Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

Resumo

O retículo endoplasmático desempenha um papel fundamental na biogênese de proteínas e na homeostase do cálcio. Nós estabelecemos um sistema experimental que nos permite abordar o papel dos canais de Ca2 + de vazamento e para caracterizar o suposto mecanismos de regulação. Este sistema envolve siRNA silenciamento gênico mediado e de células vivas Ca2 + imagem.

Resumo

Em células de mamíferos, o retículo endoplasmático (ER) desempenha um papel fundamental na biogênese protéica, bem como em cálcio sinalização ^1. O complexo Sec61 heterotrimeric na membrana ER fornece um caminho de solução aquosa de polipeptídeos recém-sintetizada para o lúmen do ER. Trabalhos recentes de vários laboratórios sugeriu que este complexo heterotrimeric também podem formar Ca ^{2 +} transitória canais de vazamento ^2-8. A observação fundamental para esta noção era que a liberação de polipeptídeos nascentes do ribossomo e Sec61 complexo puromicina leva à liberação transiente de Ca ^{2 +} do ER. Além disso, havia sido observado in vitro que a proteína ER luminal BiP está envolvido na prevenção de permeabilidade de íons ao nível do Sec61 ^9,10 complexo. Nós estabelecemos um sistema experimental que nos permite abordar diretamente o papel do complexo Sec61 como potenciais canais de Ca ^{+ 2} de vazamento e para caracterizar a sua putativa mecanismos reguladores ^11-13. Este sistema combina siRNA silenciamento gênico mediado e de células vivas Ca ^{2 +} imagem ^13. Células são tratadas com siRNAs que são dirigidos contra a codificação e região não traduzida (UTR), respectivamente, do gene SEC61A1 ou uma siRNA controle negativo. Na análise de complementação, as células são co-transfectadas com um vector IRES-GFP, que permite que o siRNA resistente à expressão do gene SEC61A1 tipo selvagem. Em seguida, as células são carregados com o Ca ^{2 +} raciométrica indicador-FURA-2 para monitorar simultaneamente alterações na Ca ^{2 +} citosólico concentração em um número de células através de um microscópio de fluorescência. A medição contínua de Ca ^{2 +} citosólico também permite a avaliação do impacto de vários agentes, tais como puromicina, inibidores de molécula pequena, e tapsigargina em Ca ^{2 +} vazamento. Este sistema experimental nos dá a oportunidade única de i) avaliar a contribuição de diferentes proteínas da membrana para ER passiva Ca ^{2 +} efluxo do ER em vários tipos celulares, ii) caracterizar as proteínas e os mecanismos que limitam esse passivo Ca ^{2 +} de efluxo e iii) estudar os efeitos das mutações doença ligada nos componentes relevantes.

Protocolo

1. Preparação das soluções de reserva

1. Prepare-cálcio livre de buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 0,5 mM EGTA, 10 mM de glicose em 10 mM HEPES-KOH (pH 7,35)).
2. FURA-solubilizar 02:00 em DMSO para obter uma solução estoque 1 mM. Misture usando um vortex até que a solução é amarelo claro de forma homogênea. Proteger copo da luz. Diluir o FURA-2:00 solução estoque em 1 ml Dulbecco modificado da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina para uma concentração final de 4 mM para o carregamento de células HeLa.
3. Prepare uma solução estoque 12,5 mM puromicina em água destilada (pH 7,0). Alíquotas armazenar a -20 ° C. Diluir a solução estoque 12,5 mM puromicina no buffer livre de cálcio para uma concentração final de 500 mM puromicina.
4. Dissolver tapsigargina em DMSO para obter uma solução a 1 mM de stock.
5. Solubilizar 1 mg ophiobolin A em 20 mL de clorofórmio e, em seguida, misturar com 25 mL de DMSO. O tubo de microcentrífuga permanece aberta até o clorofórmio é evaporado. Assim, o ophiobolin final A concentração é 100 mm. Alíquotas armazenar a -20 ° C. Antes do uso, diluir as soluções estoque em cálcio livre de buffer para uma concentração final de 100 mM. Assim, a concentração de DMSO final para imagens de células vivas não exceda 0,1%.
6. Dissolver trifluoperazina em DMSO a uma concentração de 10 mM e alíquotas armazenar a -20 ° C. Soluções diluídas em estoque de cálcio livre de buffer para uma concentração final de 10 mM antes do uso. Assim, a concentração final para DMSO imagens de células vivas, como por ophiobolin A, não exceda 0,1%.
7. Dissolver os siRNAs (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR e siRNA siRNA de controle) em água livre de RNase para preparar uma solução estoque 20 mM. Misture usando um vortex e observar solubilização a olho nu. Armazenar 50 mL alíquotas a -20 ° C.

