Multiplex PCR e hibridação reversa Linha Assay Blot (mPCR / RLB)

Resumo

Um barato, o método de elevada capacidade para detecção simultânea de até 43 alvos moleculares é descrito. Aplicações de mPCR / RLB incluem digitando microbiana e detecção de patógenos múltiplos a partir de amostras clínicas.

Resumo

Multiplex PCR / Reverse Linha ensaio de hibridação Blot permite a detecção de até 43 alvos moleculares em 43 amostras, utilizando uma reação de PCR multiplex seguida de hibridização da sonda em uma membrana de nylon, que é reutilizável. Sondas são 5 'amina modificada para permitir a fixação à membrana. Primers são 5 'biotina modificados que permite a detecção de produtos hibridizados PCR usando estreptavidina-peroxidase e um substrato quimioluminescente via filme fotossensível. Com uma configuração baixa e custos de consumíveis, esta técnica é barata (cerca de EUA $ 2 por exemplo), alta taxa de transferência (membranas múltiplas podem ser processadas simultaneamente) e tem um tempo de resposta curto (cerca de 10 horas).

A técnica pode ser utilizada em um número de maneiras. Sondas múltiplas podem ser projetados para detectar variação da seqüência dentro de um único produto amplificado, ou vários produtos podem ser amplificados simultaneamente, com uma (ou mais) sondas utilizadas para a detecção subseqüente. A combinação das duas abordagens também podem ser usados ​​dentro de um único ensaio. A capacidade de incluir sondas múltiplas para uma seqüência alvo único torna o ensaio altamente específico.

Publicado em aplicações de mPCR / RLB incluem a detecção de antibióticos ^1,2 genes de resistência, a digitação de Staphylococcus aureus resistente à meticilina ^3-5 e Salmonella sp ^6, sorotipagem molecular de Streptococcus pneumoniae ^7,8, Streptococcus agalactiae ⁹ e enterovírus ^10,11, a identificação de Mycobacterium sp ^12, detecção de ^13-15 genital e do trato respiratório ¹⁶ e outros ¹⁷ agentes patogênicos e detecção e identificação de molicutes ^18. No entanto, a versatilidade da técnica significa as aplicações são praticamente ilimitadas e não se restringe à análise molecular de microrganismos.

As cinco etapas em mPCR / RLB é um Primer) e design Probe, b) extração do DNA e amplificação c) Preparação da membrana, d) Hibridação e detecção e e) Regeneração da membrana.

Protocolo

Consideração cuidadosa deve ser dada a cartilha eo projeto da sonda. Todas as seqüências disponíveis dos alvos de interesse de bancos de dados, tais como GenBank devem ser utilizados para identificar as áreas de conservação que são alvos adequados. Onde um grande número de alvos estão sendo amplificado em um ensaio mPCR única, cada seqüência amplificada deve ser de comprimento similar, e não deve exceder 300 pares de base para evitar a concorrência. Uma aplicação alternativa do método é para amplificar um alvo usando primers mais para as regiões conservadas e usar sondas múltiplas para identificar a variação de seqüência dentro do amplicon. Neste caso, o produto amplificado PCR pode ser mais longo. Temperaturas de recozimento Primer devem ser todos semelhantes, com condições de PCR ajustados em conformidade. Primers que formam estrutura secundária forte ou dímeros de primer deve ser evitado. A Sigma Aldrich DNA calculadora ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) pode ser usado para prever com segurança esses recursos.

Sondas de DNA deve ser projetado para ter annealing temperaturas próximas a 60 ° C. Para maximizar a especificidade, duas sondas para cada alvo de interesse podem ser incluídos no ensaio, uma hibridação para a cadeia de DNA para a frente junto ao local de primer reverso de ligação, ea outra para a vertente inversa adjacente ao local da cartilha frente vinculativo. Neste caso, ambos os primers para a frente e reversa deve ser biotina-modificados. Se apenas uma sonda por alvo amplificado está sendo usado, então, apenas um primer precisa ser modificado biotina.

