Examinando Processamento Rede Local usando contato Multi-Gravação Eletrodo Laminar

Resumo

A questão fundamental em nossa compreensão do circuito cortical é como as redes em diferentes camadas corticais codificar a informação sensorial. Aqui, descrevemos técnicas eletrofisiológicas utilizando eletrodos de contato multi-laminar para gravar um único unidades e potenciais de campo locais e análises presentes para identificar camadas cortical.

Resumo

Camadas corticais são estruturas onipresentes em toda neocórtex ^04/01, que consistem em altamente recorrentes redes locais. Nos últimos anos, progressos significativos foram feitos na nossa compreensão das diferenças nas propriedades de resposta dos neurônios em diferentes camadas corticais ^5-8, mas ainda há muito que aprender sobre se e como as populações neuronal codificar informações em um específico laminar- maneira.

Existentes multi-eletrodo técnicas de matriz, embora informativo para medir respostas em muitos milímetros de espaço cortical ao longo da superfície cortical, são inadequados para abordar a questão dos circuitos laminar cortical. Aqui, apresentamos o nosso método para a criação e gravação de neurônios individuais e potenciais de campo locais (LFPs) através das camadas cortical do córtex visual primário (V1), utilizando eletrodos multi-laminar de contato (Figura 1; Plextrode U-Probe, Plexon Inc).

Os métodos estão incluídos a construção de gravação do dispositivo, a identificação das camadas cortical, e identificação de campos receptivos de neurônios individuais. Para identificar camadas cortical, medimos os potenciais evocados (ERPs) da LFP de séries temporais usando full-campo estímulos brilharam. Em seguida, realizar-source atual densidade de análise (CSD) para identificar a inversão de polaridade acompanhada pela configuração afundar-source na base da camada 4 (a pia está dentro da camada 4, posteriormente referida como camada granular ^9-12). Atual-source densidade é útil porque ele fornece um índice da localização, direção e densidade de fluxo transmembrana atual, permitindo-nos com precisão a posição eletrodos para registro de todas as camadas em uma única penetração ^{6, 11, 12.}

Protocolo

1. NAN construção microdrive

Usamos o U-Probe em combinação com o sistema de acionamento eletrodo NAN. Construção deste sistema requer 03/02 horas, mas uma vez construído, é muito simples de modificar. Começamos a montagem da torre de NAN, que inclui uma base de 4 canais (Figura 2a), a câmara de NAN (Figura 2b), a grade com 1 mm de espaçamento (Figura 2c), 1-4 microdrives parafuso (Figura 2d), 1 -4 tubos de guia (Figura 2e, 500 mm e diâmetro de corte para cerca de 5-7 cm), e 1-4 torres microdrive (Figura 2f). Para simplificar, vamos descrever o processo de construção do sistema de NAN com uma torre e um U-Probe. Depois de algum treino, este procedimento normalmente leva 2-3 horas se todos os materiais estão disponíveis.

1. Para construir o conjunto da unidade de NAN eletrodo, montagem primeira medida todas as ferramentas e peças que você vai precisar (tubos de guia, por exemplo, fio-guia, definir dremil completo, ferramentas e peças NAN eo U-sonda). Medida dos tubos guia então quando conectado ao dispositivo de gravação que são tempo suficiente para descansar em cima da dura sem danificá-lo.
2. Para construir o conjunto da unidade de NAN eletrodo, primeiro medir a profundidade da câmara de gravação. Em seguida, corte os tubos de guia com o comprimento medido de cerca de 5-7 cm. Ao cortar os tubos guia, é preciso garantir que nenhum fragmentos de metal entram dentro do tubo. Use um fio rígido menor que o diâmetro interior do tubo guia para remover quaisquer fragmentos de metal no interior do tubo.
3. Em seguida, coloque a grade na base NAN NAN. Aperte o parafuso de fixação e parafuso grid. Uma vez que a base e grade estão garantidos, identificar a região de gravação de juros e avançar o tubo guia através do fundo da grelha NAN.
4. Passe o tubo guia através da grade até que é de cerca de 1-2 mm fora da câmara de NAN. Uma vez que o tubo guia está na posição desejada, começar a montar o NAN microdrive torre.
5. Em cada microdrive NAN torre existem dois grampos - um motor aciona a braçadeira superior, enquanto a braçadeira inferior pode ser fixado no lugar ou solto. Anexar a braçadeira superior para o tubo de reforço da U-Probe. Anexar a braçadeira inferior para o tubo guia e aplique uma pequena quantidade de supercola para fixar o tubo de guia no local. Este sistema é mais estável e mais precisas devido aos dois grampos que estão ligados ao tubo de reforço da U-Probe.
6. Alinhe cuidadosamente a ponta do U-Probe com a parte superior do tubo guia e passar o U-Probe através do tubo guia até que você pode fixar a torre para a base de NAN. Ajustar a posição da torre com o parafuso de modo que não há tensão adicionada a U-Probe ou tubo guia.

