Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Resumo

Esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, foram cumpridos com sucesso limitado por mais de uma década. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento do recombinante Tribolium castaneum TERT ( Tc TERT) ea reconstituição do ativo T. castaneum Ribonucleoproteína telomerase (RNP) complexo In vitro.

Resumo

Esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, foram cumpridos com sucesso limitado por mais de uma década. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento do recombinante Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) ea reconstituição do T. ativos telomerase castaneum ribonucleoproteína complexos (RNP) in vitro.

A telomerase é uma transcriptase reversa que adiciona ^uma especializados repete DNA curtas, chamadas telômeros, a extremidade 3 'dos cromossomas lineares ^duas que servem para protegê-los de ponta a ponta-de fusão e degradação. Após a replicação do DNA, um pequeno segmento é perdido no fim do cromossomo ^3, e sem telomerase, as células continuam dividindo até que finalmente atingir o seu limite Hayflick ^4. Além disso, a telomerase está adormecida na maioria das células somáticas ⁵ em adultos, mas é ativo em células de câncer ^6, onde promove a imortalidade celular ^7.

A enzima telomerase mínima consiste em dois componentes principais: a subunidade de proteína (TERT), que compreende a subunidade catalítica da enzima e um componente integrante RNA (TER), que contém o TERT modelo usa para sintetizar telômeros ^8,9. Até 2008, apenas as estruturas de domínios telomerase indivíduo tinha sido resolvido ^10,11. Um grande avanço neste campo veio a determinação da estrutura cristalina dos ¹² ativos, subunidade catalítica de T. castaneum telomerase, Tc TERT ^1.

Aqui, apresentamos métodos para produzir grandes quantidades do ativo TERT Tc, solúvel para estudos estruturais e bioquímicos, e da reconstituição do complexo RNP telomerase in vitro para ensaios de atividade telomerase. Uma visão geral dos métodos experimental utilizado é mostrado na Figura 1.

Protocolo

1. Expressão de recombinante TERT Tc

1. Inocular 6 L de 2YT media (6 x 2 L Intrigado Frascos Erlenmeyer contendo 1 L de caldo de 2YT em cada) de seis pratos frescos de células transformadas pLysS Rosetta (DE3) contendo o sintético Tc TERT plasmídeo com um TEV N-terminal clivável hexahistidine- tag.
2. Cultivar células a 37 ° C agitando a 220 rpm para um OD ₆₀₀ de 0,5-0,6.
3. Induzir a expressão da proteína pela adição de 1 mM IPTG.
4. Reduzir a temperatura a 30 ° C, lenta agitação a 150 rpm, e permitir que as células expressam a proteína por 4-5 h.
5. Células colheita por centrifugação a 4 ° C e 3500 rpm por 30 min.
6. Ressuspender cada 1 L pellet celular em 20 ml de tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 0,5 M KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol e 0,1 mM de fluoreto phenylmethyl sulfonil (PMSF) e benzamidine.
7. Flash congelar ressuspenso mistura células por gotejamento lentamente as células em um tubo de plástico 50 ml cônico cheio de nitrogênio líquido para que cada gota congela no impacto no N ₂ líquido. Armazenar células congeladas a -80 ° C até que esteja pronto para a purificação de proteínas.