Ao projetar primers e sondas para o ensaio mPCR / RLB é altamente recomendável para uso em métodos para prever silico produtos de PCR e hibridização da sonda para correlacionar com os resultados in vitro. Idealmente isto é feito utilizando isolados para os quais a seqüência do genoma inteiro está disponível. Software, tais como FastPCR (disponível em http://primerdigital.com/fastpcr.html) pode ser usado para esta finalidade. Sinal da sonda fraco ou ausente pode ser previsto quando da análise silico indica descasamentos de pares de bases resultando em temperaturas baixas sonda recozimento.

Técnicas de extração de DNA irá variar de acordo com as amostras sendo testadas, e as condições de PCR será dependendo do desenho de primer. Os leitores são referidas publicações sobre ensaios individuais para obter mais informações sobre a extração de DNA e reagentes PCR e condições ^1-19.

Cada ensaio é executado com controles adequados para fornecer pelo menos um sinal da sonda positivo e um negativo para cada sonda na membrana, bem como um DNA sem controle. Além disso, é benéfico para incluir uma sondagem na parte superior da membrana que se espera que seja positiva para todas as amostras (por exemplo: uma espécie ou gênero sonda específica no caso de um microrganismo). Isto serve como uma sonda de controlo positivo, mas também permite a fácil orientação dos resultados.

1. Preparação de Membrana

1. Prepare as seguintes soluções:
   • 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4)
   • 100 ml NaHCO ₃ 0,5 M
   • 20 ml EDAC 16%
   • 250 ml NaOH 0,1 M
   • 250 ml 2xSSPE
   • 250 ml SDS 2xSSPE/0.1% - realizada em banho-maria a 60 ° C
   • 250 ml 20 mM EDTA.
2. Pré-aquecer o forno a 60 ° C.
3. Limpe o Miniblotter Immunetics com etanol 70%.
4. Diluir a sondas de oligonucleotídeos em 0,5 M NaHCO ₃ para uma concentração final de 2 pmol / mL e um volume de 200 mL.
5. Corte de uma membrana de nylon BiodyneC para cm 15x15. Com um lápis e régua, regra fora de um espaço de 0,5 cm através da parte superior da membrana e escrever detalhes aqui.
6. Membrana de vedação em saco plástico com 20 ml solução EDAC acabado de fazer 16% e rock em temperatura ambiente por 10 minutos.
7. Lavar membrana em água desionizada por 30 segundos.
8. Membrana lugar em miniblotter com canais que atravessam a membrana (paralela à linha de lápis). Coloque almofada de apoio no lugar e mata-borrão perto. Aspirado de secreção dos canais.
9. Preencha raias 1 e 45 com 150 mL 0,5 M NaHCO _3. Usar 150 mL de cada solução de sonda para encher pistas 2-44 em seqüência, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Se uma bolha de ar aparece no canal, mantendo a pipeta no lugar, rapidamente aspirar a solução para permitir que a bolha de ar para flutuar para o topo da pipeta, tente novamente. Incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
10. Aspirar soluções sonda, retirar e lavar membrana em 250 ml de NaOH 0,1 M à temperatura ambiente durante 9 minutos.
11. Lavar membrana em 250 ml 2xSSPE por 30 segundos.
12. Lavar membrana em 250 ml pré-aquecido SDS 2xSSPE/0.1% em estufa a 60 ° C por 5 minutos.
13. Se não estiver sendo usado para a hibridização de imediato, lavar membrana em 240 ml 20 mM EDTA à temperatura ambiente por 20 minutos (reservando 10 ml restantes), então selo membrana em saco plástico com 10 ml restantes 20 mM EDTA e store em geladeira a 4 ° C.
14. Lavar com miniblotter Pyroneg detergente e escova. Enxaguar e deixar secar.