2. U-Probe esterilização

O eletrodo laminar ou Plextrode U-Probe é comprado de Plexon Inc. e está disponível a um preço de cerca de US $ 2000 - $ 4000. O preço depende de três aspectos principais: o número de sites de contato, a configuração de sites, eo diâmetro de cada site. Atualmente estamos usando a versão de 16 canais com uma configuração linear e um diâmetro de contato de 25 mm. Importante, a espessura do U-Probe está diretamente relacionada com o diâmetro de contato. Em nossos experimentos, nós sempre usaram 25 contatos M de diâmetro, que é igual a uma espessura mM 360. O custo atual para o nosso modelo versão é de aproximadamente $ 3500 dólares. O U-Probe vem embalado em um caso de eletrodo com jumpers e fio-terra e os lead-time desde a compra até a entrega é de aproximadamente 4-6 semanas.

1. Coloque o sistema NAN na base do cilindro e conectar os cabos do motor para as torres correspondentes. Se estiver usando várias torres laços cor-codificado zip são usados ​​para ajudar a distinguir entre os cabos do motor e torres.
2. Usando o programa de software NAN, comece a fazer avançar o U-Probe, ou definir uma posição alvo que faz avançar automaticamente o U-Probe para esse local ou clicando em 'Down "na interface do software NAN. Avançar o U-Probe para que no mínimo 10 mm da ponta é através do tubo guia após o final da câmara de NAN.
3. Para esterilizar o U-Probe, coloque em MetriCide solução dialdeido ativado por 20-30 minutos antes de fixar a base de NAN para a câmara de gravação implantado. Após isso, lave a base de U-Probe e NAN com água estéril.
4. Zero a localização software NAN retraindo o U-Probe, para que a ponta é apenas dentro do tubo guia. No software NAN, clique em todas as posições de zero.
5. Fixação da base do NAN para a câmara de gravação implantado e aperte os quatro parafusos. Então, alinhar a base de acordo com um pino que está no lado da câmara de gravação. Aperte os quatro parafusos e certifique-se que a base de NAN está firmemente conectado à câmara de gravação.

3. Avançar o U-Probe para gravação

Dado que a resistência e espessura da dura-máter é altamente variável entre os indivíduos, temos implementado um procedimento geral para o avanço do U-Proestar usando o sistema de NAN microdrive. Importante, cada U-Probe vem com uma análise detalhada da impedância de cada contactos eo ranger global para o U-Probe. Foram utilizados eletrodos cujos contatos impedâncias variou 0,3-0,5 mohms. Atualmente existe um testador de impedância disponíveis para compra no Plexon mas, infelizmente, no momento de nossas gravações este dispositivo não estava disponível. Como resultado, temos sido incapazes de realizar uma análise detalhada da impedância.