2. Silenciamento de genes em células HeLa

, A fim de estudar a contribuição de uma determinada proteína para ER Ca ^{2 +} de efluxo, o respectivo gene tem que ser eficiente silenciada com duas diferentes siRNAs (Fig. 1). Além disso, o efeito do silenciamento tem de ser superado pela expressão do gene respectivo tipo selvagem. Normalmente usamos siRNAs que são dirigidos contra a codificação e não-codificantes região (UTR), respectivamente, do gene de interesse. Empregando UTR-dirigido siRNA fornece uma maneira conveniente para complementação.

1. Sementes 5,2 x 10 ⁵ células HeLa (ATCC n º. CCL-2) em uma placa de cultura 6 centímetros com uma lamínula de 25 mm (pré-tratados com 200 mL de poli-L-lisina (1 mg / ml) por 1 h) em Dulbecco modificado da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina e incubar a 37 ° C em um ambiente umidificado com 5% de CO ₂ (volume final 3,9 ml).
2. Transfecção as células com SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA, ou uma siRNA controle negativo usando reagente HiPerFect acordo com as instruções do fabricante (concentração final de siRNA: 20 nM). Brevemente, prepare siRNAs recentemente em um tubo de microcentrífuga separado antes do procedimento de transfecção real: Adicionar 20 mL de reagente de transfecção HiPerFect a 4 mL de cada siRNA (20 mM) que é dissolvido em 80 mL de OptiMEM. Esta mistura é gentilmente agitadas e incubadas em temperatura ambiente por 10 min. Adicione a mistura de siRNA (104 mL) gota a gota a 5,2 semeado x 10 ⁵ células HeLa (3,9 ml).
3. Após 24 h, alterar o meio (3,9 ml) e transfecção as células pela segunda vez com a mistura siRNA mesma (104 mL).
4. Avaliar o silenciamento por Western blot. Deve ser acima de 80%. Lave as células da placa de cultura de células em tampão fosfato (PBS) e colhê-las em DMEM. Contar as células, empregando a Condessa contador de células automatizado. Lisar as células em tampão de lise celular (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 mM MgCl _2, 0,5% NP40) suplementado com um coquetel de inibidores da protease (3 mg / ml Pepstatin A, 3 mg / Leupeptin ml, 3 mg / ml Antipaína, 3 mg / ml Chymastatin) e misture com amostra SDS-buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, 5% β-mercaptoetanol, 0,01% azul de bromofenol ) para obter uma concentração final de 10.000 células / ml. Amostras de calor a 56 ° C por 15 min e, posteriormente, adicionar algumas gotas glas e vortex por 20 min para o DNA do fragmento. 20 mL em separado de cada amostra por uma Laemmli do tipo SDS-PAGE (tipicamente 15% polyacrylamid para o gel de separação). Transferência de proteínas separadas em uma membrana de PVDF por eletrobloting ("wet-blot") em 400 mA constante por 3 horas ou durante a noite em tampão de transferência (100 mM glicina, 12,5 mM Tris-HCl). Depois, bloco com 5% (w / v) leite desnatado secas em PBS por 30 min em temperatura ambiente e, em seguida, expor o blot para o anticorpo primário dirigido contra o C-terminal de Sec61α de coelho e um anti-β-actina anticorpo de rato. Lave a mancha em 100-PBS-tritonX (0,05%) e tWICE em PBS por 5 min, respectivamente. Visualize os anticorpos primários utilizando ECL Plex-cabra anti-IgG de coelho-Cy5 ou ECL Plex-cabra anti-mouse IgG-Cy3-conjugado e do sistema de imagem Typhoon Trio em combinação com a imagem Quant TL software 7.0. No caso do gene SEC61A1, o efeito máximo silenciar é tipicamente visto 96 h após a transfecção em primeiro lugar. Um experimento representativo é mostrado na figura. 2.

3. Complementação das células HeLa

A fim de resgatar o fenótipo de SEC61A1 silenciamento, o cDNA SEC61A1 foi inserido no sítio múltiplo de clonagem (MCS) de um local de entrada pcDNA3 interna ribossomal (IRES)-GFP vetor que continha o citomegalovírus (CMV), promotor do MCS, o IRES, além da proteína fluoresecent verde (GFP) seqüência de codificação.

