Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Resumo

Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Resumo

Desenvolvimento da doença e progressão são caracterizados por freqüentes aberrações genéticas e epigenéticas, incluindo rearranjos cromossômicos, os ganhos e perdas no número de cópias e metilação do DNA. Avanços em alto rendimento, tecnologias genome-wide perfis, tais como microarrays, têm melhorado significativamente nossa capacidade de identificar e detectar essas alterações específicas. No entanto, como tecnologia continua a melhorar, continua sendo um fator limitante da qualidade da amostra e disponibilidade. Além disso, informações de acompanhamento clínico e prognóstico da doença são muitas vezes coletados anos após a coleta da amostra inicial. Espécimes, normalmente fixado em formalina e incluídos em parafina (FFPE), são armazenados em arquivos hospital por anos a décadas. DNA pode ser eficiente e eficaz recuperado de parafina espécimes se o método adequado para a extração é aplicada. DNA extraído de alta qualidade a partir de amostras devidamente preservados e armazenados pode suportar ensaios quantitativos para comparações de tecidos normais e doentes e geração de assinaturas genéticas e epigenéticas ^1. Para extrair o DNA de amostras de parafina, fragmentos de tecido ou tecido microdissecção são submetidos a tratamento xileno, que dissolve a parafina do tecido, e depois reidratados usando uma série de lavagens de etanol. Proteínas e enzimas prejudiciais, tais como nucleases são posteriormente digeridos por proteinase K. A adição de tampão de lise, que contém agentes desnaturantes, como dodecil sulfato de sódio (SDS), facilita a digestão ^2. Ácidos nucléicos são purificados a partir do lisado dos tecidos usando tampão saturada centrifugação velocidade fenol e alta, que gera uma solução bifásica. DNA e RNA permanecem na fase aquosa superior, enquanto que as proteínas, lipídios e polissacarídeos são seqüestrados na inter-orgânicos e fases, respectivamente. Retenção da fase aquosa e repetidas extrações fenol gera uma amostra limpa. Após extrações fenol, RNase A é adicionado para eliminar RNA contaminantes. Extrações adicionais fenol seguintes incubação com RNase A são utilizados para remover qualquer enzima restantes. A adição de acetato de sódio e isopropanol DNA precipita, e centrifugação de alta velocidade é usada para sedimentar o DNA e facilitar a remoção isopropanol. Excesso de sais transitadas de precipitação podem interferir com a subseqüente ensaios enzimáticos, mas pode ser removida do DNA por lavagem com etanol 70%, seguido por centrifugação a re-pellet o DNA ^3. DNA é re-suspensas em água destilada ou a reserva de escolha, quantificado e armazenado a -20 ° C. DNA purificado pode posteriormente ser utilizado em aplicações a jusante, que incluem, mas não estão limitados a, PCR, matriz hibridização genômica comparativa ⁴ (array CGH), imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP) e seqüenciamento, permitindo uma análise integrada de amostras de tecido / tumor.

Protocolo

1. Notas processuais

• Xileno e fenol são produtos químicos tóxicos e devem ser tratadas em um fumehood. Consulte a folha de dados material de segurança (MSDS) antes de usar.
dissolve certos plásticos, tubos de polipropileno devem ser utilizados como eles toleram estes compostos.
• Dicas especiais podem ser adquiridos que contêm uma rolha de carvão interno. Isso evita que o xileno de dissolver todos os componentes de borracha na pipeta. Alternativamente, filtros podem ser utilizados.