2. Purificação do Tc TERT

1. Células descongelar à temperatura ambiente até que uma consistência líquida é atingido e depois passar para copos de metal em gelo por sonicação.
2. Sonicate células no gelo por 2 min, em intervalos de 30 segundos com 30 segundo faz uma pausa, em cerca de 51 W de potência.
3. Spin down células lisadas a 18.000 rpm por 20 min para separar as frações de proteínas solúveis e insolúveis e remova cuidadosamente o sobrenadante para cromatografia de afinidade de níquel.
4. Equilibrar a Ni-NTA (níquel-nitrilotriacético ácido) coluna com tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 0,5 M KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol e 0,1 mM PMSF e benzamidine.
5. Sobrenadante de carga sobre a resina e recolher a fluir.
6. Lavar a coluna com tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 500 mM KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol e 0,1 mM PMSF para remover todas as proteínas residual e não especificamente ligados.
7. Eluir Tc TERT da resina Ni-NTA usando um gradiente de imidazol de 15 - 300 mm e coletar 3 ml de frações SDS PAGE análise.
8. Usar a análise de PAGE para determinar quais frações de proteínas contêm Tc TERT e concentrar essas frações em um Amicon 30 kDa (Millipore) filtro.
9. Concentre-se frações Tc TERT a um volume inferior a 10 ml para posterior purificação.
10. A TERT Tc é mais purificada sobre a coluna de troca catiônica (HS poros, a Applied Biosystems) pré-equilibrada com tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 500 mM KCl, e 1 mM DTT.
11. Carregar o mix de proteínas na coluna poros HS e lavá-lo para remover todos os contaminantes de proteína e ácido nucléico.
12. Lavar a coluna com tampão contendo 500 mM KCl seguido por 700 mM KCl para remover quaisquer contaminantes restantes.
13. Eluir a Tc proteína TERT fora da coluna poros HS com um tampão KCl M. Neste ponto, a proteína deve ser mais de 99% pura.
14. Remova todos os agregados de proteínas, passando a proteína mais de uma coluna de dimensionamento Superdex-200 (tamanho da cromatografia de exclusão - GE Healthcare), pré-equilibrada com tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 500 mM KCl, e 1 TCEP mM.

3. Tribolium castaneum cultura besouro

1. O T. castaneum besouros onde inicialmente fornecido como um presente pelo Dr. S. Brown, Divisão de Biologia, Kansas State University.
2. Iniciar T. cultura castaneum adicionando cem besouros adultos para um recipiente com 28,5 g de farinha e 1,5 g de fermento de padeiro seco é.
3. Culturas Loja besouro em temperatura ambiente e em um ambiente escuro, úmido por três a quatro semanas para permitir a reprodução e crescimento. Coloque um copo contendo água na área de armazenamento besouro para garantir um ambiente úmido.
4. Colher as larvas do besouro, conforme necessário para o isolamento do RNA. Permitir que as larvas restantes para amadurecer a adultos, mantendo-os na mesma cultura.
5. Cada mês, transferir os besouros mais ativos (não mais de uma centena) para um balão novo contendo farinha eo fermento fresco para reabastecer seu suprimento de alimentos.

4. T. castaneum RNA total isolamento

1. Colheita larvas do besouro 20 da cultura (cada cultura deve conter entre 500-1000 larvas), separando-os dos besouros adultos e da cultura da farinha / fermento. Eliminar a farinha ou partículas de fermento anexado ao besouros antes de triturar-los.
2. Esterilizar a área do banco, a argamassa eo pilão (considerar tratar as luvas bem) usado para este procedimento com RNaseZap (Ambion, Inc.) para remover todos os vestígios de ribonucleases antes de triturar os besouros.
3. Moer larvas em N ₂ líquido em um pó fino com um pilão e tRANSFERÊNCIA o pó para um tubo de centrífuga de 50 ml, mantendo o N ₂ líquido para garantir que o pó fica congelada até que o tampão de extração é adicionado.
4. Permitir que o excesso de líquido evaporar N ₂ a partir do pó. Depois que o N ₂ líquido tenha evaporado, homogeneizar o pó em 200 mL besouro de tampão de extração (por 20 larvas do besouro), contendo 25 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 1 mM EGTA, 0,1 benzamidine mM, 200 mM KCl, 10 glicerol%, 10 mM imidazol e 20U de RNasin, pH 7,5 e incubar no gelo por 30 minutos.
5. Centrifugar o homogeneizado a 15.000 rpm por 20 minutos a 4 ° C, recolher o sobrenadante e flash congelar a amostra em N ₂ líquido. Se necessário, as amostras podem ser armazenadas a -80 ° C durante a noite.
6. Extrair o RNA total usando o RNeasy Mini Kit (Qiagen).