1. 48 h após a transfecção siRNA em primeiro lugar, troca o meio (3,9 ml) por uma segunda vez e transformar as células com um vetor vazio ou SEC61A1 expressão plasmídeo usando Fugene HD acordo com o protocolo do fabricante (razão final de vetor para Fugene HD é de 4 mg vector a 16 mL Fugene HD). Brevemente, prepare plasmídeos recentemente em um tubo de microcentrífuga separado antes do procedimento de transformação: Adicionar 16 mL de reagente Fugene transformação HD a 4 mg de cada plasmídeo que é dissolvido em 80 mL de OptiMEM. Delicadamente misturar este vortex e incubar em temperatura ambiente por 10 min. Adicione a mistura de plasmídeo (0,1 ml) gota a gota para o semeado 5,2 x 10 ⁵ células HeLa (3,9 ml).
2. Após 48 h de expressão plasmídeo, placas de cultura sujeitos a microscopia de fluorescência antes da imagem de cálcio e colheita. Se necessário, substitua por DMEM PBS para melhor sinais de fluorescência. Gravar imagens de fluorescência em um microscópio de fluorescência equipado com câmera CCD refrigerado. Eficiência de transformação pode ser determinado pela divisão do número de células mostrando fluorescência da GFP por células contadas no modo claro e deve ser acima de 80%. Um resultado típico é mostrado na figura. 3.

4. Imagem de cálcio de células vivas

1. Antes da medição, transfira o lamínula revestidas com células transfectadas HeLa em um prato separado cultura de 3,5 cm. Carregar as células com 4 mm de FURA-02:00 em 1 ml DMEM por 45 min a 25 ° C no escuro ^11,12.
2. Fix a 25 milímetros lamínula na câmara de metal IMIC e lavar as células duas vezes e incubar em um tampão livre de cálcio (300 ml a cada vez).
3. Iniciar a coleta de dados em um microscópio com IMIC policromada V por alternadamente emocionante em 340 nm e 380 nm e medir a fluorescência emitida a 510 nm (set Filter: refletores, 565 nm; nm emissor, 605/70). Imagens de amostra contendo 20-50 células / s. quadro a cada 3 Registro FURA-2 sinais como o F340/F380 proporções, onde F340 e F380 correspondem à intensidade de fluorescência de fundo-subtraída a 340 e 380 nm, respectivamente.
4. Depois de 1 min, tratar células com puromicina (500 mM) em cálcio livre de buffer ou com o mesmo tampão. Alternativamente, tratar células com um inibidor da pequena molécula (como 10 ou 100 mM trifluoperazina mM ophibolin A) ou com o buffer de cálcio livre.
5. Após as medições raciométrica são realizadas por 2 ou 10 min, adicione tapsigargina (1 mM) e continuar as medições.
6. Eventualmente, cytoslic [Ca ^{2 +]} é estimado a partir de avaliações da razão por um método de calibração estabelecidas. ² Analisar dados pelo Excel 2007 e Origin 6.1.

5. Resultados representativos:

Até agora, abordamos a questão de se silenciamento do gene afeta SEC61A1 cálcio (Ca ^{2 +)} fugas do ER (Fig. 1). O gene foi silenciado SEC61A1 por dois siRNAs diferentes em células HeLa por 96 horas. Ao mesmo tempo silencia o crescimento celular duramente afetado e viabilidade, transporte de proteínas para o ER de semi-células permeabilizadas foi quase completamente inibida. Além disso, as células SEC61A1 silenciadas foram gravemente afectadas com relação a vazamento de Ca ^{+ 2} do ER. O efeito do silenciamento gênico foi revertida pela expressão do gene SEC61A1. Assim, Sec61 complexos que estão presentes na membrana ER de todas as células nucleadas forma Ca ^{2 +} canais de vazamento que pode ser esperado para desempenhar um papel crucial na Ca ^{2 +} homeostase. No entanto, a presença de grandes, cheios de água poros com permeabilidade de íons descontrolada, como formada por Sec61 complexos na membrana ER, seria interferir seriamente com o lançamento regulamentado de Ca ^{2 +} do lúmen ER para o citosol, um mecanismo essencial para intracelular sinalização. Nós identificamos um motivo calmodulina (CaM) obrigatório em todos os citosólica N-terminal de Sec61α mamíferos que CaM ligado, mas não Ca ^{2 +} livre apocalmodulin com afinidade nanomolar e especificidade de seqüência. A nível celular, dois antagonistas CaM diferentes estimulado Ca ^{2 + liberação do ER na presença, mas não na ausência de Sec61 canais (Figs 4 e 5). Este último não foi observado quando Sec61 canais estavam presentes que continha mutações no motivo QI de Sec61α. Assim, Ca 2 +-CaM está envolvido na limitação Ca 2 + fugas do ER (Fig. 6).}

Figura 1. Fluxograma. Ver texto para detalhes.

Figura 2. Análise de dados para silenciar eficiência. Silenciamento foi avaliada por análise de Western-blot utilizando anticorpos que foram dirigidos contra Sec61α e β-actina (carga de controle). Os anticorpos primários foram visualizados por meio de anticorpos ECL Plex secundário e imagens de fluorescência.

Figura 3. Análise de dados para a eficiência de transfecção. As imagens foram gravadas em um microscópio de fluorescência equipado com câmera CCD refrigerado. Eficiência de transformação pode ser determinado pela divisão do número de células mostrando fluorescência da GFP por células contadas no modo brightfield.

