Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Resumo

Electron paramagnético espectroscopia de ressonância (EPR) foi utilizado para detectar o óxido nítrico a partir de células endoteliais de aorta bovina e anião radical superóxido por neutrófilos humanos, utilizando ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe (DMG) ₂ E 5,5-dimetil-1-pyroroline-N-óxido, DMPO, respectivamente.

Resumo

Azoto reactivo / espécies de oxigénio (ROS / RNS) a baixas concentrações desempenhar um papel importante na regulação da função celular, de sinalização, e da resposta imune, mas em concentrações não regulados são prejudiciais para a viabilidade da célula ^{1, 2.} Embora os sistemas vivos evoluíram com mecanismos de defesa antioxidantes endógenos e dietético para regular ROS geração, ROS são produzidos continuamente como natural, através da sub-produtos do metabolismo normal de oxigénio e pode causar danos oxidativos a biomoléculas, resultando em perda da função da proteína, a clivagem de ADN, ou lípido peroxidação ^3, e, finalmente, ao estresse oxidativo levando a lesão ou morte celular ^4.

Anião radical superóxido _(O2 • -) é o principal precursor de algumas das espécies mais altamente oxidantes conhecidos de existir em sistemas biológicos, tais como o peroxinitrito e radical hidroxilo. A geração de O ₂ • - sinaliza o primeiro sinal de explosão oxidativa e, portanto, idetecção st e / ou a apreensão em sistemas biológicos é importante. Nesta demonstração, O ₂ • - foi gerada a partir de neutrófilos (PMN). Através da estimulação com quimiotáctica de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), PMN gera O ₂ • - através da activação de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidase (NADPH) ^5.

O óxido nítrico sintase (NO) que vem em três isoformas, como induzível-,-neuronal e endoteliais-SOE, ou iNOS, nNOS ou eNOS, respectivamente, catalisa a conversão de L-arginina a L-citrulina, utilizando NADPH para produzir NO ⁶ . Aqui, nós gerado NO a partir de células endoteliais. Sob condições de stress oxidativo, eNOS por exemplo, pode mudar de produzir NO para O ₂ • - por um processo chamado de desacoplamento, o que se acredita ser causada pela oxidação do heme ⁷ ou o co-factor, tetrahidrobiopterina (BH ₄₎ ^8.

Há apenas poucosmétodos fiáveis ​​para a detecção de radicais livres em sistemas biológicos, mas estão limitados por especificidade e sensibilidade. Aprisionamento de rotação é vulgarmente utilizado para a identificação de radicais livres e envolve a reacção de adição de um radical de uma armadilha de spin formando um aducto de spin persistente que pode ser detectado por espectroscopia de ressonância paramagnética electrónica (EPR). Os aductos vários radicais apresentam espectro característico que pode ser usado para identificar os radicais sendo geradas e pode fornecer uma grande quantidade de informação sobre a natureza e da cinética da produção de radical ^9.

As nitronas cíclicas, 5,5-dimetil-pirrolina-N-óxido, DMPO ^10, o DEPMPO fosforilo-substituído ^11, eo éster-substituído, Empo ¹² e BMPO ^13, têm sido largamente utilizados como armadilhas de spin - o spin último armadilhas exibindo mais uma meia-vida de O ₂ • - aduto. Ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe (DMG) _{2 <}/> Sub é vulgarmente usado para prender NO devido à elevada taxa de formação de aduto ea estabilidade elevada do adueto de rotação ^14.

Protocolo

1. Cultura de Células endoteliais de aorta bovina (BAEC)

1. Técnicas adequadas de assepsia foram seguidos.
2. Num meio de água do banho quente, sem antibióticos, a 37 ° C.

Nota: O meio consiste em fenol meio Dulbecco modificado por Eagle livre (DMEM) com 4,5 g / L D-glucose, 4 mM de L-glutamina, 1% de não-aminoácidos essenciais, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 2,5 mg / L o factor de crescimento endotelial.