1. O U-Probe fica flutuando (tem um jumper fios ligados nos conectores baixo). Headstages estão garantidos para o conector U-Probe e os cabos do amplificador estão ligados e aterrados.
2. O avanço inicial de cerca de 1-2 mm deve ser rápido e forte. Definir o parâmetro de velocidade na faixa de 0,1-0,2 mm / seg ea etapa de profundidade 0,2-0,3 mm. Estes valores irão garantir que o U-Probe é capaz de perfurar a dura limpa e é um primeiro passo importante na gravação.
3. Depois de atravessar a dura-máter, reduzir a velocidade de 0,050 -0,1 mm / seg e reduzir o passo profundidade de 0,05 - 0,1 mm. O objetivo é avançar o U-Probe tão suave e lenta quanto possível de modo que nenhum tecido é danificado. Um dos indícios de que a sonda entrou no cérebro é uma mudança na amplitude da LFP acompanhada por uma redução no nível de ruído (Overlay Texto: potencial de campo local).
4. Para verificar se o eletrodo está abrangendo todas as camadas cortical, medir a mudança na amplitude em resposta ao estímulo de campo total clarão branco. As mudanças na amplitude LFP ao longo do tempo estão na base da análise de potencial evocado resposta. Esta análise fornece a base para a identificação de camadas cortical.

4. Identificação e verificação das camadas cortical

Temos implementado um procedimento para identificar camadas cortical utilizando um potencial de resposta evocada (ERP) e atual paradigma de código-fonte densidade de análise (CSD). Contamos com a CSD, pois fornece um índice da localização, direção e densidade de fluxo transmembrana atual, permitindo-nos com precisão a posição eletrodos para registro de todas as camadas em uma única penetração. De fato, Charles Schroeder e seus colegas já combinado gravação laminar, microlesion e reconstrução histológicos para validar a eficácia do método de ERP / CSD na identificação funcional das camadas cortical em V1 ^12/09. Outros métodos usando as oscilações geradas espontaneamente ter sido usado para identificar a profundidade cortical, como fusos corticais e up / down estados ^13-15.

Para esta análise, utilizamos a caixa de ferramentas ICSD para MATLAB, que calcula o CSD de acordo com a derivada segunda espacial da LFP de séries temporais através dos contatos igualmente espaçados do U-Probe ( http://software.incf.org/ software / csdplotter / home ) ^9,10,16,17.

1. Para identificar as camadas cortical, medir o potencial de resposta evocada durante uma tarefa de fixação passiva, enquanto expondo o sujeito a uma tela full-campo preto que pisca branco para 100 ms, e depois retorna para o preto. Esta seqüência constitui um julgamento que é repetido 200 vezes.
2. O Plexon Processor Aquisição Multicanal guarda todos os sinais de dados contínua diretamente para o computador de gravação através de uma placa PCI National Instruments. Após os dados são salvos, começar a processar os sinais para a corrente de fonte de análise de densidade.
3. Use a correção fornecida pelo software FPAlign Plexon para corrigir os atrasos nos sinais LFP induzida pelos filtros na headstages ea ampliação pré-boards.
4. Neste ponto os dados são transferidos para MATLAB com Neuroexplorer. Cada canal LFP é filtrada usando o padrão filtros passa alta e baixa com freqüências de corte de 0,5 Hz e 100 Hz. Após cada contato do eletrodo foi filtrada, identificar cada tentativa e média de ensaios para obter a LFP tempo médio da série para cada contato do eletrodo. Então, organize cada contato em uma matriz com LFP amplitude como uma função do tempo.
5. Executar o (Overlay Texto: fonte de corrente de densidade) ICSD toolbox em MATLAB digitando CSDplotter no espaço de trabalho. Dado que a frequência de amostragem dos dados contínua é de 1 kHz, defina o parâmetro dt a 1 ms. Em seguida, defina o valor da condutividade cortical para 0,4 S / m (este se aproxima da densidade de fonte de corrente em unidades de nano amperes por milímetro cúbico) e mudar a posição do eletrodo como um vetor de [0.1:0.1:1.6] para refletir o número de contatos. Quando todos os parâmetros foram inseridos clique em "Run This".
6. Ver o perfil CSD na interface CSDplotter e colá-lo a uma nova figura. Funções comuns em MATLAB, como imagesc pode ser usado para traçar o perfil da camada, e vários algoritmos de suavização e rotinas de normalização pode ser aplicada para representar os dados CSD e comparando a identificação da camada através horae sessões.
7. Para identificar a inversão de polaridade acompanhada pela configuração afundar-source na base da camada 4, primeiro, verificar a presença de uma pia primária na camada granular usando o perfil laminar CSD. Localize a pia impulsionado polaridade negativa na trama CSD. Então, calcular o centro de massa da pia granular.
8. Um centróide é obtido a partir da análise que consiste no número de contato e momento em que a pia foi maior. O contato com o centróide pia serve de referência camada granular em 0 mM. Analisar todos os contatos acima e abaixo da referência e agrupá-los em uma das três camadas possíveis: supragranular, granular, e infragranular.
9. Validar a pia granular embaralhando as posições do eletrodo deixando o domínio temporal inalterada. Depois de embaralhar a matriz CSD, calcule a análise de centróide novamente. Baralhar contatos de eletrodos em função da profundidade cortical deve destruir qualquer especificidade laminar.