2. Remoção de parafina

1. Em um fumehood, adicione 800 mL de xileno (VWR, CABDH6216-4) para o tubo rotulado contendo o seu exemplar e coloque sobre um roqueiro, agitando suavemente por 5 a 15 minutos para dissolver a parafina.
2. Pellet a amostra girando à velocidade máxima (14.000 rpm ou 16 000 xg) em microcentrífuga por 3 minutos. Retire cuidadosamente o sobrenadante xileno e dispor em um tubo de polipropileno para descarte dos resíduos xileno. Tenha cuidado para não perturbar o sedimento.
3. Repita os passos de lavagem xileno 1 e parafina 2until é completamente dissolvido. Isso geralmente requer 2-3 lavagens, dependendo do tamanho da amostra de tecido. Uma amostra completamente dissolvido aparecerá macio, e, às vezes, perder a sua integridade estrutural. A integridade da amostra pode ser avaliada com cuidado com uma ponta da pipeta.

3. Reidratação etanol

1. Adicionar 800 mL de etanol a 100% (v / v) grau de biologia molecular do etanol vortex, em seguida, girar por 3 minutos a 14.000 rpm em microcentrífuga. Retire o sobrenadante etanol, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
2. Adicionar 800 mL de etanol 70% (100% (v / v) de etanol diluído em água destilada (dH ₂ O)) vortex, e girar por 3 minutos a 14.000 rpm. Remova cuidadosamente o sobrenadante etanol.
3. Adicionar 800 mL de etanol 50% (100% (v / v) de etanol diluído em água destilada (dH ₂ O)) vortex, e girar por 5 minutos a 14.000 rpm. Remova cuidadosamente o etanol tanto quanto possível, por pipetagem. Ser extremamente cuidadosa de perturbar o sedimento neste momento como o tecido completamente reidratadas não pellet, assim como tecido desidratado.
4. Depois de remover o sobrenadante etanol, secar o pellet por 5 minutos, sendo o cuidado de não mais seca.

4. Digestão dos tecidos

1. Adicionar 200-500 mL de tampão de lise (fórmula abaixo). Re-suspender o pellet utilizando uma ponteira ou um vórtice. Esforço extra neste momento para re-suspender completamente o tecido irá resultar em uma digestão mais completa da amostra e um melhor rendimento de DNA.
2. Incubar as amostras a 56 ° C em banho-maria ou bloco de aquecimento.
3. Para fragmentos de tecido, ponto 20 l de proteinase K (20 mg / ml solução estoque, Invitrogen, AM2548) de manhã e à noite.
4. Repita os passos acima digestão de 2 a 5 dias até que o tecido é completamente dissolvido.

Tampão de Lise

10 mM Tris-HCl pH 8,0

100 mM EDTA pH 8,0

50 mM NaCl

SDS 0,5%

200 mg / ml proteinase K (adicione imediatamente antes da utilização)

5. DNA limpar

1. Adicionar um volume igual de tampão saturada de fenol (Fisher, BP1750I-400) e misturar por inversão. Rotação por pelo menos 5 minutos a 14.000 rpm em microcentrífuga.
2. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Observe a interfase: existe uma grande quantidade de material branco?
3. Repita os passos 1 e 2 na fração aquosa até que a interfase é claro (geralmente três ou mais vezes). Realizar extrações de volta * quando a interfase é distorcido para aumentar o rendimento final.
4. Uma vez que a interfase é claro, adicionar igual volume de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) para a fração aquosa extraída de sua amostra. Misturar por 5 minutos e depois girar por 5 minutos a 14.000 rpm. Thisreduces residual de fenol e ainda aguça a interfase, facilitando a extração da camada aquosa
5. Retire a camada aquosa para um novo tubo e treatwith RNase A a 100 mg / ml durante 1 hora a 37 ° C.
6. Repita os passos 1-4 para remover qualquer RNase remanescentes A e recolher a fração aquosa. Você só deve precisar de 1 ou 2 tampão saturada passos fenol como deve haver muito menos proteína para remover do que no lisado inicial.

* Para realizar extrações de volta adicionar 50-100 mL de dH ₂ 0 para o tubo de amostra contendo a interfase ea parte orgânica. Inverter o tubo para misturar, e girar a amostra a 14.000 rpm em microcentrífuga por cinco minutos. Coletar a fase aquosa e adicioná-lo à extração aquosa adquiridos anteriormente. Continue até a volta extrações interfase é clara.