3. Remover as células T75 balão contendo a partir da incubadora e limpar a superfície do balão com etanol 70% antes de colocá-lo dentro do capuz.
4. Remover o meio antigo usando um aspirador e lavar duas vezes com 5 ml de fosfato de Dulbecco tampão salina (DPBS).
5. Adicionar 2 ml de tripsina e esperar por 4-5 min para as células a separar enquanto periodicamente inspeccionar sob o microscópio.
6. Adicionar 3 ml do meio de misturar e repetidamente, utilizando uma pipeta de t separadoele células e criam uma suspensão mesmo.
7. Transferir 5 ml de meio com tripsina para um tubo de 15 ml e centrifugar a 121 g durante 5 min.
8. Remover o sobrenadante utilizando um aspirador. Adicionar 5 ml de DPBS e misture bem. Centrifugar a 121g durante 5 min.
9. Aspirar o sobrenadante e re-suspender o sedimento de células por adição de 6 ml de meio.
10. Em uma placa de 6 poços, adicionar 1 ml da suspensão de células a cada poço, em seguida, adicionar 1 ml de meio. Misturar a suspensão utilizando uma pipeta.
11. Rotular o placa e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO _2.

2A. Detecção de NO com Cell BAEC

1. Técnicas adequadas de assepsia foram seguidos.
2. Remova a placa de 6 poços da incubadora e aspirar o meio a partir do primeiro poço. Lave as células duas vezes com DPBS 1 ml.
3. Adicionar 210 uL de 1,9 mM de sulfato de ferro hepta-hidratado (II) (FeSO ₄ .7 _H2O, preparar recentemente por dissolução de 0,8 mg em1 ml com DPBS _CaCl2 e _MgCl2) e uL 210 de amónio de N-metil-D-glucamina ditiocarbamato (DGM, preparar recentemente por dissolução de 2,7 mg em 500 ul com DPBS _CaCl2 e MgCl ₂₎ utilizando um rácio de 1:7 . (Nota:. Este rácio onde MGD excesso é usado tem sido convencionalmente empregue para a preparação de Fe ^{2 +-MGD} complexa devido ao facto de que o rendimento do Fe ^{3 +-MGD} é maximizada na presença de excesso de MGD A adição de ascorbato em solução para estabilizar o Fe ^{2 +-MGD} não é necessário uma vez que a ^NO-3 Fe ^+-MGD formado é endogenamente reduzido para o EPR ​​detectável NO-Fe ^{2 +-MGD} por ascorbato, hidroquinona, ou cisteína com uma eficiência de conversão de até a 99,9% .. O estado diamagnético baixo spin de Fe ^{2 +} permite a detecção de NO utilizando células plana ou tubo capilar, sem a necessidade de um dispositivo de baixa temperatura) ^15.
4. Swirl a suspensão resultante bem e acrescente 4,6 μl de ionóforo de cálcio (CAI) (preparado a partir de uma solução stock de 1,9 mM por dissolução de 1 mg em 1 ml de DMSO).
5. Solução Agitar o novo e incubar a 37 ° C durante 36 min, a fim de permitir ainda mais redução de NO-Fe ^{3 +-MGD} para o EPR ​​detectável NO-Fe ^{2 +-MGD.}
6. Recolher o sobrenadante (425 ul) em um tubo de Eppendorf e transferência para uma célula de EPR plana (ou para um tubo de 50 uL capilar).
7. Parâmetros de aquisição EPR ​​são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3427 G; modulação de amplitude: 6,0 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 1 x 10 ^5; potência de microondas: 10 mW; número total de verificações: 121; tempo de varredura: 10 s; tempo e constante: 20 ms (Nota: Uma vez que os parâmetros variam de um instrumento e condições experimentais para outro, portanto, apenas o campo de centro, a freqüência ea modulação de amplitude são os parâmetros mais importantes a considerar.).
8. Gravar os espectros à temperatura ambiente e os espectros de 2-D foram integclassificado para reduzir o ruído de fundo ea linha de base corrigido usando Bruker WinEPR software de processamento de dados ou software de processamento de dados. Para a quantificação de formação de aduto, parcelas padrão de concentração versus intensidade de sinal (ou área) pode ser construída usando um SNAP dador NO.