Figura 4 tiros. Tela de imagens ao vivo de células de cálcio de células HeLa, na presença de controle ou SEC61A1 siRNA ea presença ou ausência do antagonista CaM-ophiobolin células A. HeLa foram tratados com siRNA contra SEC61A1 (B) ou um siRNA controle negativo (A) por 96 h, como indicado. Essas células foram carregadas com o indicador de cálcio FURA-2:00 e incubadas em Ca ^{2 +} tampão contendo 0,5 mM livre EGTA, em seguida, buffer ou ophiobolin A (Ophio A) em tampão foi adicionado ea incubação retomada. Após 10 min, Ca ^{2 +} release foi iniciada aplicando tapsigargina (TG) na ausência de Ca ^{2 +} externo ea incubação continuou. Capturas de tela a partir da imagem de cálcio contínuas foram tomadas no tempo indicado.

Figura 5. Análise de dados para experimentos com imagens de células vivas de cálcio. (A) a análise cinética e quantitativa de uma série de experimentos, conforme ilustrado na figura. 4A. Cytoslic [Ca ^{2 +]} foi estimada a partir de avaliações da razão por um método de calibração estabelecidas de ^2. O efeito da tapsigargina é mostrado como diagrama de barras. (BD), as células foram tratadas com siRNA controle ou indicado SEC61A1 siRNA para 48 horas e, em seguida, transformado com um vetor de controle (C), ou SEC61A1 expressão plasmídeo (C), ou expressão SEC61A1 mutante plasmídeo (D), como indicado. Após 48 h, experimentos com imagens de cálcio foram realizados como nas Figuras 4 e 5A. A análise estatística das mudanças na Ca ^{2 +} citosólico concentração após a adição de tapsigargina em experimentos, tais como apresentados em A são mostrados. Valores P <0,001 foram definidos como significativos pelo teste t não pareado e são indicados por três asteriscos (***), ns, não significativo. O número de células que foram analisados ​​são indicados. Valores médios são dados, barras de erro representam os erros padrão das médias (EPM). Notamos que esses exemplos foram adaptados de ref. 13.

Figura 6. Estes dados indicam que a liberação de cadeias nascentes do complexo Sec61 fato leva à liberação de cálcio do ER e da formação de um nanodomain de cálcio ao redor da boca citosólica do complexo Sec61. Este cálcio está vinculado por calmodulina e cálcio-calmodulina fecha o complexo Sec61 ".

Discussão

Em células de mamíferos, o retículo endoplasmático (ER) desempenha um papel fundamental na biogênese protéica, bem como na sinalização de cálcio. Aqui, descrevemos um sistema experimental que nos permite abordar diretamente o papel de um potencial de Ca ^{+ 2} canais de vazamento e para caracterizar a sua putativa mecanismos de regulação ^13. Este sistema experimental nos dá a oportunidade única de i) avaliar a contribuição de diferentes proteínas da membrana para ER passiva Ca ^{2 +} efluxo do ER em vários tipos celulares, ii) caracterizar as proteínas e os mecanismos que limitam esse passivo Ca ^{2 +} de efluxo e iii) estudar os efeitos das mutações doença ligada nos componentes relevantes.

Constatamos que apenas as células viáveis ​​devem ser analisados ​​e que a viabilidade global deve ser acima de 80%. Portanto, a viabilidade das células é rotineiramente avaliado empregando-ID Nuclear reagente viabilidade azul / verde celular acordo com o protocolo do fabricante. Além disso, a análise estatística das mudanças na Ca citosólico concentração ^{2 +} é obrigatória. Portanto, os experimentos devem ser realizados para quatro lotes diferentes de células e duas lamelas com pelo menos 20 células devem ser analisados ​​para cada condição em um único experimento. Notamos que as diversas experiências devem ser realizadas ao mesmo tempo após a semeadura no lamínulas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
DMEM + Glutamax	Invitrogen	31966
OptiMEM + Glutamax	Invitrogen	51985
FBS	Biochrom	S0115
Penicilina / estreptomicina	PAA	P11-010
HiPerFect	Qiagen	301707
Fugene HD	Roche Diagnostics	04709713
Nuclear-ID azul / verde reagente viabilidade celular	Enzo Ciências da Vida	ENZ-53004
FURA-02:00	Invitrogen	F-1221
Puromicina	Sigma	P 7255
Tapsigargina	Invitrogen	T-7459
A Ophiobolin	Enzo Ciências da Vida	ALX-270-109
Trifluoperazina	Sigma	T 6062
Condessa ® contador de células automatizado	Invitrogen
Tufão Trio-sistema de imagem	GE Healthcare
TE2000-S microscópio com DS-5Mc câmera	Nikon
microscópio IMIC com policromia V	Até Photonics