5. Identificação de neurônios individuais e mapeamento de campo receptivo

Temos tido grande sucesso com o isolamento e gravação de várias unidades do U-Probe. Em uma gravação, normalmente, podemos esperar ter 10/06 bem isolado e 14-16 unidades sinais potenciais locais de campo. Encontrar unidades individuais também é mais confiável com o U-Probe em comparação com eletrodos único. Mesmo que se fosse usar todo o hardware necessário para avançar precisamente 16 eletrodos, eles não seriam capazes de explorar as populações de rede como uma função das camadas cortical tão precisamente quanto com o U-Probe. Finalmente, pode gravar normalmente com o mesmo U-Probe para penetrações 30-40.

1. Para encontrar campos receptivos, começa por apresentar um estímulo correlação inversa no monitor onde os campos receptivos são potencialmente localizado. O estímulo é composta por quatro grades de orientação em 0, 45, 90 e 135 graus.
2. Realizar análise de cluster da taxa de disparo mapas para localizar o campo receptivo. Primeiro, calcule máxima locais taxa de disparo e seu centróide para cada intervalo de tempo. Então, calcular as distâncias entre o centróide e esses locais taxa máxima de fuzilamento. Compute mapas de disparar as taxas em cada local espacial para atrasos de condução entre 40-120 ms em intervalos de 5 ms para cada neurônio de forma independente.
3. Encontrar a distância total entre o centróide eo máximo em torno pontos classificar atirando em todos os tempos atrasos. O campo receptivo é com a demora do tempo que minimiza essa distância.
4. Uma vez que um campo receptivo é encontrada para cada célula, apresentam uma correlação inversa estímulo maior do que todos os locais campo receptivo sobreposição de todos os campos receptivos na população gravado. A trama em tempo real taxa de disparo pode ser usado para determinar se o correto campo receptivo locais foram identificados.
5. Por fim, remova unidades individuais que abruptamente mudar suas respostas e só manter estáveis ​​as unidades com taxas de disparo para análise posterior. Além disso, selecionar sites de gravação com a melhor relação sinal-ruído.

6. Resultados representativos: Gravações de unidades individuais e LFPs através das camadas cortical do córtex visual primário

Um dos passos mais importantes na análise usando os eletrodos laminar é identificar com segurança as camadas cortical e verificar esta identificação através de muitas horas e sessões. Assim, nós medimos os potenciais evocados (ERPs) de LFPs entre contatos laminar em resposta a um estímulo de campo total flashed (Figura 3a). Figura 3b fornece um exemplo do tipo de informação é necessário para obter, a fim de calcular a densidade de corrente de fonte (CSD) para identificar as camadas cortical. Em seguida, empregou a análise do CSD LFP de séries temporais para identificar a inversão de polaridade acompanhada pela configuração afundar-source na base da camada 4. Figura 4a ilustra a análise CSD na localização de camadas cortical em profundidade cortical em função do tempo - a posição de supragranular (SG), granular (G) e infragranular (IG) manteve-se estável camadas até quatro horas após a sessão de gravação começou. Figura 4b contém traços CSD que representam a média desses contactos atribuído a uma determinada camada - neste exemplo, a camada granular sofre uma clara diminuição na amplitude CSD em ~ 50 ms. Essa análise serviu de referência para atribuir contatos eletrodo acima e abaixo da camada granular para as camadas supragranular e infragranular, respectivamente (o contato com o maior sumidouro de centro de massa servido como referência camada granular em 0 mm).