2. Hibridação e Detecção

1. Prepare as seguintes soluções:
   • 250 ml SDS 2xSSPE/0.1% - loja em banho-maria a 60 ° C.
   • 500 ml SDS 2xSSPE/0.5% - loja em banho-maria a 60 ° C
   • 500 ml SDS 2xSSPE/0.5% - armazenamento em estufa a 42 ° C
   • 500 ml 2xSSPE - manter a temperatura ambiente
   • 500 ml SDS 1% - loja em banho-maria a 60 ° C, inicialmente (para o passo 3)
   • 250 ml 20 mM EDTA - armazenar à temperatura ambiente (para o passo 3).
2. Ligue uma estufa a 60 ° C e um forno a 42 ° C. Trazer a água para ferver em um copo grande numa placa de aquecimento.
3. Immunetics Miniblotter limpa com etanol a 70%.
4. Alíquota de 10 ml de SDS 2xSSPE/0.1% em um pequeno frasco. Adicionar 20 l de cada produto de PCR de 150 mL SDS 2xSSPE/0.1% em tubos numerados.
5. Ferva produtos de PCR por 10 minutos a 100 ° C usando titulares de isopor. Colocar no gelo imediatamente para pelo menos 5 minutos.
6. Lavar membrana em 240 ml restantes SDS 2xSSPE/0.1% em 60 ° C forno por 5 minutos.
7. Membrana lugar em miniblotter com almofada de apoio. Orientar para que os canais correm verticalmente (perpendicular à linha de lápis).
8. Líquido de sucção excesso de canais miniblotter.
9. Adicionar restantes 150 mL SDS 2xSSPE/0.1% a canais primeiro e último. Adicionar produtos cozidos PCR para os canais restantes (2-44) em seqüência, tomando cuidado para evitar bolhas de ar.
10. Miniblotter lugar apartamento em 60 ° C forno por 1 hora para permitir a hibridação a ter lugar.
11. Líquido aspirado de cada canal, em seguida, remover membrana de miniblotter.
12. Lavar duas vezes na pré-aquecido 250 ml SDS 2xSSPE/0.5% em 60 C ° forno por 10 minutos.
13. Umedeça com malha de nylon separando SDS 2xSSPE/0.5% a 42 ° C e usá-lo para enrolar membrana.
14. Lugar de membrana enrolada em tubo de rolo, e desfraldar para garantir membrana confina com a superfície interior. Adicione 3 conjugado estreptavidina-peroxidase mL (Roche Applied Science) a 15 ml SDS 2xSSPE/0.5% a 42 ° C e adicionar ao tubo de rolo. Parafuso da tampa firmemente e incubar em estufa de rolos a 42 ° C por 60 minutos. Garantir a direção do rolo é tal que a membrana não aperte. Verifique periodicamente se há vazamentos.
15. Lavar miniblotter Pyroneg em água e detergente, enxaguar e deixar secar.
16. Remover membrana de tubo cilíndrico. Lavar duas vezes em permanecer 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C por 10 minutos.
17. Lavar duas vezes em 2xSSPE em temperatura ambiente por 5 min.
18. Ligue o forno até 80 ° C e colocar 500ml SDS 1% em forno pré-aquecido.
19. Compõem 15 ml Amersham solução de detecção ECL (7,5 ml da solução A e 7,5 ml de solução B). Descartar 2xSSPE e adicione solução de detecção. Rocha suavemente com a mão durante 2 minutos garantir a cobertura completa da membrana com a solução. Eliminar a solução quimioluminescente.
20. Corte duas folhas de plástico transparente para caber cartucho de exposição. Membrana lugar entre as duas folhas e coloque em cartucho de exposição.
21. Proceder à câmara escura. Sob luz vermelha, adicione filme detecção ECL para cartucho e expor por 5 minutos. Da orelha do cão-canto inferior direito do filme após a remoção para permitir a orientação correta ao ver.
22. Desenvolver filme com desenvolvedor automatizado ou banhos químicos como os sentidos do fabricante.
23. Repita exposição com tempos de exposição mais longos ou mais curtos, se necessário.