6. DNA precipitação

1. Estime o volume de sua camada aquosa recolhida.
2. Adicione 1 / 10 do volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 1 volume de 100% de grau de biologia isopropanol (v / v) molecular (ou 2,5 volumes de etanol 100%).
3. Misture bem e coloque em gelo ou em um freezer -20 ° C por 30 minutos ou durante a noite.
4. Spin na velocidade máxima (14.000 rpm) a 4 ° C em microcentrífuga por 10 minutos
5. Descartar o sobrenadante.
6. Lave o pellet com etanol 70% de gelo fria para remover sais indesejados.
7. Re-suspender o pellet no buffer de escolha (geralmente dH ₂ O).

7. Quantificação de DNA

1. Quantificar a concentração de DNA. O A260: A280 relação deve ser ~ 1.8. Para pequenas quantidades de DNA, medição utilizando um espectrofotômetro NanoDrop é o preferido.
2. Após a quantificação, eletroforese em gel devem ser realizados para testar a qualidade do seu DNA de amostras e determinar se a contaminação RNA foi completamente degradada.
3. Alta qualidade de DNA extraído é agora adequado para aplicações a jusante, ou podem ser armazenadas a -20 ° C para uso posterior. Se RNA ainda está presente na sua amostra, repetir o DNA e as etapas de limpeza, precipitação e re quantificar e qualificar a qualidade de suas amostras.

Discussão

Tecidos biopsiados ou extirpado cirurgicamente para análise histopatológica eo diagnóstico muitas vezes são fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) para o armazenamento de longo prazo. Com o crescente interesse na compreensão da base genética da doença, a capacidade de extrair DNA dessas amostras representam uma valiosa fonte de material de diagnóstico que pode ser usado para a análise genômica e estudos translacionais. Amostras historicamente FFPE não foram consideradas uma fonte viável para a análise molecular de ácidos nucléicos podem ser pesadamente modificadas por ácido nucléico e proteína-proteína-proteína reticulação ^6. No entanto, a descoberta de que a digestão protease releases fragmentada ácidos nucléicos que são adequados para análises a jusante, incluindo PCR, CGH array, seqüenciamento e perfil de metilação, permite o uso destes espécimes valiosos para a análise genética ^6.

Extração de DNA de tecidos incluídos em parafina é um procedimento robusto que depende de solubilidade diferencial para purificar DNA. Qualidade do DNA extraído ea quantidade eo sucesso da amplificação do DNA subseqüente é dependente de um número de parâmetros antes, durante e após a extração. Estes incluem, mas não estão limitados a: tipo e quantidade de tecido, o tipo de fixador utilizado para preservação de tecido, a duração da fixação, a idade do bloco de parafina e as condições de armazenagem, bem como o comprimento do segmento de DNA que se deseja amplificado ^1,7. Remoção de parafina do tecido é a etapa mais crítica para a extração de sucesso como a parafina não dissolvido leva a qualidade da amostra pobres e inibição da PCR.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número Catálogo	Comentários
Xileno	VWR	CABDH6216-4	-
1,7 ml SafeSeal tubos de microcentrífuga	Sorenson BioScience	11510	-
Spectrafuge Microcentrífuga 16M	Labnet	C0160-B	-
Tampão de Lise	-	-	10 mM Tris-HCl PH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 200 mcg / ml proteinase K
Proteinase K Solução stock	Invitrogen	AM2548	20 mg / ml
Proteinase K Solução stock
Tampão saturada de fenol pH 6.6/7.9	Pescador	BP1750I-400	-
Fenol: clorofórmio: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Pescador	BP1752I-400	-
A RNase	Roche	10109169001	100mg
3M pH acetato de sódio 5,2	-	-	40.81g NaOAc em 80ml Acertar a pH 5,2 com ácido acético glacial Adicionar dH 2 O para 100ml Autoclave
ND Espectrofotômetro 3300	NanoDrop	-	-