5. Reconstituição in vitro de Tribolium castaneum telomerase

1. Mix 20 mcg de recombinante His-tag Tc TERT com 50 ul de T. RNA castaneum total no buffer de ligação contendo 25 mM Tris-HCl, KCl 200 mM, glicerol 10%, 5 mM β-mercaptoetanol, e 10 mM imidazol, pH 7.5.
2. Incubar a TERT Tc - mistura de RNA total por duas horas a 22 ° C em T. castaneum lisado na presença de RNasin inibidor para prevenir a degradação do RNA.
3. Purificar o complexo mais de uma coluna Ni-NTA para remover as impurezas lisado e RNA em excesso.

6. Telomerase protocolo de amplificação de repetição (TRAP) ensaios

1. Misture 4 mg de T. purificada Ni-NTA telomerase castaneum em 50 de buffer alongamento l contendo 20 mM Tris-HCl (pH - 8,3), 7,5 mM MgCl _2, 63 mM KCl, 0,05% Tween 20, 1 mM EGTA, BSA 0,01%, 0,5 mM dNTPs, 1 mM TCAS-TS Primer DNA (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 '), e incubar a mistura a 30 ° C por 60 minutos para permitir o alongamento do primer DNA TCAS-TS pelo T. reconstituído telomerase castaneum.
2. Extrair o DNA de fita simples alongada (ssDNA), adicionando um volume igual de clorofórmio fenol à mistura de reação. Agitar a mistura suavemente até que a emulsão é homogênea.
3. Centrifugar a amostra a 12.000 rpm por cinco minutos a 4 ° C para separar o ssDNA de contaminantes.
4. Transferir a camada superior aquosa da amostra a um tubo eppendorf 1,5 ml, adicionar uma concentração final de 10 mM NaOAc (pH 5,0), 1 mM de MgCl _2, e 66,4% EtOH e depois deixar a amostra para precipitar durante a noite a -20 ° C.
5. Girar a amostra a 15.000 rpm para 30 minutos a 4 ° C para agregar as ssDNA precipitado. Decantar a solução com uma pipeta e, em seguida, adicionar 200 mL de EtOH 70% para a amostra de lavar NaOAc restantes e MgCl ₂ a partir da amostra. Centrifugar a amostra por cinco minutos com a mesma velocidade e temperatura de re-pellet a amostra.
6. Decantar a solução EtOH usando uma pipeta e remover vestígios de etanol, permitindo que o tubo eppendorf para incubar aberta à temperatura ambiente por três minutos. Tendo etanol presente na amostra irá interferir com a etapa de amplificação por PCR.
7. Ressuspender o sedimento ssDNA (contendo o produto telomerase alongado eo primer TCAS-TS) em 50 ul de tampão de PCR reação contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 2 mM MgCl _2, 100 mM dNTPs (dATP, dGTP e dTTP), 10 mM ^[32 P] dCTP, 1 mM de primer TCAS-CX (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') e 1,25 U Taq DNA polimerase.
8. PCR amplificar os produtos telomerase alongamento (29 ciclos de 94 ° C por 30 segundos, 50 ° C por 30 segundos e 72 ° C por 1 minuto), de modo que sejam visíveis em gel de poliacrilamida 12%.
9. Pré-executar o gel 12% com Tris-Borato-EDTA (TBE) rodando tampão contendo 44,5 mM Tris, 44,5 mM de ácido bórico, 1 mM EDTA, pH 8 para 30 minutos antes de executar as amostras do PCR. Após a pré-execução e carregamento do gel com as reações de PCR, execute o gel de 185 Volts para 1,5-2 horas a 4 ° C ou em gelo.
10. Secar o gel e use o fósforo placa de imagem para visualizar a atividade.

