repetições	4 repetições
NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas	1700	2550	3400
NeuroCult NSC Suplementos Proliferação	330	495	660
EGF (10 mcg / mL)	6,6	9,9	13,2
bFGF (10 mcg / mL), apenas para células adultas	3,3	4,95	6,6
Solução de heparina (0,2%), apenas para células adultas	3,3	4,95	6,6
Penicilina estreptomicina / (1:100)	32	48	64
Células em: 2,2 x 10 5 cultura de células / ml ou 6,5 x 10 5 células primárias / mL	25	37,5	50
Solução de colágeno	1300	1950	2600

Tabela 1. Componentes da cultura ensaio completo N-CFC.

Figura 1. Colônias Representante na N-CFCA cultura de NSCs uma passagem E14 rato sete dias após o plaqueamento. As colônias podem exibir morfologia diferente e tamanho. Ampliação original; 4x

Figura 2. Colônias progenitor Representante derivados de diferentes tamanhos em N-CFCA cultura de uma passagem do mouse E14 NSCs 21 dias após o plaqueamento. Como mostrado, as colônias têm morfologia diferente, mas todos são mm menos 2 em tamanho. Ampliação original; 4x

Figura 3. Representante bona fide de células-tronco derivadas colônia em N-CFCA cultura de uma passagem do mouse E14 NSCs 21 dias após o plaqueamento. Colônias de células-tronco derivadas podem exibir morfologia diferentes (vero vídeo), mas todos são ≥ 2mm de diâmetro. Ampliação original; 4x

Discussão

Embora ensaio neurosphere ^3,1,2 é o método mais comum para isolar e expandir as células-tronco neurais de uma variedade de fontes como adultas e embrionárias tecido do SNC, que não pode medir com precisão a freqüência NSC em uma população mista de células precursoras neurais (caule e progenitores) como não há uma relação de 12:59 entre o número de neurospheres eo número de bona fide células-tronco ^4. Para resolver esta limitação, a NSA original foi adaptado de modo a permitir o tronco neurais e progenitores a crescer a sua capacidade de proliferação integral, durante três semanas ^5-7. Ao contrário da NSA líquido, na N-CFCA as colônias são realmente clones derivados, como a matriz de colágeno semi-sólido impede a migração das células único banhado e agregação de colônias. Para obter resultados consistentes com este ensaio, recomendamos:

1. Garantir uma suspensão única célula na suspensão celular original. Passe sua suspensão única célula através de um filtro de malha 40 mícrons de tamanho, de modo a remover não-dissociada aglomerados.
2. Manter a solução de colágeno no gelo ou no frigorífico 4 C °. O colágeno é o último item a ser adicionado à mistura de suspensão de células, uma vez que congela, aumentando a temperatura.
3. Não se esqueça de alimentar a cultura a cada semana. Adicionando o meio contendo reposição do fator de crescimento (s) uma vez a cada sete dias irá permitir que as células continuam a proliferar durante o período de cultura prolongada.
4. A densidade de células de revestimento final, foram otimizados para células derivadas de células primárias ou neural ou cultivadas de modo que o número total de colónias detectadas após 21 dias de cultura na NCFC-A está dentro da faixa de pelo menos 5-20 colônias. Esta gama permite a detecção dos raros NSC colônias derivadas> 2mm de diâmetro em amostras ao fornecer um número suficiente de colônias para análises estatísticas. Dependendo da fonte de célula inicial, um número significativamente menor (<50) e um maior número de colônias (> 250) são por vezes obtidos. Colônias muito poucos resultará nas colônias> 2mm de diâmetro sendo abaixo dos níveis de detecção, enquanto colônias demais resultará em anddepletion superlotação dos componentes do crescimento a médio, resultando em uma contagem de colônias imprecisas. Portanto, a densidade de células de revestimento deverá ser ajustada em conformidade (isto é, aumentando ou diminuindo o número total de células plated)

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
NeuroCult NCFC medium	Medium	Stem Cell Technologies	05720
0.05% trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
Collagen	Reagent	Stem Cell Technologies	04902
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
35 mm culture dishes	Culture ware	Stem Cell Technologies	27100
Gridded scoring dishes	Culture ware	Stem Cell Technologies	27500