2B. eNOS Experiment Desacoplamento

1. Remova a placa de 6 poços da incubadora e aspirar o meio a partir do segundo poço e lavar duas vezes com DPBS 1 ml.
2. Um doador de peroxinitrito, 5-amino-3-(4-morfolinil) -1,2,3-oxadiazolium cloreto de (SIN-1) foi utilizado para desacoplar eNOS ^16. Adicionar 100 uL de 0,5 mm de SIN-1 (M _r 206,6 g / mol, a partir de 10 mM de solução stock preparada por dissolução de 1 mg de SIN-1 em 500 ul de PBS sem iões Ca / Mg) e diluído para 2 ml com DPBS e 10% de FBS.
3. Incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.
4. Retirar a placa da incubadora e lavar duas vezes com DPBS.
5. Adicionar 210 uL de2,8 mM de FeSO ₄ .7 _H2O e 210 uL de 19,6 mM MGD recém-preparado de acordo com o procedimento acima mencionado.
6. Solução redemoinho e adicionar 4,6 ul de 1,9 mM CAI.
7. Solução Agitar o novo e incubar a 37 ° C durante 36 min.
8. Recolher o sobrenadante (425 ul) em um tubo de Eppendorf e transferência para uma célula de EPR plana.
9. Parâmetros de aquisição EPR ​​são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3427 G; modulação de amplitude: 6 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 1 x 10 ^5; potência de microondas: 10 mW; número total de verificações: 121; tempo de varrimento: 10 s; e constante de tempo: de 20 ms.
10. Gravar os espectros e os espectros de 2-D foram integradas para reduzir o ruído de fundo e de linha de base corrigido como mencionado acima.

3. Detecção de O ₂ • - a partir de neutrófilos polimorfonucleares (PMNs)

1. Os neutrófilos foram isolados a partir de amostra de sangue humano, como descrito anteriormente ¹⁷.
2. Fazer uma solução stock de 1 M DMPO * em PBS contendo 0,1 mM de dietilenotriamina-pentacético ácido (DTPA). DMPO tem um ponto de fusão de 25-29 ° C por isso é mais conveniente para pipetar DMPO líquido (densidade ~ 1,02 g / ml a 25 ° C) para um frasco de vidro (Nota: não utilizar frascos de plástico para a pesagem de desde DMPO puro reage com plástico). Congelado DMPO pode ser derretido, executando água morna para o frasco (Nota: não correr água quente como DMPO pode se decompor).
3. É importante a utilização de elevada pureza DMPO (> 99%) desde algumas das armadilhas de spin comercialmente disponíveis contêm impurezas paramagnéticas, e portanto, é imperativo para executar espectro EPR de apenas a solução DMPO por si só (10 mM, neste caso). É crítico que nenhum sinal de fundo é evidente (ver Figura 3A).
4. Preparar solução de reserva (1 mg / ml) de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) em DMSO. Fazer alíquotas por diluição da solução a 10 ug / ml em PBS.
5. Em um 1.5 ml tubo Eppendorf, preparar uma solução com um volume total de 0,6 ml, seguindo a sequência da adição: ~ 10 ⁶ células por ml de PMN, D-glucose (1 mg / ml) e albumina (1 mg / ml), 10 mM DMPO e 0,2 ug / ml de PMA. (Nota: PMA é o activador de radicais e deve ser adicionado por último).
6. Transferir a solução para uma célula de EPR plana.
7. Parâmetros de EPR condições de aquisição são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3486 G; modulação de amplitude: 0,5 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 5 x 10 ^5; número total de exames: 10; tempo de varredura: 30 s ; potência de microondas: 20 mW; e constante de tempo: ms 81. Para a quantificação de formação de aduto, parcelas padrão de concentração versus intensidade de sinal (ou área) pode ser construída usando os nitróxidos estáveis, tais como TEMPO ou 3-carboxílico-PROXYL.

* Nota importante sobre a utilização de DMPO: Ao utilizar uma célula plana, pode-se aumentar a densidade de células, e assim aumentar o sinalintensidade do aducto de rotação, mas a meia-vida de O ₂ • - aducto de DMPO é curto (t _1/2 ~ 1 min), que se decompõe para DMPO-OH. DMPO podem ser substituídos usando as mesmas concentrações de Empo, BMPO ou DEPMPO que estão disponíveis comercialmente para a estabilidade aumentada aducto com t _1/2 ~ 8 e 14 min, respectivamente.