7. Resultados representativos:

Um exemplo do Tc purificada TERT após cromatografia de exclusão de tamanho é mostrado na Figura 2. A proteína concentrada após purificação é executado em um 12% de gel de poliacrilamida SDS-e mostra-se mais de 99% puro (Figura 2A). O tamanho da exclusão cromatograma (S200) também é fornecida (Figura 2B) para demonstrar a pureza ea falta de agregados a partir da amostra de proteína purificada. A produção de 5 mg de proteína após todas as etapas de purificação foram concluídos geralmente é obtido apesar de o rendimento final pode variar.

Um ensaio de TRAP representante para o T. reconstituído telomerase castaneum é mostrado na Figura 3 como já foi relatado por Mitchell et al. ^12. A escada passo a passo de produtos telomerase pode ser visto na pista 1, no entantoeles estão ausentes tanto na telomerase RNase tratados e os ativos do site TERT mutante (D251A) amostras em faixas 2 e 3, respectivamente.

Figura 1. Fluxograma das etapas envolvidas na reconstituição do recombinante Tc TERT. Primeiro, o recombinante Tc TERT é sobre-expressa em E. coli. A proteína é então purificado por níquel, de troca catiônica, e cromatografia por exclusão de tamanho. O T. castaneum besouros são cultivadas em casa e suas larvas são usadas para isolar o RNA total. A purificada Tc TERT eo RNA total é então misturado para reconstituir o complexo RNP telomerase, e um ensaio TRAP subseqüente é usado para confirmar o complexo RNP é um telomerase ativa.

Figura 2. Cromatograma tamanho exclusão e SDS PAGE análise de proteína TERT Tc. (A) 12% gel de poliacrilamida SDS da proteína TERT Tc após cromatografia de exclusão de tamanho. O Tc proteína TERT (70 kDa) migra mais rápido no gel SDS PAGE porque tem um ponto alto isoelétrico (pI - 9,8). (B) cromatograma exclusão de tamanho (Superdex S200) da proteína TERT Tc.

Figura 3. Ensaios de TRAP do in vitro reconstituído Tribolium castaneum telomerase adaptada de Mitchell et al. ^12. Pista 1: tipo selvagem Tc TERT e RNA total isolado de larvas de besouro. Faixa 2: tipo selvagem Tc TERT e RNase tratados larvas RNA total e extratos de células. Pista 3: ativa local mutante Tc TERT (D251A) e larvas de besouro larvas RNA total.

Discussão

O método aqui apresentado permite a produção de grandes quantidades da subunidade catalítica de T. castaneum TERT telomerase na forma solúvel ativo para estudos estruturais e bioquímicos. O método de Tc TERT sobre-expressão é sensível a mudanças sutis na temperatura ou densidade celular daqueles acima mencionados e pode afetar drasticamente os níveis de expressão da proteína. Especificamente, nós descobrimos que as células para induzir a expressão da proteína antes de a densidade ópt...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Rosetta (DE3) Células plysS	Novagen	70956
2YT Caldo	Teknova	Y0215
IPTG	Biotecnologia ouro	I2481C
MISONIX sonicador 3000	Qsonica, LLC.
AKTA Purifier FPLC	GE Life Sciences
Ni-NTA Resina Superflow	Qiagen	30410
Amicon Ultra-15 Dispositivo Centrífuga Filtro	Millipore	UFC903008
POROS 50 HS de troca catiônica forte Embalagem	Applied Biosystems	1-3359-06
POROS 50 HQ de troca catiônica forte Embalagem	Applied Biosystems	1-2559-06
Superdex 200 10/300 coluna por exclusão de tamanho-	GE Life Sciences	17-5175-01
Fenol: Clorofórmio: 25:24:1 isoamilo com 10mM Tris, pH 8, EDTA 1mM	Sigma	P3803-100mL
RNaseZap	Ambion	AM9780
Recombinante inibidor da ribonuclease Rnasin	Promega	N251B
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Oligonucleotides DNA	Integrada DNA Technologies