3. Regeneração da membrana

1. Lavar membrana em 250 ml SDS 1% a 80 ° C por 30 minutos duas vezes.
2. Lavar membrana em 240 ml 20 mM EDTA à temperatura ambiente por 15 minutos.
3. Membrana de vedação em saco plástico com 10 ml de EDTA 20 mM e refrigerar a 4 ° C para futura reutilização.

4. Resultados representativos:

Os resultados são melhores vistos por colocar o filme sobre uma grade impressa, ou digitalizar a imagem e importar para software, tais como BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Cada resultado sonda deve ser interpretada com referência à sonda de controlo positivo e negativo. Os resultados são os melhores classificados como negativo, fraco ou positivo. Resultados positivos são o lugar onde o sinal é tão forte quanto ou mais forte que a sonda de controlo positivo. Resultados negativos são o lugar onde o sinal está ausente ou igual ao controle negativo (no caso de sinal de fundo). Resultados fracos são o lugar onde o sinal é mais fraco do que a sonda de controlo positivo, mas mais forte do que o controle negativo. Resultados fracos pode ser o resultado de mutações pontuais levando a sonda de ligação fraca, ou devido a sinais não-específicos da formação de dímero primer. Usando duas sondas por alvo de interesse pode melhorar a especificidade, onde um único resultado fraco pode seguramente ser interpretado como não-específica do sinal. Se subsistirem dúvidas, a única reação de PCR-plex pode ser realizada com gel com base em detecção e seqüenciamento de qualquer amplificadorlified produto para determinar se o resultado é verdadeiramente positivo. Um resultado representativo é mostrado na figura 2.

Figura 1. Passo Os princípios mPCR / RLB (P1) 1.9. Sondas amina modificados são obrigados covalentemente a uma membrana de nylon. (P2) Passo 2,10. Produtos biotina modificada PCR são cruzados para as sondagens. (P3) Passo 2,14. Estreptavidina, marcado com peroxidase, é incubado com a membrana e se liga a biotina. (P4) Passos 2,19-2,21. Peroxidase catalisa uma reação no reagentes de detecção ECL, produzindo luz a que filme sensível à luz é exposta. A membrana é lavada para reutilização.

Figura 2. Representante resultado mPCR / RLB. Amostras de 1 a 6 representam os controles positivo - entre eles há pelo menos um sinal positivo para a sonda de cada uma das 43 sondas. Cada seqüência alvo (de A a U) é detectado com duas sondas diferentes para maximizar a especificidade. Sondas A1 e A2 representam sondas espécie-específicos que devem ser positivos para cada amostra e ajudar com orientação do filme. Sonda A1 é repetido na parte inferior da membrana. Amostras 7 e 8 são controles negativos. Note-se que Q1 Sondas, Q2, T1 e T2 têm sinal nos controles negativos, indicando provável ligação não específica de primers ou produto dímero primer. Re-design dessas sondas ou primers seria necessário. Sondas C1, D1 e mostrar F1 cruzando a membrana provavelmente devido a alguma absorção não-específica do conjugado estreptavidina-peroxidase e substrato quimioluminescente, porém isso é facilmente distinguida da verdadeira sonda sinais positivos. Sondas D1 e D2 têm sinal relativamente fraco em comparação com outras sondas, isto pode ser devido ao maior amplicons levando a amplificação menos eficiente. Sonda J2 é negativo é várias amostras (1, 3, 4, 6, 39) onde sonda J1 é positivo. Esta provavelmente representa uma mutação no site J2 ligação para esses exemplos.

Discussão

O método mPCR / RLB permite a detecção simultânea de um grande número de amplicons PCR. Devido à alta sensibilidade de detecção da sonda baseada quimioluminescente, a única reação de PCR multiplex com grande número de pares de primers podem ser usados ​​para amplificar o modelo de DNA.

Se não houver sinais de sonda são obtidos com uma ou mais amostras, realização de eletroforese em gel com qualquer produto PCR restantes podem ajudar a distinguir se o problema é com a amplificação ou a hibridização da sonda. Onde todos os sinais da sonda na membrana são fracos ou ausentes, mas indica eletroforese em gel de amplificação por PCR de sucesso, possibilidades incluem problemas com a rotulagem de membrana, a regeneração incorreta da membrana após o uso anterior, as temperaturas incorretas durante a incubação de hibridação ou estreptavidina, ou com defeito estreptavidina- conjugado peroxidase ou reagente de detecção.