Outra análise crítica utilizando o eletrodo laminar é identificar com precisão e localizar o campo neurônios receptivo. Este procedimento é vital para o posicionamento do estímulo para gerar a resposta mais robusta dos neurônios. Figura 5a é um exemplo de duas parcelas campo receptivo de neurônios no visual primário cortex (V1). A origem destas parcelas é o ponto de fixação, que é um pequeno círculo branco central exibido na tela do computador preta. A cor destes gráficos representa a taxa de disparo de cada neurônio em resposta a um estímulo correlação dinâmica inversa. Usamos essa informação para posicionar o estímulo para um dado experimento (por exemplo, onda senoidal, uma grade). Estímulos que são apresentados são maiores que o tamanho do campo receptivo média, a fim de abranger locais campo receptivo de todos os neurônios simultaneamente gravados.

Depois que identificar camadas cortical e posicione o estímulo no local do campo receptivo ideal, podemos prosseguir com o protocolo experimental, no qual apresentamos vários estímulos visuais enquanto o animal realiza ou fixação ou tarefas de discriminação. Após a experiência, realizamos nossa análise pico de forma de onda para isolar as unidades de um único fomos capazes de gravar o mesmo canal. Este procedimento muitas vezes leva algum tempo para dominar e está constantemente a ser melhorado como software de análise e novas técnicas são disponibilizados. Figura 5b é um exemplo do tipo de saída que se poderia esperar após o uso off-line Sorter Plexon é. Usando este software, o isolamento única unidade é realizada através de inspeção visual. Grupos distintos são identificados com base no peso do primeiro e segundo componentes principais, a largura do ponto, vale, e propriedades de pico.

Figura 1. Eletrodos de contato multi-laminar laminar Usando eletrodos multi-contacto, gravados simultaneamente spiking atividade de neurônios individuais isoladas e unidades LFP através das camadas cortical de V1. Cada U-Probe é composto de 16 contatos de eletrodos igualmente espaçados (100 mm) com um comprimento total de 1,6 mm. Cada contato do eletrodo é de 25 m de diâmetro e é composto de irídio platina.

Figura 2. NAN NAN A construção da rede do sistema microdrive proporciona maior estabilidade e precisão ao longo dos microdrive parafuso-driven clássica. Cada grupo de eletrodos é manipulado de forma independente nos planos XY, dentro de uma faixa de trabalho definidos pelo usuário. Cada grupo de eletrodos é manipulado de forma independente na direção Z dentro de um definido pelo usuário trabalhar profundidade (até 100 mm) e faixa de velocidade variável de 0,001 milímetros / s para 0,5 mm / seg e uma alta resolução de 1 micrômetro (a) 4. - canal de base, (b) a câmara de NAN, (c) a grade com um espaçamento mm, (d) 1-4 microdrives parafuso, (e) 04/01 tubos de guia (500 mm e diâmetro de corte para cerca de 5-7 cm) , (f) 1-4 torres microdrive e (g) o sistema completou NAN ea base do cilindro.

Figura 3. Evocado paradigma resposta potencial e séries LFP tempo (a) Para identificar camadas cortical, nós medimos o potencial de resposta evocada (ERP) durante uma tarefa de fixação passiva, enquanto os macacos foram expostos a uma tela full-campo preto que brilhou branca (~ 1Hz) para 100 ms, e depois voltou para o preto. (b) As respostas LFP gravados com a laminar U-Probe foram processados ​​para obter traços ERP para cada contato. A camada granular foi determinada em todas as sessões, localizando uma inversão afundar-driven na amplitude da resposta nos traços ERP, e pela presença da inversão de polaridade acompanhada pela configuração afundar-source na base da camada 4. A caixa pontilhada indica o calendário do período de tempo em que a inversão ocorreu.