4. Os resultados representativos

Girar aprisionamento de NO radical foi realizada utilizando Fe ^{2 +-MGD} 2A. Figura e 2B mostram nenhum sinal EPR de Fe ^{2 +-MGD} ou mistura de Fe ^{2 +-MGD} com a CAI, indicando que nenhum sinal de fundo NO origina a partir destes reagentes. BAEC após estimulação com a CAI, que liberta NO reage com o Fe ^{2 +-MGD} para formar o aducto de rotação, NO-Fe ^{2 +-MGD,} e mostra um sinal tripleto característica com valor hiperfina separação (hfsc) constante de uma _N = 12,66 G e fator g de g = 2,040. (Figura 2C). O hfvalor sc foi determinada utilizando o programa de simulação WINSIM que pode ser baixado do site NIEHS Banco de Dados Software EPR. O hfsc experimental é consistente com o valor da literatura de um _N = 12,70 G e G = 2,041 ¹⁸ para o NO ^{Fe-2 +-MGD} aduto. Do mesmo modo, o efeito de SIN-1 em BAEC baixou a produção de NO, devido à eNOS desacoplamento como mostrado na Figura 2D.

DMPO armadilha de spin foi usado para O ₂ • - detecção. DMPO por si só não deu um sinal conforme mostrado nas Figuras 3A e confirmação de que a armadilha de rotação é livre de impurezas paramagnéticas. A Figura 3B é o espectro de DMPO e PMNs apenas, e da mesma forma, não há sinal detectável, sugerindo que o DMPO não causar activação do NADPH oxidase enzima. A Figura 3C mostra o sinal observado EPR ​​após estimulação de PMN por PMA. Os valores hfsc para este sinal foram determinados como sendo um _N = 14,71 G, um _ebeta-H = 11,40 G e uma _γ-H = 1,25 G, e são consistentes com os valores na literatura de um _N = 14,3 G, uma _β-H = 11,7 G e uma _γ-H = 1,3 G ¹⁹ para DMPO-ó ₂ aducto H.

Figura 1. Fluxograma para a detecção de radicais a partir de neutrófilos e BAEC utilizando armadilhas de spin de EPR. (A) PMNs foram misturados com DMPO e PMA, ea mistura resultante transferida para uma célula de EPR plana para aquisição de dados. (B) BAEC foram cultivadas numa placa, e lavou-se com DPBS. A rotação armadilha Fe (MGD) ₂ foi adicionado juntamente com CAI. A solução foi misturada cuidadosamente e incubados. A mistura foi transferida para uma célula de EPR plana para a EPR aquisição de dados.

Figura 2. Detecção EPR ​​de NO a partir de BAEC. (A) Espectro de Fe ^{2 +-MGD} apenas (B) Espectro de Fe ^{2 +-MGD} + CAI só. (C) Espectro de Triplet resultante a partir do NO aprisionamento por Fe ^{2 +-MGD} usando CAI-estimulado células. (D) Espectro mostrando diminuição da produção de NO devido a 0,5 mM SIN-1 o tratamento de células.

Figura 3. Detecção EPR ​​de H ₂ DMPO-O a partir de neutrófilos activados. (A) Espectro de 10 mM DMPO só. (B) Espectro de PMN sozinho na presença de 10 DMPO mM. (C) Espectro de PMN activado por PMA, na presença de 10 DMPO mM.

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Discussão

EPR aprisionamento de rotação tem sido empregada em uma ampla variedade de aplicações biomédicas para quantificar e identificar os radicais livres. Aprisionamento de rotação é altamente sensível, capaz de detectar os radicais em concentrações que variam de nM a iM, tornando-o adequado para aplicação em sistemas biológicos. A formação do aduto paramagnético, NO-Fe ^{2 +-MGD,} é a base de NO a detecção através de EPR. Fe ^{2 +-MGD} reage com NO rapidamente ¹⁸ a uma ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Fenol meio DMEM livre Alta glicose 1X	GIBCO	31053
0,25% de tripsina-EDTA	GIBCO	25200
L-Glutamina	Fisher Scientific	BP379-100
MEM aminoácidos não essenciais	GIBCO	11140
Soro fetal de bovino	Atlanta Biologicals	S11550
Factor de crescimento endotelial	Millipore	02-102
CAI	Enzo Ciências da Vida	A-23187	Dissolve-se em DMSO
SIN-1	Enzo Ciências da Vida	BML-CN245-0020
DMPO	Dojindo Laboratories	D048-10
FeSO 4 .7 H 2 O	Sigma Aldrich	215.422-250G	Dissolve-se em PBS com Ca e Mg
MGD	Enzo Ciências da Vida	ALX-400-014-M050	Dissolve-se em PBS com Ca 2 + e Mg 2 +
Células BAEC	Cell Systems	2B2-C75
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
DPBS com CaCl2 e MgCl 2	Sigma Aldrich	D8662
Forbol miristato-acetato (PMA)	Sigma Aldrich	79346-1mg