Se as amostras de controle indicam que as sondas individuais podem estar produzindo falsos sinais negativos, a PCR simples com gel com base em seqüenciamento de detecção e subseqüente pode ser realizado para verificar a amplificação do produto de PCR e de olhar para a variação de seqüência no local da sonda de ligação. Sinal da sonda fraco ou ausente pode ser devido ao tamanho do amplicon grande: se possível todos os amplicons deve ser de comprimento similar e menos de 300 bp. Estruturas secundárias de DNA amplicons também pode produzir vinculativo sonda pobres, e pode necessitar de re-design de primers. Cartilha individuais ou concentrações de teste também pode ser variado para otimizar a força do sinal.

Falso-positivos devido à ligação dos primers sonda não amplificados ou primer dimer-produto pode ser investigado através da realização de PCR simples com gel com base em seqüenciamento de detecção e subsequente. Se isso ocorrer, o redesenho das sondas podem ser necessárias. Mutações pontuais em locais de ligação da sonda pode levar a sinais fracos ou ausentes. Permitindo duas sondas para cada produto amplificado torna isso fácil de detectar. Esta característica pode ser explorada com primer cuidadoso e design sonda para detectar variações na seqüência pequena do DNA alvo.

Em resumo, embora existam muitos métodos de detecção de produto seguintes reações multiplex PCR disponíveis, mPCR / RLB tem a vantagem de ser de alto rendimento e baixo custo de instalação com baixo-custo. A flexibilidade do método permite a sua utilização em uma ampla gama de aplicações.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
5 'amina C6 modificada sondas de oligonucleotídeos	Sigma-Aldrich
NaHCO 3	Sigma-Aldrich	S-8875	Solução 0,5 M feitas até pH 8,4
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881	0,1 M solução
20xSSPE tampão	Amresco	0810-4L
Dodecilsulfato de sódio (SDS)	Sigma-Aldrich	L-4390	Compõem solução estoque 10%, não autoclave, deve ser mantida por 1 semana no máximo antes de usar
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884	Compõem solução 0,5 M ajustada a pH 8,0 e autoclave
N-(3-dimetilaminopropil)-N 'ethylcarbodiimide-cloridrato (EDAC)	Sigma-Aldrich	E7750	Compõem a 20 ml de solução 16% pouco antes de usar usando 3,2 g EDAC e 18 ml de água Millipore
BiodyneC 0,45 mM centímetros de membrana de nylon 20x20	Pall Life Sciences	74480C
Deionizada, água purificada
Detergente líquido Pyroneg	Johnson Diversey	HH12291
Estreptavidina-peroxidase conjugada	Roche	11 089 153 001
Amersham ECL detecção de reagentes	GE Healthcare	RPN2105
Amersham ECL detecção de reagentes	GE Healthcare	RPN2105
Transparências OHP	Corporate Express	OHP EXP 504
Amersham hyperfilm ECL alto desempenho filme quimioluminescente 18x24 cm	GE Healthcare	28906837
Gelo

Equipamento	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Hybaid Fornos Shake'n'Stack (2) garrafa rolando e tela de náilon que separa	Thermo Scientific	HBSNSRS220	Método pode ser realizado com um único forno, desde que haja facilidade para manutenção de soluções a 42 ° C e 60 ° C antes do uso
A plataforma de balanço Belly Dancer	Stovall ciências da vida	Euro BDbo
Miniblotter	Immunetics	MN100-45
Banho de água
Sucção
Chapa elétrica
Cartucho de exposição	Sigma-Aldrich	Z36 ,009-0
X-ray desenvolvedor filme			Também pode usar fixador desenvolvedor, e água em bandejas, em quarto escuro em vez de automáticodesenvolvedor. Lumino-imager também pode ser usado em vez do filme de Raio X