Figura 4. Identificação camada usando atual-source análise de densidade (a) análise de densidade fonte atual (baseada em derivados da 2 ^ª espacial da LFP de séries temporais) foi usado para identificar a inversão de polaridade acompanhada pela configuração afundar-source na base do camada granular. Avaliamos como estável a identificação de camadas cortical é mantida ao longo do tempo (da esquerda para a direita). Nestes exemplos, o coletor atual (azul) representa a camada granular e se estende por 400 m ~. (B) Os traços CSD abaixo de cada lote representar o CSD média dos contatos atribuído a uma determinada camada. Isto nos permitiu determinar o momento preciso da pia inicial (nestes exemplos ~ 5-60 ms. Envelopes CSD traço representam o desvio padrão e as barras pretas indicam a duração do estímulo flashed (100 ms).

Figura 5. Pico de classificação e mapeamento de campo receptivo (a) Em primeiro lugar, meio grau visual é calculado e duplicou. Então, os estímulos correlação inversa são apresentados em patches em um monitor CRT consisting de grades de orientação em graus 0, 45, 90 e 135. Taxas de disparo de cada neurônio são calculadas de forma independente em intervalos de 5 ms entre 40 a 120 ms após estímulos são apresentados para cada localização espacial. As taxas máximas de queima são calculados e então o centróide para cada intervalo de tempo. Então, a cada atraso a distância entre o centróide e adjacente locais taxa de disparo é calculado. O tempo de atraso com a distância mínima é escolhido como o campo receptivo. (B) propriedades de Spike forma de onda, tais como altura do pico, a profundidade do vale, em tempos de pico vale, tempo de pico ou vale, etc, são analisados ​​utilizando um programa de software off-line de triagem ( Plexon). Os picos são classificadas com base em propriedades semelhantes até formas de onda de um neurônio são agrupados sem sobreposição de outro.

Figura 6. Embaralhadas CSD perfil. Convenção mesmo que na Fig. 3a, mas realizamos um procedimento que embaralhar aleatoriamente compila uma nova CSD matriz com os locais de contato mista. Esta análise é utilizada para melhor validar a pia granular embaralhando as posições do eletrodo deixando o domínio temporal inalterada. A partir desses exemplos apresentados ao longo do tempo, misturando os contatos do eletrodo em função da profundidade cortical destrói qualquer especificidade laminar.

Discussão

Multi-unit gravações tornaram-se padrão para a análise de como as redes neurais no córtex codificar a informação de estímulo. Dada a recentes avanços na tecnologia de eletrodos, a implementação de eletrodos laminar permite uma caracterização sem precedentes de locais circuitos corticais. Embora multieletrodos gravações oferecer informações úteis sobre a dinâmica da população neural, eletrodos múltiplos laminar permitir uma maior resolução e mais informações sobre o local específico de neurôni...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do Equipamento	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Nan microdrive sistema	Nan Instruments	NAN-S4	Figura 2. Grampos personalizados são necessários para usar o U-Probe. Tudo mencionado com exceção do U-Probe é fornecida por instrumentos NAN.
Microdrives parafuso	MIT loja de máquina		Tudo o que é capaz de garantir um tubo de guia para a grade NAN deve ser adequada.
Tubos de Aço Inoxidável Guia	Peças pequenas	B00137QHNS (1) ou B00137QHO2 (5)	Estes são 60 em de comprimento e cortados em laboratório, utilizando uma broca de mão Dremel
Plexon U-Probe	Plexon, Inc	PLX-UP-16-25ED-100-SE-360-25T-500	Ver U-Probe especificações disponíveis no www.plexon.com Também veja a Figura 1.

Nome do Software	Companhia	Site	Comentários
NAN software	NAN	http://www.naninstruments.com/DesignConcept.htm	Interface do computador exige uma porta serial adicional para acomodar o sistema Plexon eo hardware NAN
Sorter Offline, FPAlign, PlexUtil, programas MATLAB	Plexon	http://www.plexon.com/downloads.html Software #	Em 'pacotes de instalação'
NeuroExplorer	NeuroExplorer	http://www.neuroexplorer.com/	Em 'Recursos'
CSDplotter Versão 0.1.1	Klas H. Petterson	http://arken.umb.no/ ~ klaspe / user_guide.pdf